Review - Blood Transfusion · 2015. 11. 26. · Il problema della compatibilità pretrasfusionale...

18 Blood Transf 2003; 1: 18-40

The contribution of molecular diagnosisto erythrocyte immunohaematology, with particular regardto null phenotypes

GianLodovico Molaro, Giorgio Reali

Pordenone, Genova

Review

Prof. Giorgio Realic/o IBMDRVia Volta 19/516128 GenovaItaly

Per lungo tempo, dopo la scoperta del sistemaABO agli inizi del secolo scorso e l'avvio della terapiatrasfusionale, gli antigeni gruppoematici eritrocitarisono stati considerati come una caratteristica diinteresse unicamente siero-immunologico, importantesolo ai fini della trasfusione e delle indaginiimmunoematologiche, ma senza significato sul pianodella pratica clinica come espressione di malattiespecifiche. Tale convinzione si dimostrò superatadalle osservazioni, sempre più numerose, compiutenei successivi decenni dagli immunoematologi circal'esistenza di soggetti portatori di varianti dei fenotipieritrocitari più comunemente riscontrati nellepopolazioni e, in particolare, di quelli che sono statidenominati, seguendo un suggerimento verbale diCeppellini a Levine, null (o, anche, minus-minus osilenti). Si tratta, come è ben noto, di fenotipicaratterizzati dall'assenza sulle emazie di tutti gliantigeni "propri" di un determinato sistemagruppoematico1,2. Il fatto che i portatori di questeparticolari varianti fenotipiche riguardanti alcunisistemi presentavano anomalie morfologiche efunzionali delle emazie, talvolta accompagnate dadisturbi organici clinicamente evidenti, era un motivoper suggerire l'esistenza di un rapporto fra i gruppisanguigni e le malattie e, quindi, per stimolare glistudiosi a chiarirne gli aspetti.

Così, agli immunoematologi si sono affiancati ibiologi molecolari ed i biochimici negli studi in gradodi delucidare la composizione chimica dellecomponenti la membrana dell'eritrocita, cherisultavano essere associate alle proprietà antigenichegruppoematiche, valutando, nel contempo, anche illoro ruolo funzionale nella biologia dell'emazia3,4.

L'avvento negli ultimi due decenni delle metodiche

For many years after the discovery of the ABOsystem at the beginning of the last century and thestart of transfusion therapy, the erythrocyte bloodgroup antigens were considered of interest uniquelyin sero-immunology, important only for transfusionmatches and immunohaematological investigations,but lacking any practical, clinical significance as anexpression of specific diseases.

This belief was overturned by the increasingnumber of observations made byimmunohaematologists in the following decades.

It was seen that some subjects carried variantsof the red cell phenotypes most commonly found inthe population and, in particular, some subjects wereidentified with null phenotypes (a widely usednomenclature suggested by Ceppellini to Levine),otherwise known as minus-minus or silentphenotypes.

As is well-known, in these phenotypes the redblood cells lack all the antigens of a given bloodgroup system1,2.

The fact that carriers of phenotypic variants ofsome particular systems had morphological andfunctional abnormalities of the erythrocytes,sometimes accompanied by clinically obviousorganic disorders, suggested that there was aconnection between the blood groups and thediseases, thus stimulating researchers to clarify theserelationships.

Thus the biochemists and molecular biologists

19Blood Transf 2003; 1: 18-40

di biologia molecolare per lo studio diretto dei genie delle loro anomalie, utilizzando le tecnichedell'amplificazione genica mediante la polymerasechain reaction (PCR), la clonazione, la trasfezionedei geni, e lo studio delle sequenze del DNA genico,ha offerto e continua ad offrire non soltanto lapossibilità di meglio precisare i rapporti esistenti trail fenotipo eritrocitario e il rispettivo genotipo, maanche di dimostrare come alcuni aspetti dellapatologia umana dipendano da varianti alleliche, aloro volta derivate da mutazioni dei geni responsabilidella comparsa di particolari fenotipi eritrocitari5,6.

Questa rassegna si propone appunto di presentarei contributi apportati dalle più recenti ricerche dibiologia molecolare compiute nell'ambitodell'immunoematologia eritrocitaria perl'identificazione e l'analisi delle anomalie dei geni, chesono alla base delle varianti fenotipiche più rare edei fenotipi null.

Sarà esposto anche l'aspetto riguardante l'impiegodelle metodiche di studio della biologia molecolarenel campo delle indagini immunoematologiche,metodiche che si sono rivelate utili per superare ilimiti delle tradizionali tecniche di agglutinazione,diretta od indiretta, in fase liquida, solida o sucolonna, a causa della loro ridotta sensibilità especificità o complessità di esecuzione 5,6.

L'impiego delle analisi di genetica molecolarein immunoematologia

L'applicazione più frequentemente citata edutilizzata della biologia molecolare inimmunoematologia eritrocitaria riguarda ladeterminazione del fenotipo e/o genotipo del feto incorso di gravidanza, utilizzando le cellule del liquidoamniotico, dei villi coriali o del trofoblasto o, ancora,le cellule fetali presenti nel circolo sanguigno dei madriimmunizzate (in genere Rh-negative con anticorpi anti-D) per stabilire se il figlio è portatore dell'antigeneverso cui è diretto l'anticorpo materno.

Inoltre, nei soggetti recentemente sottoposti aduna trasfusione massiva oppure a una terapiatrasfusionale cronica, l'analisi del DNA nei campionidel sangue periferico consente di stabilire il genotipodel ricevente e di superare, in presenza di unmicrochimerismo post-trasfusionale, le incertezze chederivano dalle indagini praticate con l'impiego delleconvenzionali tecniche di emoagglutinazione.

Molecular diagnosis of null erythrocyte phenotypes

joined the immunohaematologists in studies aimedat elucidating the chemical composition of thecomponents of the red cell membrane, which hadbeen found to be associated with the antigenicproperties of the red blood cell groups. At the sametime their functional role in the biology of blood wasevaluated3,4.

Over the last two decades, the development ofmolecular biology methods capable of studyinggenes and their abnormalities directly, using geneamplification techniques with polymerase chainreaction (PCR), cloning, gene transfection and DNAsequencing, has allowed more precise definition ofthe relationships between erythrocyte phenotypesand genotypes, and has also demonstrated how someaspects of human pathology depend on allelicvariants, in their turn derived from mutations in thegenes responsible for particular red cellphenotypes5,6.

This review presents the contributions made bythe most recent molecular research in red cellimmunology, identifying and analysing the geneticabnormalities that underlie the rarer phenotypicvariants and the null phenotypes.

The various molecular biology techniques usedin the field of immunohaematology will also bepresented. These methods overcome the limitationsof low sensitivity and specificity or complexity ofperformance associated with the traditionaltechniques of direct or indirect agglutination, in liquidphase, solid phase or on column5,6.

Molecular genetic analyses inimmmunohaematology

The most frequently cited and used applicationof molecular biology in red blood cell immunologyis the determination of the phenotype and/or genotypeof a foetus during a pregnancy. This is done usingcells from the amniotic fluid, chorionic villus, ortrophoblast or even foetal cells circulating in the bloodof immunised mothers (usually Rh-negative with anti-D antibodies) and establishes whether the foetuscarries the antigen against which the mother hasantibodies.

In addition, the analysis of DNA in samples ofperipheral blood from a patient who has recentlyreceived massive transfusions or chronictransfusional therapy allows the recipient's genotype

20

GL Molaro, G Reali

Blood Transf 2003; 1: 18-40

L'accertamento del genotipo eritrocitario èimportante non soltanto nelle suddette situazioni, maanche nei casi di anemia emolitica autoimmune, perla ricerca di emazie fenotipicamente identiche dautilizzare nelle tecniche di assorbimento degliautoanticorpi6-10.

Il problema della compatibilità pretrasfusionalein portatori di particolari varianti fenotipiche, come,ad esempio, in soggetti Fy(a-b-) non africani (néafroamericani), è un'altra importante applicazionedella diagnostica molecolare. Al riguardo, Olsson etal.11 hanno utilizzato un metodo di indagine del DNAgenico di pratica applicazione per lo studio dei tremaggiori alleli al locus del gene FY del sistema Duffy(Fya, Fyb, Fy): la dimostrazione delle varianti allelichedei geni che codificano per gli antigeni di questosistema consente di risolvere il problema dellacompatibilità pretrasfusionale nei portatori delsuddetto fenotipo quando vanno incontro adalloimmunizzazione.

Dai più recenti studi di analisi di geneticamolecolare è emerso il dato del frequente riscontrodi situazioni nelle quali l'espressione degli antigenisulle emazie, cioè il fenotipo sierologicamentedeterminato, non corrisponde ai risultati delle indaginimolecolari sul gene. Le cause di questa situazionesono principalmente congenite, ma possono essereanche acquisite. Tra le forme congenite vi sono quelledei particolari fenotipi con l'antigene D "parziale" (oD "mosaico" o D variant) oppure con il D "debole"(weak D, un tempo denominato Du), nell'ambito delsistema Rh12, 13.

Con l'analisi del DNA genico è possibiledistinguere i fenotipi con una debole espressione delcomplesso antigenico Rh da quelli la cui ridottaespressione è dovuta invece a un D "parziale": solo isoggetti con il primo fenotipo non sono esposti alrischio di un'alloimmunizzazione post-trasfusionaleo gravidica; gli altri invece lo sono.

È stato, per esempio, osservato che un terzocirca dei soggetti Rh-negativi possiede un gene RHDintatto, ma inattivo6 e che la maggior parte deisoggetti Africani e approssimativamente un quartodegli afroamericani D-negativi è portatore di un"pseudogene" RHD non funzionante (denominatoRHDΨ), con un 15% che possiede geni ibridi RHD-CE-D14 (in associazione con un fenotipo VS+ V-)e con soltanto un 18% totalmente privo del geneRHD. Sono osservazioni in contrasto con quantoavviene negli Europei, nei quali il fenotipo D-

to be determined. This overcomes the uncertaintiesarising from investigations using conventionalhaemagglutination techniques when post-transfusional microchimaerism is present.

Nevertheless, determining the red blood cell(RBC) genotype is important in other situationsbesides those described above; for example in casesof autoimmune haemolytic anaemia, and in theresearch for phenotypically identical blood to usein autoantibody absorption techniques6-10.

The problem of pre-transfusional compatibilityin carriers of particular phenotypic variants, forexample non-African (and non-Afro-Americans)Fy(a-b-) subjects, is another important applicationof molecular diagnosis.

In this context, Olsson et al.11 used a practicalapplication of DNA analysis to study the three majoralleles at the locus of the FY gene of the Duffy system(Fya, Fyb, Fy): the demonstration of the allelic variantsof the genes coding for the antigens of this systemallowed resolution of the problem of pretransfusionalcompatibility in carriers of this phenotype when theydevelop alloimmunisation.

The most recent molecular genetic studies haverevealed that the antigen expression on blood cells,that is, the serologically determined phenotype,frequently does not correspond with the results ofthe molecular investigations of the gene.

The causes of this are mainly congenital, but canalso be acquired. The congenital forms include theparticular phenotypes with partial antigen D (ormosaic D or variant D) or with weak D (once calledDu), in the Rh system12, 13.

DNA analysis can distinguish betweenphenotypes with weak expression of the Rh antigencomplex and those in which the reduced expressionis due to a "partial" D: only subjects with the formerphenotype are not at risk of post-transfusional orgestational alloimmunisation; the latter, on the otherhand, are at risk.

For example, it has been seen that about one thirdof Rh-negative people have an intact, but inactiveRHD gene6 and that most Africans and about onequarter of Afro-Americans who are D-negative carrya non-functional RHD "pseudogene" (namedRHDΨ), 15% have hybrid RHD-CE-D genes14 (inassociation with a VS+ V- phenotype) and only in18% is the RHD gene completely absent.

These findings are different from those inEuropeans, among whom the D-negative phenotype,

21

negativo, salvo rarissime eccezioni, è associato auna delezione dell'intero gene RHD.

Un test di biologia molecolare basato sull'impiegodella PCR è quello recentemente proposto da Finninget al15 da impiegare per la determinazione dell'antigeneRhD del feto, rinvenibile nel plasma delle donnegravide con alloimmunizzazione anti-D. I vantaggidel test sono: possedere un'accuratezza del 100%,essere un'indagine "real time", evitare le complicanzedelle procedure invasive praticate per ottenere lecellule fetali del liquido amniotico e dei villi coriali e,infine, nei soggetti di razza nera, evitare il rischio diun falso risultato positivo dovuto allo "pseudogene"RHD inattivo (RHDΨ). Da ciò, l'importanza dimigliorare la sensibilità delle tecniche dideterminazione del gene RHD, per eliminare, o ridurreal minimo, l'evenienza anche di falsi risultati negativi16.Di origine acquisita sono invece le discrepanze tra ladeterminazione del genotipo e l'espressione degliantigeni sulle emazie, che possono essere osservatenei pazienti affetti da malattie linfoproliferative.

Nella Tabella I sono elencate le applicazioni sopraricordate dell'analisi del DNA genico in MedicinaTrasfusionale e in altri tipi di studio.

L'apporto della diagnostica molecolare allostudio dei fenotipi null

Dall'insieme degli studi di biologia molecolaresinora condotti per analizzare gli eventi checonducono alla formazione delle varianti genicheresponsabili della produzione dei fenotipi abnormie, in particolare, di quelle che sono alla base deifenotipi null, è emerso che le alterazioni molecolaridel DNA possono essere diverse e, talvolta, esserepresenti insieme nello stesso gene.

Le anomalie riscontrate comprendono la delezionetotale o parziale di un gene e mutazioni di vario tipo,



apart from very rare exceptions, is associated withdeletion of the whole RHD gene. Finning et al15

recently proposed a PCR-based molecular biologytest to identify foetal RhD antigen, which can befound in the plasma of pregnant women with anti-Dalloimmunisation.

The advantages of this test are: 100% accuracy,an investigation with results available in "real time",and avoidance of the complications of invasiveprocedures used to obtain foetal cells from amnioticfluid or chorionic villa; furthermore, it avoids therisk of a false positive result due to the inactive RHD"psuedogene" (RHDΨ) in Blacks. It is clear that it isimportant to improve the sensitivity of techniquesfor determining the RHD gene in order to eliminateor, at least, minimise the false negative results16.

In contrast, the differences between genotype andblood cell antigen expression that can be found inpatients with lymphoproliferative diseases areacquired phenomena.

Table I lists the applications of genetic DNAanalysis in Transfusion Medicine; it includes the usesdescribed above and some others

The contribution of molecular diagnosis tothe study of null phenotypes

The molecular biology studies so far carried outto analyse the events leading to formation of genevariants responsible for producing abnormalphenotypes and, in particular, null phenotypes, haveshown that different molecular alterations of DNAcan occur and these may sometimes be presenttogether in the same gene.

The abnormalities include total or partial deletionof a gene and various types of mutation: 1)substitution of a single nucleotide in the DNA genesequence (missense mutations), 2) the so-called

Table I - Clinical applications of genetic DNA analysis for determining blood group antigens

- Typing patients who have recently received massive or continuous transfusions- Identification of a foetus at risk of haemolytic disease of the newborn- Typing patients with RBCs covered by antibody immunoglobulins- Typing in cases of antigens "weakly" or "partially" expressed on blood- Determination of the state of homozygosity for the RHD gene- Resolution of discrepancies concerning ABO and Rh blood groups- Mass screening of blood donors negative for an antigen- Determination of the origin of circulating white cells in recipients of haematopoietic stem cell transplants- Investigations in cases of contested paternity or forensic studies.

22

costituite da: 1) il cambiamento di un singolonucleotide della sequenza del DNA genico (mutazionimissense), 2) le cosiddette frame shift, dovute aduna delezione o a una inserzione di un singolonucleotide con conseguente slittamento del modulodi lettura e della trascrizione nel RNA messaggero(mutazione nonsense) e 3) il cambiamento deinucleotidi che provoca la formazione di un diversostop codon con conseguente riduzione della lunghezzadella catena amminoacidica della proteina prodotta.Un fenotipo null (compreso, nel caso dei geni Rh, ilfenotipo Rh

mod) può essere dovuto anche all'azione

di altri geni che condizionano la funzione dei geni incausa nei fenotipi abnormi, esercitando su questiun'azione inibitoria o soppressoria.

In altri casi, ancora, intervengono alterateinterazioni tra le proteine integrali della membranaeritrocitaria e il loro legame con il citoscheletro6.

In via preliminare va anche precisato che soltantoin una parte dei soggetti portatori dei singoli fenotipinull è dimostrabile la presenza di alterazionimorfologiche e funzionali delle emazie, chedeterminano o meno ripercussioni sulle lorocondizioni di salute, con comparsa di sintomatologiaclinica. Ciò si osserva solamente in quei soggetti neiquali il fenotipo null riguarda gli antigeni che sonoassociati alle diverse glicoproteine della membranaeritrocitaria e, specialmente, a quelle che si legano alcitoscheletro della cellula: ne è un esempio tipico laRh deficiency syndrome17.

Quando invece la specificità dei determinantiantigenici mancanti è legata ad uno zuccheroimmunodominante delle molecole delle glicoproteinee dei glicolipidi che sono sistemati nel glicocalice esporgono dalla membrana, non compaiono alterazionimorfologiche e funzionali delle emazie o particolaridisturbi clinici. È il caso dei seguenti fenotipi: ilBombay (O

h) del sistema ABO, il Tj(a-) o p del

sistema P, l'I-negativo/i-negativo della Collection I/i,l'M kMk del sistema MNS, il Le(a-b-) del sistemaLewis o il Pk della collection GLOBE, che si deveconsiderare come un fenotipo solo parzialmentesilente1.

La Rh deficiency syndrome

Il termine è comprensivo di due entità cliniche traloro simili, anche se non identiche, che compaiononei soggetti portatori rispettivamente dei fenotipi Rh

null

ed Rh mod

(da modified).


GL Molaro, G Reali

frame shift mutations, due to a deletion or an insertionof a single nucleotide with consequent shifting ofthe reading and transcription frame of the messengerRNA (nonsense mutation) and 3) a change ofnucleotides which form a different stop codon thusreducing the length of the amino acid chain of theprotein produced.

A null phenotype (including, in the case of theRh genes, the Rh

mod phenotype) may also be due to

the action of other genes which inhibit or suppressthe genes in the abnormal phenotypes. In yet othercases, interactions between transmembrane proteinsof the red blood cell and their binding with thecytoskeleton are altered6.

A preliminary mention should be made of the factthat only some carriers of single null phenotypesshow morphological and functional alterations of theblood, which may or may not have repercussionson their health with the onset of clinical symptoms.

This is seen in subjects whose null phenotypeconcerns antigens which are associated with variousglycoproteins of the red blood cell membrane,particularly those that bind to the cytoskeleton ofthe cell: a typical example is Rh deficiencysyndrome17.

In contrast, when the specificity of the missingantigenic determinants is linked to animmunodominant sugar of the gylcoproteins andglycolipids that are arranged in the glycocalyx andprotrude from the membrane, morphological orfunctional alterations of the red blood cells orparticular clinical disorders do not occur.

This is the case for the following phenotypes:Bombay (O

h) of the ABO system; Tj(a-) or p of the

P system; I-negative, i-negative of the I/i collection;MkMk of the MNS system; Le(a-b-) of the Lewissystem or Pk of the GLOBE collection. All shouldbe considered as an only partially silent phenotype1.

The Rh deficiency syndrome

This term includes two clinically similar, but notidentical, entities that appear in subjects who havethe Rh

null or Rh

mod (from modified) phenotype.

In order to be able to understand these twophenotypes, some information must be given (albeitin a very concise form) on the genetic and biochemicalnature of the Rh antigens.

The Rh antigenic complex is associated with 2palmitolate membrane proteins, which are similar to

23

Per un corretto inquadramento di questi duefenotipi è necessario fornire alcune nozioni (sia purmolto sintetiche) suIla genetica e sulla naturabiochimica degli antigeni Rh.

Il complesso antigenico Rh è associato a 2proteine palmitolate della membrana, tra loro assaisimili, costituite da 417 aminoacidi con sequenzeomologhe al 92% e di peso molecolare compresofra 30 e 32 kilodalton. A una di esse è associatol'antigene polipeptidico D e, all'altra, gli antigeni dellaserie "CE" nelle quattro diverse combinazioni: Ce,cE, ce, CE12,17,18. Va ricordato che la nomenclaturanumerica conta, oggi, 52 differenti antigeni Rh, anchese 7 di essi sono da considerarsi "obsoleti"

I rispettivi geni che ne codificano la produzione,l'RHD e l'RHCE, sono localizzati sul braccio cortodel cromosoma 1, in posizione p36.13-p34, con unadistribuzione su 75 kb del DNA, presentando traloro un'omologia strutturale. Il primo esprime laproteina che porta l'antigene D, il secondo gli altriantigeni del sistema Rh12,17,18.

I soggetti con i fenotipi Rhnull

regolatore ed Rhmod

,oltre alla totale assenza o alla ridottissima espressionedelle due proteine, sono carenti (o portatori di unaquantità estremamente ridotta) di una glicoproteinadella membrana, che è normalmente legata, inmaniera non covalente, al polipeptide Rh: si trattadella proteina RhAG (Rh-associated glycoprotein),codificata da un gene (RHAG) situato sul bracciocorto del cromosoma 6, in posizione p21.11, di 45-100 kilodalton e conosciuta anche come proteinaRh50 (anche se tale denominazione è chiaramenteambigua, dato che con Rh50 si identifica, nellanomenclatura numerica, l'antigene a bassissimafrequenza PFTT, presente in una nuova categoria disoggetti "D parziali", la categoria DFR)18.

La sua sequenza amminoacidica ha un'omologia,approssimativamente per il 40%, con la glicoproteinaRh, formando con essa la "Rh protein family", manon risulta essere portatrice di proprietà antigenichespecifiche.

Sono assenti, o variamente ridotte, nei due fenotipidella Rh deficiency syndrome anche altreglicoproteine della membrana che risultano associateal polipeptide Rh e che formano il gruppo dellecosiddette Rh accessory glycoproteins. Questogruppo comprende le glicoproteine dei determinantiantigenici LW, la CD47 (Integrin-associated protein,IAP), la glicoforina B (GPB), la glicoproteina FY(relativamente all'antigene Fy5) e la banda 312, 17, 18.



each other, made of 417 aminoacids with a sequencehomology of 92% and a molecular weight between30 and 32 kilodaltons. The polypeptide D antigen isassociated with one of these membrane proteins andthe "CE" antigen series, in four differentcombinations, Ce, cE, ce, CE, is associated withthe other12,17,18. So far, 52 Rh antigens have beenassigned a number, although 7 of these are nowconsidered "obsolete".

The respective genes coding for their production,RHD and RHCE, have structural homology and arelocated on the short arm of chromosome 1, inposition p36.13-p34, spanning 75 kb of DNA. RHDexpresses the protein that carries the D antigen, whileRHCE expressed the other antigens of the Rhsystem12,17,18.

Subjects with the regulator Rhnull

and Rhmod

phenotypes, besides having a total lack or extremelyreduced expression of the two proteins, also lack(or carry an extremely small amount) a membraneglycoprotein that is normally bound non-covalentlyto the Rh polypeptide: this is the RhAG (Rh-associated glycoprotein), coded for by a gene(RHAG) located on the short arm of chromosome6, in position p21.11.

RhAG has a molecular weight of 45-100kilodalton and is also known as protein Rh50(although this name is very ambiguous given that, inthe numerical nomenclature, Rh50 identifies the verylow frequency PFTT antigen present in a newcategory of "partial D" subjects, the DFRcategory)18.

Although the aminoacid sequence of RhAG hasapproximately 40% homology with the Rhglycoprotein, and with this latter forms the "Rhprotein family", RhAG does not seem to havespecific antigenic properties.

Other membrane glycoproteins associated withRh polypeptide, which form the group of so-calledRh accessory glycoproteins, are also absent orvariably reduced in the two phenotypes of Rhdeficiency syndrome. This group includes theglycoproteins of the LW antigenic determinants,CD47 (Integrin-associated protein, IAP),glycophorin B (GPB), glycoprotein FY (antigen Fy5)and band 312, 17, 18.

The function of the whole complex of the "Rhprotein family" is not yet sufficiently clear andfurther studies are necessary to determine whetherthe whole complex plays a role in the transport of

24

La funzione di tutto il complesso della "Rh proteinfamily" non è stata ancora sufficientemente chiaritae sono necessari ulteriori studi per accertare se l'interocomplesso svolga un ruolo nel trasporto degli ioniNH

4 o di altri cationi attraverso la membrana, come

suggerito da osservazioni in campo animale. È stataanche avanzata l'ipotesi che i polipeptidi Rh possanoessere coinvolti nel mantenimento della simmetria deifosfolipidi sulla membrana agendo come enzimi("flippasi" e "floppasi") nello scambio dei fosfolipidi(flip-flop) tra gli strati interno ed esterno dellamembrana3, 12.

Per quanto riguarda il meccanismo di formazionedel fenotipo Rh

null, è ampiamente noto che esso è

duplice. Mentre in alcuni soggetti è dovuto all'azionedi un gene regolatore o soppressore situato su unlocus diverso da quello dei geni che codificano perle proteine Rh (vedi avanti), in altri, invece, èriconducibile alla presenza di un gene amorfo situatosullo stesso locus RH.

Le anomalie dei geni responsabili riscontrate inqueste due situazioni sono differenti. Per quantoriguarda la prima, vi sono osservazioni, compiute indue soggetti con il fenotipo Rh

null, portatori di geni

RHD ed RHCE normalmente funzionanti, chedimostrano come sia coinvolto il gene RHAG per lapresenza di una delezione o di una sostituzione di unsingolo nucleotide (mutazione missense)19,20. In altreosservazioni esiste una doppia mutazione, sempredel gene RHAG, con normali sequenze e trascrittidei geni RHD ed RHCE21.

Nel fenotipo Rhnull

da gene amorfo l'anomaliariscontrata in due individui, non consanguinei, prividel gene RHD, con normale trascrizione e funzionedei geni RHAG e CD47, era costituita da duemutazioni del gene RHCE (sostituzione del nucleotideguanina con timina o sostituzione della sequenzatimina-citosina-adenina con citosina): l'effetto diqueste mutazioni era la creazione di una proteina piùcorta, organizzata in 10 anziché negli usuali 12domini22. In altri casi, invece, le anomalie riscontrateerano costituite da doppie mutazioni checomportavano una vasta delezione nell'unico geneRHCE presente in soggetti D-negativi23. Le alterazionidelle proteine della membrana eritrocitaria, cheentrano a far parte del complesso Rh, si traducono,nel fenotipo null, in un difetto delle proprietàreologiche della cellula, tali da provocare una suaprecoce distruzione in circolo, con tutto il quadrosintomatologico di una sindrome emolitica più o


GL Molaro, G Reali

NH4 ions or other cations across the cell membrane,

as suggested by animal studies. It has also beenhypothesised that the Rh polypeptides could beinvolved in maintaining the symmetry of membranephospholipids, acting as enzymes ("flippases" and"floppases") in phospholipid switching (flip-flop)between the internal and external layers of themembrane3,12.

It is well know that there are two mechanismsthat produce the Rh

null phenotype: in some subjects

the phenotype is due to a regulatory or suppressorgene on a locus other than that of the genes codingfor the Rh proteins (see later), whereas in others it iscaused by an amorph gene in the RH locus itself.

The genetic abnormalities found in these twocases are different. As far as concerns the former,observations in two subjects with the Rh

null

phenotype, carriers of normally functioning RHD andRHCE genes, demonstrate how that the RHAG geneis involved, either by a deletion or by the substitutionof a single nucleotide (missense mutation)19,20. In othercases there is a double mutation, again in the RHAGgene, with normal sequences and transcripts of RHDand RHCE 21.

In the Rhnull

phenotype caused by an amorph gene,the anomaly found in two unrelated individualswithout the RHD gene, but with normal transcriptionand function of the RHAG and CD47 genes, wastwo mutations of the RHCE gene (substitution of aguanine nucleotide by thymine or substitution of thethymine-cytosine-adenosine sequence by cytosine):the effect of these mutations was to create a shorterprotein, organised in 10 rather than the usual 12domains22. In other cases the abnormalities weredouble mutations causing a vast deletion of the onlyRHCE gene present in D-negative subjects23.

The alterations in the red cell membrane proteinsthat form part of the Rh complex translate, in thenull phenotype, into a defect in the rheologicalproperties of the cell, causing premature celldestruction in the circulation and thus all thesymptoms of a more or less compensated, chronichaemolytic syndrome.

The characteristic signs of such a situation are:the presence of stomatocytes and spherocytes withincreased osmotic fragility, abnormal transport ofcations across the cell membrane and anomalousorganisation of phospholipids in the membrane itself,together with the known biohumoural alterationssecondary to red cell destruction1,2.

25

meno compensata, ad andamento cronico. I segnitipici di questa situazione sono: la presenza di emaziestomatocitiche e sferocitiche con un aumento dellaloro fragilità osmotica, anormale trasporto dei cationiattraverso la membrana cellulare e un'organizzazioneabnorme dei fosfolipidi nella membrana stessa,insieme con le note alterazioni bioumoralidell'eritrodistruzione1,2.

Il fenotipo Rhmod,

di frequenza ancora più rararispetto al precedente, è caratterizzato da una marcatadepressione di tutti gli antigeni del sistema Rh. Ildifetto appare controllato da un gene autosomicoad azione soppressiva, che segregaindipendentemente da quelli Rh, in analogia conquanto avviene nel fenotipo Rh

null di tipo regolatore.

Da alcuni studi risulta che anche nel fenotipoRh

mod le anomalie geniche sono costituite da singoli

scambi nucleotidici, che inducono modestemutazioni a livello del gene RHAG mentre ilpolipeptide Rh risulta normale19. Anche in una famigliastudiata più recentemente da Huang et al24 il geneanomalo era l'RHAG.

I soggetti con il fenotipo Rhmod

dimostrano unaevidente, anche se non elevata, diminuzionedell'espressività antigenica di ogni determinante Rhposseduto e un quadro ematologico e clinicosostanzialmente simile a quello del Rh

null. Tutti i

soggetti affetti dalla Rh-deficiency syndromepresentano, infatti, le stesse alterazioni morfologichedelle emazie e una condizione di iperemolisi cronica,di solito non grave, ma che, peraltro, in certi casi,può richiedere la splenectomia1, 2.

Il sistema Kell ed i fenotipi Ko (Kellnull) e McLeod

I deteminanti antigenici del sistema Kell(attualmente se ne conoscono 22 sicuri e 3 probabili)sono associati ad un complesso proteico dellamembrana formato da due glicoproteine, denominaterispettivamente Kell ed XK, tra loro riunite da unlegame covalente, che alcuni Autori consideranocome subunità di una singola molecola proteica25.

La prima è una glicoproteina di tipo II formatada 732 amminoacidi con un peso molecolare di 93kilodalton; la seconda di 444 amminoacidi e, secondole determinazioni più recenti, con un peso molecolaredi 50,9 kilodalton26.

Le due glicoproteine sono codificate da due genidiversi: il gene KEL localizzato sul braccio lungodel cromosoma 7 in posizione q33 codifica per la



The Rhmod,

phenotype, which is even rarer thanthe preceding phenotype, shows marked depressionof all the Rh system antigens.

The defect seems to be controlled by anautosomal gene with a suppressive effect, whichsegregates independently of the Rh ones, in analogyto what occurs with the regulatory-type Rh

null

phenotype.Some studies indicate that the genetic

abnormalities in the Rhmod

phenotype are also causedby single nucleotide exchanges, which induce modestmutations in the RHAG gene, while the Rhpolypeptide is normal19. The abnormality was in theRHAG gene also in the family most recently studiedby Huang et al24.

Subjects with the Rhmod

phenotype have anobvious, although not marked, decreasedexpression of all their Rh antigens and theirhaematological and clinical pictures are essentiallysimilar to those of Rh

null subjects.

Indeed, all people with Rh-deficiency syndromehave the same morphological changes in the bloodand a condition of chronic haemolysis, whichalthough not usually severe, can, in some cases,necessitate splenectomy1, 2.

The Kell system and the Ko (Kell

null)

and McLeod phenotypes

The antigenic determinants of the Kell system (22have been identified certainly so far, and there are 3others that are probable) are associated with amembrane protein complex formed of twoglycoproteins named Kell and XK, joined to eachother by a covalent bond which some Authorsconsider as a subunit of a single protein molecule25.

The former is a type II glycoprotein formed by732 aminoacids with a molecular weight of 93kilodalton; the latter is made up of 444 aminoacidsand, according to the most recent determinations,has a molecular weight of 50.9 kilodalton26.

The two glycoproteins are coded for by twodifferent genes: the KEL gene on the long arm ofchromosome 7 in position q33 codes for the formerprotein, while the gene for the production of XK(the XK gene) is located on the short arm ofchromosome X in position p21 (and is, therefore,X-linked)25, 26.

The XK glycoprotein carries the Kx antigen andis very similar to the Rh protein, in that is formed of

26

prima, mentre il gene per la produzione della XK (ilgene XK) è situato sul braccio corto del cromosomaX in posizione p21 (è, cioè, X-linked)25, 26.

La glicoproteina XK porta l'antigene Kx ed è assaisimile alla proteina Rh, in quanto formata da domini(in questo caso in numero di 10) che attraversano lamembrana. La proteina Kell, al contrario, èessenzialmente extracellulare ed è legata allaglicoproteina XK tramite un singolo legamesulfidrilico a livello del quinto occhiello (loop) diquest'ultima proteina.

I comuni fenotipi del sistema Kell dipendonodall'interazione fra questi due geni. La glicoproteinadi membrana XK funge da substrato sul qualeagiscono i diversi geni autosomici del locus KELper la produzione dei vari antigeni del sistema26, 27.

La funzione biologica delle proteine integrali dimembrana Kell ed XK non è stata ancora definitacon sicurezza. Si ritiene che la prima, per la suaomologia con la famiglia delle endopeptidasi zinco-dipendenti e particolarmente con l'enzima endothelin-3-converting enzyme, sia una peptidasi26 (èconsiderata come un enzima ancora in cerca di unsubstrato3). La proteina XK, invece, possiede lecaratteristiche strutturali simili a quelle delle proteinedi trasporto attraverso la membrana: ciò fa ritenereche essa serva a trasportare un neurotrasmettitorenelle cellule nervose assieme agli ioni Na+ e Cl-. Lasequenza amminoacidica della molecola è simile aquella di un trasportatore di glutamati Na+-dipendente27,28. L'osservazione che la glicoproteinaKell è presente sui progenitori della serie cellulareeritroide fa supporre che possa avere un ruoloimportante nelle fasi precoci dell'eritropoiesi30.

La presenza degli stessi disturbi neurologici, fra iquali in particolare la corea, sia nei pazienti con lasindrome di McLeod (vedi avanti) che in quelli affettidalla corea-neuroacantocitosi autosomica recessivaconduce ad avanzare l'ipotesi che siano entrambeforme morbose con una comune patogenesi, legataad un deficit di un neurotrasmettitore nei mammiferi31,

32.Due sono i fenotipi "difettivi" nel sistema: il

fenotipo Ko (o Kell

null) e il fenotipo "McLeod", con

molte somiglianze (peraltro, soltanto dal punto divista delle reazioni sieroIogiche ) con gli analoghifenotipi "difettivi" Rh, nel senso che K

o ricalca le

caratteristiche immunoematologiche dell'Rhnull

e ilMcLeod quelle dell'Rh

mod. I soggetti con il fenotipo

Ko (Kell

null) non presentano particolari sintomi clinici


GL Molaro, G Reali

domains (in this case 10) which cross the membrane.In contrast, the Kell protein is essentially extracellularand is bound to the XK glycoprotein by a singlesulphydrilic bond in the fifth loop of this latter protein.

The common phenotypes of the Kell systemdepend on the interaction between these two genes.The XK membrane glycoprotein acts as a substrateon which the various autosomal genes of the KELlocus act to produce the various antigens of thesystem26, 27.

The biological function of the Kell and XKtransmembrane proteins has not yet been definedwith certainty.

It is thought that the former, because of itshomology with the family of zinc-dependentendopeptidases and particularly with endothelin-3-converting enzyme, is a peptidase26 (it is consideredas an enzyme whose substrate has not beenidentified3).

The XK protein, on the other hand, has structuralcharacteristics similar to those of proteins involvedin transport across the cell membrane: this protein isthought to transport a neurotransmitter into nervecells together with Na+ and Cl- ions. The aminoacidsequence of the molecule is similar to that of atransporter of Na+-dependent glutamates27,28.

The observation that the Kell glycoprotein ispresent in erythroid progenitor cells has led to thesupposition that it may have an important role inearly stages of erythropoiesis30.

The fact that patients with McLeod's syndrome(see later) and those with autosomal recessivechorea-neuroacanthocytosis both have the sameneurological disturbances, including chorea,suggests that the two conditions have the samepathogenetic base, associated with a deficit in amammalian neurotransmitter31, 32.

There are two "defective" phenotypes of thesystem: the K

o (or Kell

null) phenotype and the

"McLeod" phenotype. These have many similarities(even if only from the aspect of serological reactions)with the analogous "defective" Rh phenotypes, inthe sense that the immunohaematologicalcharacteristics of K

o resemble those of Rh

null and

McLeod those of Rhmod

. Subjects with the Ko (Kell

null)

phenotype do not have particular clinical symptomsor morphofunctional changes of the RBCs despitealmost completely lacking all the antigens of thesystem.

They are, however, exposed to the risk of

27

né alterazioni morfologiche e funzionali delle emazie,pur essendo queste totalmente prive di tutti gli antigenidel sistema. Sono, tuttavia, esposti al rischio diun'eventuale alloimmunizzazione antieritrocitariadopo terapie trasfusionali e/o gravidanze, per laformazione di un anticorpo anti-Ku (anti-K5) chereagisce potentemente verso le emazie di tutti icomuni fenotipi Kell. L'antigene Ku (K5) rappresenta,infatti, la sostanza di base, su cui agiscono i geni perdare origine a tutti i differenti fenotipi del sistema.

Eterogenee sono le anomalie genetiche riscontratenei soggetti Kell

null: in alcuni soggetti una mutazione

nonsense33, mutazioni di diversa natura del DNAgenico in altri34.

Ben diversa, soprattutto per gli aspetti clinici, èla condizione dei portatori del fenotipo McLeod, tuttidi sesso maschile, trattandosi di soggetti la cuianomalia colpisce un gene X-linked. Il suobackground genetico è eterogeneo e comprendedelezioni o differenti mutazioni molecolari a caricodell'RNA splicing3,26,35,36. Sono individui chepresentano una marcata depressione degli antigenidel sistema Kell ed una totale assenza del prodottodell'antigene Kx (codificato, ripetiamo, dal gene XK)antigene rinvenibile non soltanto nei globuli rossi,ma anche sulle cellule di molti altri tessutidell'organismo, fra cui i granulociti.

Le alterazioni del gene XK portano alla comparsadella sindrome McLeod, caratterizzata da un insiemedi alterazioni ematologiche, neurologiche e muscolari.Tipico è il reperto di un'acantocitosi delle emazieche si accompagna a uno stato di iperemolisi, conrelativo quadro ematochimico e ad una spiccatasplenomegalia. Frequente è anche la comparsa didisturbi neurologici con una precoce diminuzioneod assenza dei riflessi tendinei e l'apparizione dimovimenti distonici e coreiformi, come giàmenzionato. I disturbi a carico del sistema muscolaresono rappresentati da un elevato livello nel siero deglienzimi muscolari creatininchinasi e anidrasi carbonicaIII e dalla comparsa tardiva di una miopatialentamente progressiva2.

Alcuni soggetti portatori della sindrome McLeodpresentano anche una particolare malattia dell'etàinfantile, nota come granulomatosi cronica legata alsesso (chronic granulomatosis disease X-linked oCGD). È una malattia cronica che si sviluppa quandoil prodotto del gene XK è assente non soltanto sulleemazie, ma anche sui granulociti (CGD di tipo II).Una variante di questa forma morbosa è quella in



possible alloimmunisation against red cells aftertransfusions and/or pregnancies, because of theformation of an anti-Ku (anti-K5) antibody that reactsstrongly with the erythocytes of all the common Kellphenotypes.

The Ku (K5) antigen is, in fact, the basic substrateon which the genes act to give rise to all the differentphenotypes of the system.

The genetic anomalies found in Kellnull

subjectsare heterogeneous: some cases have a nonsensemutation33, others have different types of geneticDNA mutation34.

The situation, particularly the clinical picture, ofsubjects with the McLeod phenotype is verydifferent: all are male, since this anomaly affects anX-linked gene. The genetic background isheterogeneous and includes deletions and othermolecular mutations of RNA splicing3,26,35,36.

These individuals have marked depression of theantigens of the Kell system and a total absence ofthe Kx antigen (as mentioned before, coded for bythe XK gene); this antigen is found normally on redblood cells, but also on cells of many other tissues,included granulocytes.

Alterations in the XK gene lead to McLeod'ssyndrome, which is characterized by a set ofhaematological, neurological and muscularalterations.

Acanthocytosis and excessive haemolysis aretypical and produce the associated blood-chemistryprofile and marked splenomegaly.

As already mentioned, neurological disorders,with early decrease or loss of tendinous reflexes andthe appearance of dystonic and choreiformmovements, are frequent.

The muscle involvement is manifested by highserum levels of muscle creatinine kinases andcarbonic anhydrase III and the late onset of a slowlyprogressive myopathy2.

Some subjects with McLeod's syndrome alsomanifest a particular condition during infancy, knownas X-linked chronic granulomatosis disease (CGD).This is a chronic disease which develops when theproduct of the XK gene is absent not only from theRBCs but also from the granulocytes (type II CGD).

A variant of this disorder is that in which the XKglycoproteins are absent from the RBCs but not fromthe granulocytes (type I CGD).

The association between McLeod's syndromeand CGD is explained by remembering the physical

28

cui la glicoproteina XK è assente sulle emazie manon sui granulociti (CGD di tipo I).

L'associazione tra la sindrome McLeod e la CGDsi spiega ricordando la vicinanza tra i geni, entrambiX-linked, responsabili delle due malattie e non vadimenticata la possibilità che l'anomalia geneticadell'RNA splicing interessi anche quelli della retinitepigmentosa e della distrofia muscolare di Duchenne,situati in loci vicini sul cromosoma X2, 27, 29.

Le Glicoforine e i sistemi MNS e Gerbich, conil fenotipo Leach

A quattro glicoproteine della membranaeritrocitaria, denominate glicoforine, rispettivamenteGPA, GPB, GPC e GPD, sono associati gli antigenidei sistemi gruppoematici MNS e Gerbich. I 43antigeni attualmente conosciuti del sistema MN sonoassociati alle GPA, gli antigeni S, s (epresumibilmente U) alla GPB, mentre quelli delsistema Gerbich lo sono alle GPC e GPD18, 37. LaGPA e la GPB, caratterizzate da un alto grado diomologia strutturale, sono codificate da due genidiversi, ma strettamente linked, il GYPA e il GYPB,situati sul braccio lungo del cromosoma 4, inposizione q28-q31, a differenza di quanto avvieneper le GPC e la GPD che sono trascritte da ununico gene, il GYPC, non correlato con quelli delleprecedenti due glicoforine e mappato sul bracciolungo del cromosoma 2, in posizione q14-q21. Lasintesi dell'uno e/o dell'altra glicoforina sirealizzerebbe secondo un meccanismo di splicingalternativo del GYPC mRNA37. Le caratteristichedistintive delle glicoforine sono: un lungo dominioextracellulare, un elevato grado di glicosilazione eduna forte carica negativa dovuta ad un altocontenuto di acido sialico (da cui la denominazionedi sialoglicoproteine).

Ciò conduce a ritenere che la loro prima funzionesia di impedire l'aggregazione delle emazie, ma nonsi sono ancora ottenute prove sicure dell'importanzadell'alto contenuto dell'acido sialico per questa lorofunzione.

Tre categorie di varianti fenotipiche alleliche sonostate riscontrate a carico delle GPA e GPB dovute auna delezione parziale o totale dei loro rispettivi geni:la completa assenza delle glicoforine, la presenza diglicoforine abnormi e la formazione di strutture ibridedi queste proteine. A una pressoché totale delezionedei rispettivi geni è da riportare la rara variante Mk,


GL Molaro, G Reali

vicinity of the two genes, both X-linked, responsiblefor the diseases. Furthermore, abnormal RNAsplicing may also involve the genes for retinitispigmentosa and Duchenne's muscular dystrophy,situated in nearby loci on the X chromosome2, 27, 29.

The Glycophorins and the MNS and Gerbichsystems, with the Leach phenotype

The antigens of the MNS and Gerbich bloodgroup systems are associated with fourglycoproteins of the red cell membrane, namely GPA,GPB, GPC and GPD. The 43 currently recognisedantigens of the MN system are associated with GPA,the S,s antigens (and presumably U) with GPB, whilethose of the Gerbich system are associated with GPCand GPD18, 37.

GPA and GPB, characterised by a high degreeof structural homology, are coded for by twodifferent, but strongly linked genes, GYPA andGYPB, located on the long arm of chromosome 4,in position q28-q31. In contrast, GPC and GPD aretranscribed by a single gene, GYPC, not related tothe genes for the previous two glycophorins, whichmaps on the long arm of chromosome 2, in positionq14-q21. The synthesis of one and/or the otherglycophorin is apparently controlled by a mechanismof alternative splicing of the GYPC mRNA37.

The distinctive features of the glycophorins are along extracellular domain, a high degree ofglycosylation and a strong negative charge due tothe high content of sialic acid (from thus, their namesialoglycoproteins).

It has long been considered that the primaryfunction of these glycoproteins is to prevent bloodaggregation, but there is still not definitive proof ofthe importance of the high content of sialic acid forthis function.

Three categories of allelic phenotypic variants ofGPA and GPB are due to a partial or total deletionof their respective genes: the complete absence ofglycophorins, the presence of abnormal glycophorinsand the formation of hybrid structures of theseproteins. Almost total deletion of the genes causesthe rare Mk variant, which represents the nullphenotype of the MNS system (being characterisedby the complete absence of all the antigens of thesystem, that is, M, N, S, s and U).

The total lack of GPA and GPB is not associatedwith detectable clinical abnormalities, but rather with

29

che rappresenta il fenotipo null del sistema MNS(caratterizzata dalla completa assenza di tutti gliantigeni del sistema, cioè di M, N, S, s e U). Latotale carenza di GPA e GPB non si accompagna adanormalità cliniche rilevabili, ma, piuttosto, a situazionisierologiche particolari, nel senso che le emazie Mk

sono sempre negative per gli antigeni Wright ed En,sono, cioè, Wr(a-b-) ed Ena-negative18.

Per quanto riguarda il sistema Gerbich, è notoche esso è composto di tre antigeni ad altissimafrequenza (oltre il 99,9%): il Ge2, il Ge3 e il Ge4(così come è noto che l'odierna indisponibilità delsiero che individuò il primo antigene Gerbich, cioè ilGe1, non consente la stima della sua frequenza). Ilsistema è completato da altri quattro antigeni (Ge5,Ge6, Ge7 e Ge8) tutti a bassa incidenza (inferioreallo 0,1%).

Esistono fenotipi "difettivi": più precisamente loYus, che manca dell'antigene Ge2 (sigla: Ge:-2,3,4)e il Gerbich, che manca degli antigeni Ge2 e Ge3(sigla, Ge:-2-3,4). Questi due fenotipi presentanoGPC anomale, nel senso che il fenotipo Yus mancadei residui amminoacidici 17-35 su una catena di 128amminoacidi e il fenotipo Gerbich manca, invece,dei residui 36-63.

Esiste, poi, anche il raro fenotipo null,denominato Leach (sigla, Ge:-2-3-4). Ovviamentequesto fenotipo è caratterizzato dalla completamancanza delle glicoforine GPC e GPD in assenzadi proteine abnormi o ibride.

I soggetti con il fenotipo Leach presentano emazieellissocitiche di vario grado e in percentuali diverse(dal 20% al 60%).

Tale anomalia morfologica riflette l'alterazionedella composizione del citoscheletro della membranacellulare, caratterizzata da una riduzione delle sueproteine 4.1 e p55, che richiedono un legame con laGPC per la normale funzione della membranaeritrocitaria.

Le suddette due proteine sono ridotterispettivamente del 25% e del 98%3,18.

Va ricordato ancora che anche nell'ellissocitosiereditaria, dovuta alla deficienza della proteina 4.1 econtrassegnata da una totale trasformazione delleemazie in ellissociti, si osserva una riduzione delleGPC e GPD, che va dal 70% al 90% assieme ad undeficit della p55 3.

Le glicoforine, ed in modo particolare la GPA, sisono rivelate importanti dal punto di vista clinicodopo la dimostrazione della loro capacità di agire da



a particular serological pattern, in the sense that Mk

blood is always negative for the Wright and Enantigens, and is, thus, Wr(a-b-) and Ena-negative18.

As far as concerns the Gerbich system, it is knownthat this is made up of three antigens with anextremely high frequency (exceeding 99.9%): Ge2,Ge3 and Ge4 (the serum that identified the firstGerbich antigen, Ge1, is not longer available so thefrequency of this antigen cannot be estimated). Thesystem is completed by four other antigens (Ge5,Ge6, Ge7 and Ge8) all with a low incidence (below0.1%).

There are "defective" phenotypes: Yus, whichlacks the Ge2 antigen (denoted: Ge:-2,3,4) andGerbich, which lacks the Ge2 and Ge3 antigens(denoted: Ge:-2-3,4).

These two phenotypes have abnormal GPC: theYus phenotype lacks aminoacid residues 17-35 fromthe chain of 128 aminoacids and the Gerbichphenotype lacks residues 36-63.

There is also the rare null phenotype, called theLeach phenotype (denoted: Ge:-2-3-4). Obviouslythis has complete lack of the GPC and GPDglycophorins in the absence of abnormal or hybridproteins.

Subjects with the Leach phenotype have avariable degree and severity of elliptocytosis and indifferent percentages (from 20% to 60%).

This morphological abnormality reflectsalterations in the composition of the red cellmembrane cytoskeleton, characterised by a reductionin its 4.1 and p55 proteins, which must bind withGPC for normal red cell membrane function. Thesetwo proteins are reduced by 25% and 98%,respectivley3,18. It should be remembered that GPCand GPD are also reduced, along with a deficit inp55, in hereditary elliptocytosis due to deficiency inprotein 4.1. All the red blood cells in this conditionare transformed into elliptocytes3.

Glycophorins, and in particular GPA, have beenfound to be clinically important because of theircapacity to act as cell receptors for the merozoitesof Plasmodium falciparum (at least for somestrains). Thus RBCs lacking GPA has a greaterresistance to parasitic invasion, with a clear selectiveadvantage in areas in which this parasite is endemic.

Nevertheless, given the rare finding of deficientphenotypes, it seems clear that these cannot havestrongly influenced the relation between genotypeand endemic malaria.

30

recettori cellulari per i merozoiti del Plasmodiumfalciparum (almeno per alcuni suoi ceppi).

Da ciò, la maggior resistenza delle emazie carentidella GPA all'invasione del parassita, con un chiarovantaggio selettivo nelle aree di endemia di questoparassita, ma, stante il raro riscontro di fenotipicarenti, sembra evidente che essi non possano averinfluito od operato pesantemente sul rapporto tragenotipo ed endemia malarica.

Va ricordato che anche le emazie con la deficienzadella glicoforina B sono meno suscettibiliall'invasione, ma sostanzialmente non come quellecon il deficit della GPA, mentre i soggetti con ilfenotipo Leach dimostrano un certo grado diresistenza all'invasione dello stesso plasmodio3.

Per quanto riguarda l'acido sialico, contenuto nelleglicoforine per il 70% della quantità totale presentenell'emazia, non è stato stabilito quale sia la sua realeimportanza per l'invasione del Plasmodiumfalciparum.

Come vedremo più oltre, nel rapporto tra gliantigeni gruppoematici e l'invasione da parassitimalarici non risultano coinvolti soltanto gli antigenidel sistema MN, ma anche quelli del sistema Knops(CR1) e la banda 3 con gli antigeni Diego, cheagiscono da possibili recettori per il Plasmodiumfalciparum3 e, infine, gli antigeni Duffy.

Le glicoproteine con funzione di regolazionedel complemento ed i sistemi Cromer e Knops

Tre glicoproteine della membrana possiedono lacapacità di proteggere la cellula dalla distruzione adopera del complemento (C) di formazione autologa:il decay-accelerating factor (DAF o CD55), ilcomplement receptor-1 (CR1 o CD35) e il membraninhibitor of reactive lysis (MIRL o CD59). Alla DAFsono associati gli undici determinanti antigenici delsistema Cromer (otto dei quali sono di alta e tre dibassa frequenza). I cinque antigeni del sistema Knopssono associati alla CR1 con un numero di molecolesulla membrana che differisce notevolmente aseconda dei soggetti, variando da 20 ad oltre 80037-

39. La MIRL è, invece, priva di attività antigenicagruppoematica.

Le molecole delle glicoproteine DAF e MIRL sonoformate da un dominio extracellulare che è "ancorato"per mezzo del glycosilphosphatidilinositol (GPI) allamembrana dell'eritrocita e di tutte le cellule chevengono in contatto con il siero (da quelle ematiche,


GL Molaro, G Reali

RBCs deficient in glycophorin B are also lesssusceptible to invasion, but not to the same extentas that with a deficit of GPA. Subjects with the Leachphenotype show a certain level of resistance toinvasion by this plasmodium3.

As far as concerns the sialic acid, although 70%the total quantity in the RBC is contained in theglycophorins, the real importance of this moleculein invasion by Plasmodium falciparum has not beenestablished.

As described later, not only the antigens of theMN system are implicated in malarial invasion, butalso those of the Knops system (CR1) and band 3with the Diego antigens, which act as possiblereceptors for Plasmodium falciparum3 and, finally,the Duffy antigens.

Glycoproteins with complement-regulatingfunction and the Cromer and Knops systems

Three membrane glycoproteins have the capacityto protect cells from destruction by autologouslyformed complement (C): the decay-acceleratingfactor (DAF or CD55), complement receptor-1 (CR1or CD35) and the membrane inhibitor of reactivelysis (MIRL or CD59). Eleven antigenic determinantsof the Cromer system are associated with the DAF(8 with high frequency, 3 with low frequency).

The five antigens of the Knops system areassociated with CR1. The number of molecules onthe membrane differs remarkably between subjects,varying from 20 to over 80037-39. The MIRL, on thecontrary, does not have blood group antigenicactivity.

The molecules of the DAF and MIRLglycoproteins are formed of an extracellular domainwhich is "anchored" by glycosylphosphatidylinositol(GPI) to the membrane of red cells and all cells thatcome into contact with serum (blood cells, vascularendothelium cells and cells of the epithelia of thegastrointestinal, genito-urinary and central nervoussystems), while DAF is present in a soluble form inthe plasma3 .

The DAF glycoprotein inhibits the associationand accelerates the dissociation of C4b2a andC3bBb, the two fragments of complement that formC3-convertase operating in both the classical andalternative pathways of complement.

The main function of CR1 is to fix and processimmune complexes covered with the C3b/C4b

31

a quelle dell'endotelio vascolare e degli epiteli deisistemi gastrointestinale, genito-urinario e nervosocentrale), mentre nel plasma la DAF è presente informa solubile3 .

La glicoproteina DAF inibisce l'associazione edaccelera la dissociazione del C4b2a e del C3bBb, ledue frazioni del C che formano la C3-convertasioperante sia nella via classica che alterna del C. Lafunzione principale della CR1 è di fissare eprocessare gli immunocomplessi ricoperti dallefrazioni C3b/C4b, trasportandoli al fegato e alla milzaal fine di rimuoverli dal circolo.

La CD59, che pure partecipa alla regolazione dellacascata del C inibendo la lisi delle emaziecomplemento-mediata tramite la fissazione dellefrazioni C8 e del C9 del C, sembra avere un ruoloancora più importante nella protezione delle emaziedall'azione del C di origine autologa.

La sintesi del GPI nelle cellule è codificata daun gene X-linked denominato PIG-A la cuimutazione nelle cellule somatiche è alla basedell'emoglobinuria parossistica notturna (EPN), undisordine acquisito delle cellule staminaliemopoietiche, fondamentalmente caratterizzato dauno condizione di iperemolisi intravascolarecronica, con crisi ricorrenti e gravi disturbi a caricodi alcuni organi ed apparati. Le emazie dei pazientiaffetti da EPN, tipicamente carenti della DAF e dellaCD59, presentano la particolarità di andare incontroa lisi, se nei test in vitro sono messe in contattocon siero acidificato, tramite l'attivazione della viaalterna del C.

Il fenotipo Cromer null

(o Inab), caratterizzato dauna totale assenza del DAF, è l'espressione di unamutazione puntiforme del gene con formazione distop-codon38. Le emazie dei portatori non vengonoemolizzate nei test in vitro con il siero acidificato nédimostrano di essere distrutte prematuramente invivo3. II difetto alla base del fenotipo Inab, costituitoda mutazioni di varia natura del gene DAF, differisceda quello dell'EPN per il fatto che in questa sia latrascrizione che la traduzione del gene risultano intattee l'anomalia riguarda invece l'incapacità di "ancorare"la proteina alla membrana tramite il GPI37. È statodescritto un fenotipo carente dei principali antigeniKnops (Kna, Knb, McCa, SIa) denominato"Helgeson", dalla ricercatrice che descrisse, incollaborazione con altri, il primo anticorpo del sistema(che reagiva con la quasi totalità dei campionicimentati, tolti quelli di quattro soggetti non correlati,



fragments, transporting them to the liver and spleenso that they are removed from the circulation. CD59,which also participates in regulating the complementcascade by inhibiting complement-mediated lysis ofblood by fixing the C8 and C9 components ofcomplement, seems to have an even more importantrole in protecting RBCs from the action ofautologously produced complement.

The synthesis of GPI in the cells is coded for byan X-linked gene called PIG-A, whose mutation insomatic cells underlies paroxysmal nocturnalhaemoglobinuria (PNH). This acquired disorder ofhaematopoietic stem cells is basically characterizedby chronic intravascular haemolysis, with recurrentcrises and severe disorders in some organs andapparatuses. RBCs of patients with PNH, typicallylacking DAF and CD59, are particularly prone toundergo lysis in in vitro tests when mixed withacidified serum because of activation of thealternative complement pathway.

The Cromernull

(or Inab) phenotype, characterisedby a total absence of DAF, is the expression of apunctiform mutation of the gene with formation of astop-codon38. The RBCs of carriers are nothaemolysed in in vitro tests with acidified serum,nor do they seem to be destroyed prematurely invivo3. The defect underlying the Inab phenotype,comprising various types of mutation of the DAFgene, differs from that of PNH because in this latterboth transcription and translation of the gene areintact and the anomaly concerns the inability to"anchor" the protein to the membrane through theGPI37.

There is a phenotype lacking the main Knopsantigens (Kna, Knb, McCa, SIa); this phenotype isnamed "Helgeson", after the researcher who, incollaboration with others, described the firstantibody of the system (which reacted with almostall the samples, except those of four unrelatedsubjects, including Hegelson herself)40.

The finding that some strong antibodies of thesystem were able to react, albeit very weakly, withthe RBCs of "Helgeson" phenotype, has now ledthis to be considered as a depressed phenotype ratherthan a null phenotype.

No important clinical conditions have beenreported in association with this phenotype, but apossible selective advantage of the SI(a-) phenotypein respect of red cell invasion by Plasmodiumfalciparum should be mentioned18.

32

fra cui la studiosa stessa)40. La constatazione chealcuni potenti anticorpi del sistema erano in gradodi reagire, sia pur molto debolmente con le emaziedi fenotipo "Helgeson" ha indirizzato a considerarlocome un fenotipo depresso piuttosto che unfenotipo null. Non vengono segnalate alterazionicliniche importanti connesse con questo fenotipo,ma va attirata l'attenzione sul possibile vantaggioselettivo del fenotipo SI(a-) nei riguardidell'invasione eritrocitaria da parte del Plasmodiumfalciparum18.

La banda 3 ed il sistema Diego

La banda 3 è tra le più importanti proteine integralidella membrana eritrocitaria, così come lo è la GPA:ciascuna è presente con circa un milione di copieper cellula41,42. Come già ricordato, alla GPA sonoassociati i numerosi antigeni del sistemagruppoematico MN (43 sono quelli attualmenteconosciuti) ed i determinanti antigenici T e Pr; i 19antigeni noti della banda 3 fanno parte del sistemagruppoematico Diego18.

Il ruolo funzionale della banda 3 non è statoancora ben definito. Sulla base di studi condotti intopi nei quali la suddetta banda era stata inattivata(knockout mice) si è ipotizzato che essa possiedauna funzione di "chaperon" essenziale perl'espressione della GPA sulla superficie dell'emazia.L'ipotesi non sembra essere valida in campo umano,mentre è stata invece dimostrata la sua funzione ditrasporto di anioni attraverso la membrana, attivitàche si estrinseca, in particolare, come antiporter perlo scambio dell'H

2CO

3 con gli ioni Cl- onde impedire

l'accumulo dell'acido carbonico nelle emazie eliberarlo nel sangue per essere, poi, eliminato comeCO

2.

Una funzione, certamente importante, della banda3 è di mantenere l'integrità e la forma dell'emaziaattraverso la sua interazione con il citoscheletro, chesi estrinseca legandosi alle sue proteine eprecisamente all'anchirina e alle bande 4.2 e 4.1.Alcune mutazioni del gene che codifica per la banda3 e, quindi, per i determinanti Diego (gene AE1, cioèAnion Exchange protein) si associano, infatti, allacomparsa di alterazioni morfologiche dell'emazia ela conferma di questa azione è data dal fatto che nel20% circa dei pazienti affetti da sferocitosi ereditaria,portatori di diverse mutazioni del gene per la banda3 con assenza o diminuzione delle suddette proteine


GL Molaro, G Reali

Band 3 and the Diego system

Band 3, like GPA, is one of the most importanttransmembrane proteins of the red blood cellmembrane: there are about one million copies of eachper cell41,42.

As already mentioned, numerous antigens of theMN blood group system (43 have been recognisedso far) and the T and Pr antigenic determinants areassociated with GPA; the 19 known antigens of band3 are part of the Diego blood group system18.

The functional role of band 3 is not yet wellunderstood. Based on studies in mice in which band3 was inactivated (knockout mice), it washypothesised that band 3 has a role as a "chaperon",essential for the expression of GPA on the surfaceof red blood cells.

This hypothesis does not, however, seem to bevalid in humans in whom band 3 has beendemonstrated to have a function in transportinganions across the cell membrane. Indeed it seems toact particularly as an antiporter for the exchange ofH

2CO

3 with Cl- ions, in order to prevent the

accumulation of carbonic acid in the erythrocytesand to release it into the blood from where it is theneliminated in the form of CO

2. One definitely

important function of band 3 is to maintain theintegrity and shape of the RBCs, through its bindingwith the cytoskeletal protein, ankyrin, and bands 4.2and 4.1. Some mutations in the gene coding for band3 and, thus, for the Diego determinants (the AE1gene, that is Anion Exchange protein) are, in fact,associated with morphological changes in the RBC.

Indeed, the approximately 20% of patients withhereditary spherocytosis with various mutations ofthe gene for band 3 and an absence or decrease ofthe above mentioned membrane proteins, have thesame red cell morphological abnormalities.

Band 3 has also been attributed a role in theremoval of senescent RBCs. Old red cells undergochanges in the terminal stages of their life cycle,developing autoantigens that expose them to theaction of auto-antibodies formed in response to theantigenic stimulation that they themselves haveprovided. There are no reports of a total absence ofband 3 or of subjects with a Diego

null phenotype,

but there are observations that an anomaly of theband 3 gene, consisting in a deletion of 27 base pairs,prevents its transcribed protein (abnormal, becauseit lacks at least nine aminoacids) from functioning as

33

di membrana, si riscontrano le stesse anomaliemorfologiche eritrocitarie.

Alla banda 3 è stato attribuito un ruolo anchenella rimozione delle emazie senescenti, che vannoincontro ad alterazioni nelle fasi terminali del lorociclo vitale, con formazione di autoantigeni,esponendole così all'azione di autoanticorpi formatiin risposta ad una stimolazione antigenica da esseesercitata.

Mancano segnalazioni di una totale deficienzadella banda 3 e di soggetti con un fenotipoDiego

null, ma esistono osservazioni che dimostrano

come un'anomalia del suo gene, consistente in unadelezione di 27 paia di basi, impedisca al suotrascritto proteico, anomalo perché privo di noveamminoacidi, di funzionare come antiporter: Isoggetti con questa condizione presentanoun'ovalocitosi delle emazie assieme ad unaresistenza all ' invasione malarica, ma senzaparticolari disturbi clinici. Essi vengono consideraticome portatori, allo stato eterozigote, di unaanomalia genica che si estrinseca con la comparsadella cosiddetta Southeast Asian Ovalocytosis42,43.La forma omozigote di tale anomalia vieneconsiderata letale44, ma la segnalazione di un neonatocon grave anemia diseritropoietica, eritroblastosi,poichilocitosi eritrocitaria, idrope, totale assenzadella Banda 3, mantenuto in vita mediante unacontinua terapia trasfusionale di supporto esomministrazione giornaliera di bicarbonato disodio, fa ritenere che la totale assenza della banda3 sia compatibile con la vita, purché vengaimpiegato un adeguato intensivo trattamentomedico3. Una conferma delle alterazioni organichee funzionali associate ad una totale mancanza dellabanda 3 viene da osservazioni in campo animale(bovini)45.

Il sistema Colton ed il fenotipo Coltonnull

I determinanti antigenici di questo sistema sonoil Coa, il Cob. Un terzo antigene, denominato Co3, èpresente sulle emazie di tutti gli individui ad eccezionedi quelle con il fenotipo Colton

null o Co(a-b-).

La glicoproteina, portatrice degli antigeni Colton,denominata acquaporina-1 (AQP-1) e codificata dalgene AQP-1, fa parte della famiglia delle proteinecon canali per il passaggio selettivo dell'acquaattraverso la membrana cellulare. Tra le glicoproteinedelle membrane cellulari è quella che, oltre che sulle



an antiporter: subjects with this condition haveovalocytosis together with resistance to malaria,but without particular clinical disorders. They areconsidered to be heterozygous carriers of agenetic abnormality manifested by the appearanceof the so-called Southeast Asian Ovalocytosis42,43.The homozygous form of this anomaly isconsidered fatal44, but the report of a neonate withsevere dyserythropoiet ic anaemia,erythroblastosis, poikilocytosis, hydrops, andtotal absence of band 3, who was kept alive bycontinuous transfusion therapy and dai lyadministration of sodium bicarbonate, suggeststhat the total absence of band 3 is compatiblewith life provided suitably intensive treatment isgiven3. Confirmation of the organic and functionalalterations associated with total absence of band3 have come from observations in animals (bovinestudies)45.

The Colton system and the Coltonnull

phenotype

The antigenic determinants of this system are Coa,and Cob. A third antigen, named Co3, is present inthe RBCs of all individuals except those with theColton

null or Co(a-b-) phenotype.

The glycoprotein carrying the Colton antigens,named aquaporin-1 (AQP-1) and coded for bythe AQP-1 gene, is part of a family of proteinswith channels for the selective passage of wateracross the cell membrane. Of the cell membraneglycoproteins it is the one that is expressed onthe cells of the greatest number of tissues otherthan RBCs (it is highly expressed in the kidney,choroid plexus and in various epithelia andendothelia).

There are acquired and congenital forms of theCo(a-b) phenotype, associated with monosomy ofchromosome 7 or with congenital dyserythropoieticanaemia46.

There have also been four unrelated subjectsidentified with the Colton

null, phenotype: three had

an absence or very severe reduction of AQP-1,together with a decreased erythrocyte osmoticpermeability to water, and a variant of the AQP-1gene, without apparent clinical disorders; the fourthsuffered from a form of congenitaldyserythropoietic anaemia with a level of AQP-1less than 10% of the normal and greatly reducedosmotic permeability3.

34

emazie, è espressa sulle cellule del maggior numerodi tessuti (nel rene in maniera elevata, nel plessocoroideo e in vari epiteli ed endoteli).

Si conoscono forme acquisite e anche formecongenite del fenotipo Co(a-b-), associate ad unamonosomia del cromosoma 7 o ad un'anemiadiseritropoietica congenita46. Sono stati altresìosservati quattro soggetti con il fenotipoColton

null,senza legami di parentela tra loro: tre

dimostravano un'assenza o un'estrema riduzionedell'AQP-1, assieme ad una diminuzione dellapermeabilità osmotica all'acqua nelle emazie, e lapresenza di una variante del gene AQP-1,senza,peraltro, presentare apparenti segni di disturbi clinici;il quarto soffriva di una forma di anemiadiseritropoietica congenita con un livello dell'AQP-1 meno del 10% del normale e una permeabilitàosmotica molto ridotta3.

Il sistema Kidd ed il fenotipo Jk(a-b-)

La glicoproteina Kidd, cui sono associati i tredeterminanti antigenici del sistema, Jka, Jkb e Jk3, èpresente in tutte le emazie ad eccezione di quelle dirari soggetti non correlati, portatori del fenotipoKidd

null o Jk(a-b-). Esistono due tipi di fenotipo Kidd

minus-minus: uno determinato dallo stato diomozigosi per il gene amorfo Jk (portato sul locusJK, sistemato sul braccio lungo del cromosoma 18,in posizione q11.1-q11.2) e uno dovuto all'azione diun gene inibitore dominante, designato In(Jk) eportato sicuramente su un locus diverso da JK (anchese l'esatta sistemazione cromosomica non è stataancora individuata).

L'analisi genetica ha dimostrato che il fenotiponull "amorfo" è il prodotto di una mutazionedell'RNA splicing47. Se nella maggior parte dellepopolazioni si tratta di un fenotipo estremamenteraro, esso è presente nella Polinesia con unafrequenza di 1 su 400 soggetti. Le emazie de fenotipoKidd

null dimostrano una resistenza alla lisi osmotica

quando sono poste in una soluzione di urea 2M, manon risulta che tale caratteristica provochi disturbiclinicamente significativi.

Infatti, la glicoproteina Kidd si è dimostrata deltutto sovrapponibile al trasportatore di ureadenominato HUT11.La sua funzione fisiologica è,quindi, quella di assicurare un trasporto rapidodell'urea attraverso la membrana eritrocitaria:consentirebbe di prevenire il restringimento delle


GL Molaro, G Reali

The Kidd system and the Jk(a-b-) phenotype

The Kidd glycoprotein, associated with the threeantigenic determinants of the system, Jka, Jkb andJk3, is present on all RBCs with the exception of inthose rare, unrelated subjects who have the Kidd

null

or Jk(a-b-) phenotype.There are two types of Kidd

null phenotype: one

caused by homozygosity for the amorph gene Jk(carried on the JK locus, on the long arm ofchromosome 18, in position q11.1-q11.2) and onedue to the action of a dominant inhibitory gene, calledIn(Jk), definitely carried on a different locus thanthat of the JK (even though its exact site has not yetbeen identified).

Gene analysis has shown that the "amorph" nullphenotype is the result of a mutation in RNAsplicing47. Although this is an extremely rarephenotype in most populations, its frequency inPolynesians is one in 400 subjects.

The red blood cells of a subject with the Kiddnull

phenotype are resistant to osmotic lysis when placedin a 2M urea solution, but this characteristic doesnot seem to cause clinically significant disorders.

In fact, the Kidd glycoprotein seems identical tothe urea transporter named HUT11.

Its physiological function is, therefore, to ensurerapid transport of urea across the red cell membrane:this would prevent contraction of the RBCs duringits passage through the urea-rich environment of therenal medulla and at the same time, prevent urea beingcarried out of the kidneys3.

The Duffy system and the Fy(a-b-) phenotype

The allelic genes which, in the overwhelmingmajority of subjects of European and Asian origin,underlie the Duffy system, are Fya and Fyb: thesegenes code for the Fya and Fyb antigenic determinantsand are hence responsible for the three classicphenotypes: Fy(a+b-), Fy(a+b+) and Fy(a-b+).

In the Black African population there is a thirdallele, Fy, which does not produce the twoabovementioned antigens.

Homozygosity for this gene produces a fourthphenotype, Fy(a-b-), which is found in almost 100%of Black West Africans and in about 68% of BlackAmericans. The Fy allele is identical to Fyb, with theremoval of the mutation of a single nucleotide basewithin the site a gene named GATA-1 binding: this

35Blood Transf 2003; 1: 18-40

emazie durante il loro passaggio nell'ambiente ad altaconcentrazione di urea della zona midollare del renee nello stesso tempo di evitare il trasporto dell'ureaal di fuori del rene stesso3.

Il sistema Duffy ed il fenotipo Fy(a-b-)

I geni alleli, che nella stragrande maggioranza deisoggetti di origine europea ed asiatica stanno allabase del sistema Duffy, sono il Fya e Fyb: questi genicodificano per i determinanti antigenici Fya e Fyb econdizionano, conseguentemente, la comparsa deitre classici fenotipi: Fy(a+b-), Fy(a+b+) e Fy(a-b+).

Nella popolazione negra africana è presente unterzo allele il Fy che non produce i due suddettiantigeni. Una condizione di omozigosi per questogene produce un quarto fenotipo il Fy(a-b-), che siriscontra nella popolazione negra dell'Africaoccidentale con una frequenza vicina al 100% deisoggetti e nel 68% dei negri americani. L'allele Fy èidentico al Fyb, tolta la mutazione di una singola basenucleotidica entro il sito del gene denominato bindingGATA-1: mutazione che abolisce la capacità ditrascrizione dell'antigene Fy a livello eritrocitario, manon sulle cellule di altri tessuti.

Sulle emazie di tutti e tre i comuni fenotipi delsistema, ad eccezione di quelle con il fenotipoFy(a-b-), viene espresso anche il determinanteantigenico Fy3 definito da un anticorpo formato, perimmunizzazione trasfusionale e/o gravidica, dai rariindividui non Africani portatori del fenotipoFy(a-b). In tre soggetti con il fenotipo Fy(a-b-),che avevano prodotto un anticorpo anti-Fy3, lostudio della regione codificante per gli antigeni Duffyha dimostrato l'esistenza di mutazioni nonsense o diuna delezione a livello del quattordicesimo paio dibasi che ha portato alla formazione di uno stop codon.

Il locus Duffy (sigla: FY) è situato sul bracciolungo del cromosoma 1, in posizione q22-q23, moltovicino al centromero, cioè sullo stesso cromosomache porta il locus RH, il che può dare conto dellenote interazioni esistenti fra questi due sistemi18.

La glicoproteina Duffy è nota con ladenominazione di Duffy Antigen Receptor forChemokines (DARC) per la sua funzione di recettorecellulare comune a una varietà di citochine pro-infiammatorie: come tale, possiede la capacità diattivare e reclutare i leucociti, venendo così coinvoltain molti processi di interazione cellulare. Fra le diversechemochine fissate dalla DARC vi sono


mutation abolishes transcription of the Fy antigenon RBCs, but not on cells of other tissues.

The erythrocytes of all three common phenotypesof the system, with the exception of the Fy(a-b-)phenotype, also express the Fy3 antigenicdeterminant.

This antigen is defined by an antibody formed,as a result of transfusion and/or gestationalimmunisation, by rare non-African carriers of theFy(a-b-) phenotype.

Studies of the region coding for the Duffy antigensin three subjects with the Fy(a-b-) phenotype showedthat there were nonsense mutations or a deletion inthe fourteenth pair of bases which had led to theformation of a stop codon.

The Duffy locus (denoted: FY) is located on thelong arm of chromosome 1, in position q22-q23,very close to the centromere. This samechromosome also carries the RH locus, which couldexplain the known interactions between the twosystems18.

The Duffy glycoprotein is known as the DuffyAntigen Receptor for Chemokines (DARC) becauseof its function as a cell receptor for a variety ofpro-inflammatory cytokines: as such, it has thecapacity to activate and recruit leucocytes, thusbecoming involved in many cell interactionprocesses. DARC fixes a variety of chemokines,including interleukin-8 (IL-8), RANTES (Regulatedon activation normal T expressed and secreted),and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1).Indeed, the molecular structure of DARC is similarto that of the receptors belonging to one of thelargest families of glycoproteins in mammals, whichhave the capacity to bind to many differentligands48.

The real and specific function of DARC does,however, remain unknown.

Given its widespread presence on tissue cells(vascular endothelium of various organs, renal andpulmonary epithelium) it is thought that DARC actsas a receptor for eliminating mediators ofinflammation and that Duffy-positive red blood cellshave a "scavenger" function, removing unwantedchemokines.

The importance of this function must, however,by limited considering that the absence of DARCfrom the RBCs of most Africans, carriers of theFy(a-b-) phenotype, is not accompanied byrecognised clinical disturbances. This implies that

36

l'interleuchina-8 (IL-8), le RANTES (Regulated onactivation normal T expressed and secreted), lamonocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) e altre.La struttura molecolare della DARC è, infatti, similea quella dei recettori appartenenti ad una delle piùgrandi famiglie di glicoproteine nei mammiferi, chepossiedono la capacità di fissare molti differentiligandi48.

Rimane però ancora ignota quale sia la sua realee specifica importanza funzionale. Si è ritenuto che,data la sua ampia diffusione nelle cellule dei tessuti(l'endotelio vascolare di vari organi, gli epiteli delrene e del polmone), la DARC agisca da recettoreper eliminare i mediatori dell'infiammazione e che leemazie Duffy-positive abbiano una funzione di"spazzino" per la rimozione delle chemochineindesiderate. L'importanza di tale funzione, peraltro,deve essere limitata, se si considera che la suaassenza nelle emazie della maggior parte dellapopolazione africana, portatrice del fenotipo Fy(a-b-), non si accompagna alla segnalazione di disturbiclinici associati a tale anomalia. Da ciò, la deduzioneche l'importanza di tale funzione della DARC sia solorelativa3.

È stato dimostrato, invece, che la DARC fungeda recettore cellulare essenziale per i merozoiti delPlasmodium vivax, responsabile della malaria terzana.In condizioni normali nel gene che ne codifica laproduzione esiste un sito GATA-1, denominato DARCpromoter region, dal quale dipende la trascrizione diquesta glicoproteina nella membrana cellulare. Neisoggetti Fy(a-b-) la sua mancata trascrizione è dovutaad una mutazione puntiforme nella suddetta regionepromoter del gene, con conseguente mancataformazione del recettore sulle emazie, senza peròinterferire con la produzione della DARC sulle celluledi altri tessuti49.

La refrattarietà delle emazie prive della DARCall'invasione del parassita malarico presentata dagliAfricani, portatori in elevata percentuale del fenotipoFy(a-b-), costituisce pertanto un vantaggio selettivonelle zone a maggior diffusione del Plasmodium vivax,ma va ricordato che tale protezione non vale per altrespecie del parassita malarico48.

Le glicoproteine che regolano il complementoe i sistemi Lutheran e LW

Sulla membrana dell'eritrocita vi sono numeroseglicoproteine contrassegnate dalla presenza di un


GL Molaro, G Reali

this particular function of DARC is of only relativeimportance3.

It has been demonstrated, on the other hand, thatDARC acts as a cell receptor essential for themerozoites of Plasmodium vivax, responsible fortertian malaria. In normal conditions the gene codingfor its production contains a GATA-1 site, calledDARC promoter region, responsible for thetranscription of this glycoprotein in the cellmembrane.

The lack of DARC transcription in Fy(a-b-)subjects is due to a punctiform mutation in the so-called promoter region of the gene, so the receptoris not formed on blood cells, but its production oncells of other tissues is not affected49.

A high percentage of Africans have the Fy(a-b-)phenotype, and the fact that their blood, lackingDARC, is refractory to invasion by malarial parasitesis a selective advantage in areas in which there iswidespread diffusion of Plasmodium vivax;nevertheless, it should be remembered that thisprotection is not active against other species ofmalarial parasite48.

The glycoproteins that regulate complementand the Lutheran and LW systems

The red cell membrane carries numerousglycoproteins that are characterised by anextracellular domain formed of a different numberof sequences homologous to the variable (V) orconstant (C) part of immunoglobulins.

There are at least five glycoproteins in this"superfamily" (IgSF): two of them are associatedwith antigenic determinants of the Lutheran andLandsteiner-Wiener (LW) blood group systems.

Of the other IgSF, only CD147 is associatedwith the Oka antigen, while the other two, CD47and CD58 (LFA-3) do not appear to be linked toparticular red cell antigens3,18,50.

The Lutheran system comprises at least 18antigenic determinants: in reality the numbering hasreached 20, but two (Lu10 and Lu15) have beencancelled.

Four of the Lutheran determinants are coded forby allelic genes: Lua-Lub; Lu6-Lu9; Lu8-Lu14 andLu18 (or Aua)-Lu19 (or Aub)50.

The Lutheran glycoproteins are not onlyexpressed in RBCs in two isomeric forms withmolecular weights of 85 and 78 kilodaltons, but are

37Blood Transf 2003; 1: 18-40


also widely distributed in numerous tissues andorgans (foetal liver, placenta and others).

Their molecular structure is similar to that of theadhesion proteins of human and animal cells,including neoplastic ones51.

Their specific ligand is laminin, which is the majorcomponent of the basal membranes of cells.

Since the capacity of RBCs to fix laminin iscorrelated with the expression of the Lutheranantigens, it is considered that the glycoproteins ofthis system are involved in adherence of erythrocytesto endothelial cells of blood vessels and, thus, thatthey have a role in the vascular occlusion thatcharacterises some disorders (for exampledrepanocytic anaemia).

These glycoproteins are also thought to play arole in the late stages of erythropoiesis, again througha mechanism involving interaction with laminin3.

The rare null phenotype of the Lutheran system,that is Lu(a-b-), has a triple genetic background.

The first is due to a dominant gene, called In(Lu),which prevents the normal expression of the Lutheranantigens and is not associated with the LU gene, butis carried on a different locus.

The expression of other red cell antigens,including P

1 and i, is suppressed (or strongly

depressed) in carriers of this phenotype.The members of two families with Lu(a-b-)

phenotype due to this mechanism formation hadacanthocytosis and poikilocytosis, together witha reduced amount of receptor for concanavalinand altered electrolyte metabolism.

It should be remembered that the term InLu hasbeen considered inappropriate and an alternatenomenclature to substitute it has been proposed:SYN-IB (SYN: synthesis)18.

The other two mechanisms forming theLutheran

null phenotype are the homozygous presence

of an amorph recessive gene Lu at the LU locusand that of a recessive, X-linked gene50.

The LW blood group system is serologicallyassociated with the D antigen of the Rh system, asdemonstrated by the facts that the expression of LWantigen is higher in RhD-positive RBCs than it is inRhD-negative RBCs and that subjects with the Rh

null

phenotype are also LWnull

phenotype. However, theobservation of a subject with the extremely rarephenotype LW

null, LW(a-b-ab-) who had normal Rh

antigens demonstrates that the two systems are codedfor by genes at different loci18.

dominio extracellulare, formato da un differentenumero di sequenze omologhe a quelle della partevariabile (V) o costante (C) delle immunoglobuline.Almeno cinque sono le glicoproteine checompongono questa "superfamiglia" (IgSF): due diesse si associano ai determinanti antigenici dei sistemigruppoematici Lutheran e Landsteiner-Wiener (LW).Delle altre glicoproteine IgSF, solo la CD147 èassociata all'antigene Oka, mentre le restanti due, laCD47 e la CD58 (LFA-3) non risulta che sianocollegate a particolari determinanti antigenicieritrocitari3,18,50.

Il sistema Lutheran è formato da almeno 18deteminanti antigenici: in realtà la nomenclaturanumerica ne contempla 20, ma due (Lu10 e Lu15)sono stati cassati. Fra i determinanti Lutheran, quattrosono codificati da geni alleli: Lua-Lub; Lu6-Lu9; Lu8-Lu14 ed Lu18 (o Aua)-Lu19 (o Aub)50. Leglicoproteine Lutheran sono espresse non soltantosulle emazie con due forme isomere di pesomolecolare di 85 e 78 kilodalton, ma sonoampiamente distribuite anche in numerosi tessuti edorgani (fegato fetale, placenta e altri) con una strutturamolecolare simile a quella delle proteine di adesionedelle cellule umane e degli animali, comprese quelleneoplastiche51. Il loro ligando specifico è la laminina,che è il maggiore componente delle membrane basalidelle cellule.

Poiché la capacità delle emazie di fissare lalaminina è correlata all'espressione degli antigeniLutheran, si ritiene che le glicoproteine di questosistema siano coinvolte nell'aderenza dell'eritrocitaalle cellule all'endotelio dei vasi sanguigni e abbiano,quindi, un ruolo nei processi di occlusione vascolarecaratteristici di alcune forme morbose (per esempio,nell'anemia drepanocitica). Tali glicoproteineavrebbero un ruolo anche nelle fasi più tardivedell'eritropoiesi, sempre attraverso il meccanismodell'interazione con la laminina3. Il raro fenotipo nulldel sistema Lutheran, cioè il Lu(a-b-), presenta lacaratteristica di avere un triplice background genetico.

Il primo è quello dovuto ad un gene dominantedenominato In(Lu), che impedisce la normaleespressione degli antigeni Lutheran e non è associatoal gene LU, ma è portato da un locus differente. Neiportatori di questo fenotipo risultano soppressi (ofortemente depressi) altri antigeni eritrocitari fra i qualiil P

1 e l'i. Nei membri di due famiglie con il fenotipo

Lu(a-b-) riconducibile a questo meccanismo diformazione, è stata osservata la presenza di una

38 Blood Transf 2003; 1: 18-40

It has been shown that this phenotype is producedby the deletion of 10 nucleotides of the LW gene52,although the anomaly does not seem to be associatedwith any specific pathology3.

About 30% of the aminoacid sequence of theLW glycoprotein is the same as that of the intercellularadhesion molecules (ICAM), which have beenidentified on various white cell lines.

More precisely, the LW glycoprotein is ICAM-4and its specific ligand is the CD11/CD18 integrin.

An interaction between ICAM and integrins wouldbe a phenomenon of considerable importance,particularly during immune processes, because itwould ensure adhesion between cells of the immunesystem (in particular the T lymphocytes) anddendritic cells, with their specific role of antigenpresentation.

The exact physiological function of the LWglycoproteins in the RBCs does, however, remainunknown. One peculiarity of the LW system is thetransitory loss of its antigens which has beenobserved in pregnant women and in subjects withmalignancies of the haematologic system and of othertissues: this phenomenon could be indicative of anunderlying immunological disorder3.

acantocitosi e di una poichilocitosi delle emazie,assieme ad una riduzione del recettore per laconcanavalina e a un alterato metabolismo deglielettroliti. Va ricordato che il termine InLu è statoconsiderato non appropriato ed è stata avanzata laproposta di sostituirlo con quello di SYN-IB (SYN:synthesis)18.

Le altre due modalità di formazione del fenotipoLutheran

null sono, rispettivamente, quella dovuta alla

presenza di un gene recessivo amorfo Lu al locusLU in forma omozigote e quella di un gene X-linked,recessivo50.

Per quanto riguarda il sistema gruppoematico LWla sua caratteristica è di essere sierologicamenteassociato all'antigene D del sistema Rh, come èdimostrato dal fatto che nelle emazie RhD-positivel'espressione degli antigeni LW è più elevata di quelladelle emazie RhD-negative e che i soggetti con fenotipoRh

null risultano essere anche LW

null, ma l'osservazione

di un soggetto con il rarissimo fenotipo LWnull

, LW(a-b-ab-) che possedeva normali antigeni Rh, dimostrache i due sistemi sono codificati da geni portati su locidifferenti18. È dimostrato che questo fenotipo è ilprodotto di una delezione di 10 nucleotidi del geneLW52, ma è, peraltro, un'anomalia che non si associa aspecifiche patologie3.

La sequenza degli amminoacidi della glicoproteinaLW è per il 30% circa simile a quella delle molecoledi adesione intercellulari, le cosiddette ICAM, chesono dimostrabili sulle diverse linee cellularileucocitarie. Più precisamente, la glicoproteina LWè l'ICAM-4 ed il suo specifico ligando è l'integrinaCD11/CD18. L'interazione tra le ICAM e le integrinesarebbe un fenomeno di notevole importanza,soprattutto nel corso dei processi immunitari, perchéassicura l'adesione tra le cellule del sistema immune(in particolare, i linfociti T) e le cellule dendritiche,con il compito specifico di presentazionedell'antigene.

La precisa funzione fisiologica delle glicoproteineLW sulle emazie rimane, però, ancora sconosciuta.Una particolarità del sistema LW è il fenomeno diuna perdita transitoria dei suoi antigeni che è stataosservata in donne in corso di gravidanza e in soggettiaffetti da neoplasie ematologiche e di altri tessuti:una situazione che potrebbe essere indicativa di unsottostante disordine immunologico3.

GL Molaro, G Reali

39

Bibliografia

1) Reali G. I fenotipi eritrocitari silenti (o minus-minus). La Trasf del Sangue 1986; 31: 1-22.

2) Marsh WL. Biological roles for erythrocyte antigens. La Trasf del Sangue 1988; 33: 1-8.

3) Daniels G. Functional aspects of red cell antigenes. Blood Rev 1999; 13: 14-35.

4) Cartron JP, Colin Y. Structural and functional diversity of blood group antigens. Transfus Clin Biol 2001; 8: 164-99.

5) Bontadini A, Manfroi S, Conte R. Diagnostica molecolare in immunoematologia. La Trasf del Sangue 2001; 46: 139-47.

6) Reid ME, Lomas-Francis C. Molecular approaches to blood group identification [review]. Curr Opin Hematol 2002; 9: 152-9.

7) Rozman P, Dovc T, Gassner C. Differentiation of autologous ABO, RHD, RHCE, KEL, JK and FY blood group genotypes by analysisof peripheral blood samples of patients who have recently received multiple transfusions. Transfusion 2000; 40: 936-42.

8) Legler TJ, Eber SW, Lakomek M, et al. Application of RHD and RHCE genotyping for correct blood group determination inchronically transfused patients. Transfusion 1999; 39: 852-5.

9) Castilho L, Rios M, Bianco C, et al. DNA-based typing of blood group for the management of multiple-transfused sickle cell disease.Transfusion 2002; 42: 232-8.

10) Lo YMD, Hjelm NM, Fidler C, et al. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. N Engl J Med1998; 339, 1734-8.

11) Olsson M, Hansson C, Avent ND, et al. A clinically applicable method for determining the three major alleles at the Duffy (FY) bloodgroup locus using polymerase chain reaction with allele-specific primers. Transfusion 1999; 38: 168-73.

12) Reali G, Perrone O. Nuove acquisizioni sul sistema Rh mediate dalla biologia molecolare. La Trasf del Sangue 2000; 45: 60-73.

13) Avent ND, Marton PG, Armstrong-Fisher SS, et al. Evidence of genetic diversity underlying RhD-, weak D (Du), and partial Dphenotypes as determined by multiplex polymerase chain reaction analysis of the RHD gene. Blood 1997; 89: 2568-77.

14) Singleton BK, Green CA, Avent ND, et al. The presence of an RHD pseudo gene containing a 37 base pair duplication and anonsense mutation in Africans with the RhD-negative blood group phenotype. Blood 2000; 95: 12-8.

15) Finning KM, Martin PG, Soothill PW, et al. Prediction of fetal D status from maternal plasma: introduction of a new noninvasivefetal RHD genotyping service. Transfusion 2002; 42: 1079-85.

16) Wagner FF, Frohmajer A, Flegel WA. RHD positive aplotypes in D-negative Europeans. BMC Genetics 2001; 2: 10.

17) Avent ND, Reid ME. The Rh blood system: a review. Blood 2000; 95: 375-87.

18) Issit PD, Anstee DJ. Applied Blood Group Serology. 4th ed, Durham, NC, Montgomery Scientific Publications; 1998.

19) Cherif-Zahar B, Raynal V, Gane P, et al. Candidate gene acting as a suppressor of the RH locus in most cases of Rh-deficiency. NatGenet 1996; 13: 168-73.

20) Cherif-Zahar B, Matassi G, Raynal V, et al. Rh deficiency regulator type caused by splicing mutations in the human RH50 gene.Blood 1998; 92: 2535-40.

21) Huang C-H, Liu Z, Cheng G, et al. Rh 50 glycoprotein gene and Rhnull disease: a silent splice donor is trans to a Gly279-Glumissense mutation in the conserved transmembrane segment. Blood 1998; 92. 1776-84.

22) Cherif-Zahar B, Matassi G, Raynal V, et al. Molecular defects of the RHCE gene in Rh-deficient individuals of the amorph type.Blood 1998; 92: 639-46.

23) Huang C-H, Chen Y, Reid ME, et al. Rhnull disease: the amorph type results from a novel double mutation on RHCe gene on D-negative background. Blood 1998; 92: 664-71.

24) Huang C. Cheng CJ, Reid ME, et al. Rhmod syndrome: a family study of the translation-initiator mutation in the Rh50 glycoproteingene. Am J Human Genet 1999; 64: 108-17.

25) Russo D, Redman C, Lee S. Association of XK and Kell blood group proteins. J Biol Chem 1998; 273: 13950-6.

26) Lee S, Russo D, Redman C. Functional and structural aspects of the Kell blood group system. Transfus Med Rev 2000; 14: 93-103.

27) Redman CM, Marsh WL. The Kell blood group system and the McLeod phenotype (review). Semin Hematol 1993; 30: 209-18.

28) Ho M, Chelly J, Carter N, et al.: Isolation of the gene for McLeod syndrome that encodes a novel membrane transporter protein. Cell1994; 77: 869-80.

29) Redman CM, Reid ME. The McLeod syndrome: an example of the value of integrating clinical and molecular studies. Transfusion2002; 42: 284-6.



40

GL Molaro, G Reali

30) Vaughan JI, Manning M, Warwick RM, et al. Inhibition of erythroid progenitor cells by anti-Kell antibodies in fetal alloimmuneanemia. N Engl J Med 1998; 338: 798-803.

31) Danek A, Rubio JP, Rampoldi L. McLeod neuroacanthocytosis, genotype and phenotype. Ann Neurol 2001; 50: 755-64.

32) Stevenson VL, Hardie RL. Acantocytosis and neurological disorders. J Neurol 2001; 248: 87-94.

33) Lee S. Molecular basis of Kell blood group phenotypes. Vox Sang 1997; 73: 1-11.

34) Koda Y, Soejima M, Tsuneoka M, et al. Heterozigosity of two novel alleles of the KEL gene cause the Kell-null (Ko) phenotype ina Japanese woman. Br J Haematol 2002; 117: 220-5.

35) Russo DCW, Lee S, Reid ME, Redman CM. Point mutations causing the McLeod phenotype. Transfusion 2002; 42: 287-93.

36) Daniels GL, Weinauer F, Stone C, et al. A combination of effects of rare genotypes at the XK and KEL blood group loci results inabsence of Kell system antigens from red blood cells. Blood 1996; 88: 4045-50.

37) Lutz P, Dzik WH. Molecular biology of red cell blood group genes [review]. Transfusion 1992; 32: 467-83.

38) Wang L, Uchikawa M, Tsuneyama A, et al. Molecular cloning and characterization of decay-accelerating factor deficiency inCromer blood group Inab phenotype. Blood 1998; 91: 680-4.

39) Moulds JM, Zimmerman PA, Doumbo OK, et al. Molecular identification of Knops blood group polymorphism found in long homologousregion D of complement receptor 1. Blood 2001; 97: 2879-85.

40) Helgeson M, Swanson J, Polensky HF. Knops-Helgeson (Kna) a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion 1970; 10: 137-8.

41) Tanner MJA. Structure and function of band 3 (AEI): recent developments [review]. Mol Mem Biol 1997; 14: 155-??.

42) Poole J. Red cell antigens on band 3 and glycoforin A. Blood Rev 2000; 14: 31-43.

43) Jarolin P, Palek P, Amato D, et al. Deletion erythrocyte band 3 gene in malaria resistant South Asian ovalocytosis. Proc Natl AcadSci USA 1991; 88: 11022-6.

44) Liu S-C, Jarolin P, Rubin HL, et al. The homozygous state for the band 3 protein mutation in South Asian Ovalocytosis may be lethal.Blood 1994; 84: 3590-1.

45) Inaba M, Yawata A, Koshino I, et al. Defective anion transport and marked spherocytosis and membrane instability caused byhereditary total deficiency of red cell band 3 in cattle due to nonsense mutation. J Clin Invest 1996; 87: 1804-17.

46) Parson Sf, Jones J, Anstee DJ, et al. A novel form of congenital dyserythropoietic anemia associated with deficiency of erythroidCD44 and a unique blood group phenotype In(a-b-), Co (a-b-). Blood 1994; 83: 860-8.

47) Lucien N, Sidoux-Walter F, Olives B, et al. Characterization of the gene encoding the human Kidd blood group/urea transporterprotein. Evidence for splice site mutations in Jk null individuals. J Biol Chem 1998; 273: 12973-80.

48) Hadley TJ, Peiper SC. From malaria to chemokine receptor to emerging physiologic role of the Duffy blood group antigen. Blood1997; 89: 3077-91.

49) Tournamille C, Colin Y, Cartron JP, Le Van Kim C. Disruption of a GATA motif in the Duffy gene promoter abolishes erythroid geneexpression in Duffy negative individuals. Nat Genet 1995; 10: 224-8

50) Poole J. Review: the Lutheran blood group system-1991. Immunohematology 1992; 8:1-8.

51) Parsons SF, Mallinson G, Holmes CH, et al. The Lutheran blood group glycoprotein, another member of the immunoglobulin superfamily,is widely expressed in human tissues and is developmentally regulated in human liver. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 5496-500.

52) Hermand P, Le Pennec PY, Rouger P, et al. Characterization of the gene encoding the human LW blood group protein in LW+ andLW- phenotypes. Blood 1996; 87: 2962-7.


Review - Blood Transfusion · 2015. 11. 26. · Il problema della compatibilità pretrasfusionale...

Documents

Transcript of Review - Blood Transfusion · 2015. 11. 26. · Il problema della compatibilità pretrasfusionale...