RETI di LABORATORI - [Biotecnologie] BIO BOP

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Codice Progetto: 57 BioBOP-BioBanca Oncologica Pugliese Network per l’utilizzo di tessuti oncologici controllati e caratterizzati per lo sviluppo di nuovi approcci diagnostici, farmacologici e biomedicali Coordinatore scientifico Dr. Angelo Paradiso Istituto Tumori G Paolo II, IRCCS, Bari

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Codice Progetto: 57

BioBOP-BioBanca Oncologica PuglieseNetwork per l’utilizzo di tessuti oncologici controllati e caratterizzati per lo sviluppo di nuovi approcci diagnostici, farmacologici e biomedicali

Coordinatore scientificoDr. Angelo ParadisoIstituto Tumori G Paolo II, IRCCS, Bari

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Codice Progetto: 57BioBOP-BioBanca Oncologica PuglieseNetwork per l’utilizzo di tessuti oncologici controllati e caratterizzati per lo sviluppo di nuovi approcci diagnostici, farmacologici e biomedicali

Background:L’Oncologia è uno dei settori dalle maggiori prospettive future di sviluppo scientifico ed industriale (Assobiomed, 2011)Queste prospettive sono essenzialmente legate allo sviluppo di una Medicina Personalizzata che utilizza nuove conoscenze bio-molecolari tumorali per individuazione di nuovi marcatori diagnostici, di innovativi farmaci molecular-targeting, di tecnologie laboratoristiche moderne La ricerca in questi settori richiede la disponibilità di tessuti biologici umani le cui caratteristiche morfologiche, biomolecolari, genetiche vengono studiate in relazione all’andamento clinico della malattia (prevenzione, diagnosi precoce, risposta ai farmaci, predizione prognosi , tossicità, etc).Su questi presupposti, l’organizzazione di una Biobanca per la raccolta di campioni tissutali umani viene oggi ritenuto elemento cruciale per l’ulteriore sviluppo della Oncologia (Times, 2010).

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Obiettivo della Rete

-Sviluppo di una Infrastruttura di Risorse Biomolecolari per la Ricerca organizzate intorno ad una Cancer-Oriented-Biobank regionale.-Integrazione risorse biomolecolari e tecnologiche per caratterizzazione tessuti oncologici

Settori di impatto

Biotecnologie Per la salute dell’Uomoricerca scientificasviluppo Biomedicaleapplicazione medicina personalizzata

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Domanda di innovazione del sistema produttivo

• Diagnostici: nuovi Biomarkers

• Biomedicale tecnologie innovative

• Farmacologico validazione clinico-analitica di targets

Offerta tecnologica della Rete

• Campioni biologici umani certificati

• Informazione su aggressività clinica

• Caratterizzazione biologica standardizzata

• Caratterizzazione Biologica Innovativa

• Procedure ELSI standardizzate

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Le unità di ricercaUnità di ricerca ResponsabileUO1: Istituto Tumori G Paolo II, IRCCS,Bari

Dr Angelo Paradiso

UO2: Dip Scienze Mediche e Lavoro, Fac. Medicina e Chirurgia, Univ Foggia

Prof Arcangelo Liso

UO3: Dip Bioscienze, Biotecnologie e Biofarmaceutica Università di Bari

Prof Stephan Reshkin

UO4: Ist. Tecnologie Biomediche, CNR, Bari

Prof Graziano Pesole

UO5: Dip Bioscienze, Biotecnologie e Biofarmaceutica Università di Bari,

Prof Susanna Cotecchia

UO6: IRCCS Casa Sollievo Sofferenza, S. Giovanni Rotondo

Prof Vito Fazio

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Attività Strutturazione/certificazione Biobanca di Riferimento Regionale: accessibilità esterna

Attività Caratterizzazione Tessuti Biobanche Network con assays standardizzati per innovativi aspetti biomolecolari: accessibilità esterna

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Progetto Dimostratore

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Attività Strutturazione/certificazione Biobanca di Riferimento Regionale: accessibilità esterna

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UO partecipanti

Istituto Tumori IRCCS BariCSS, IRCCS, S. Giovanni RotondoUniversità di Foggia

Progetto Dimostratore

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Le attività svolte al 31/12/2013Attività 1. Strutturazione/certificazione Biobanca di Riferimento regionale: accessibilità esterna

Risultati raggiunti Consegna Struttura in corso Definizione POS Survey Regionale

Ricadute industriali • Crioconservazione certificata di materiali biologici usati come standards di riferimento

• Disponibilità di biospecimens umani per validazione analitica di nuovi assays di interesse oncologico

Altri risultati • Partecipazione BBMRI preparatory• Partecipazione BBMRI Italy• Publicazioni• Formazione personale

Imprese coinvolte Tipo di contatto Frequenza di contatto

Astra-Zeneca Preliminare Studio Clinico

Integrated Systems Engineering s.r.l.

Preliminare Biomedicale

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Attività Strutturazione/certificazione Biobanca di Riferimento Regionalec/o Istituto Tumori G Paolo II IRCCS Bari: accessibilità esterna

La Biobanca c/o Istituto Tumori prima dell’Intervento:

a) Struttura pre-esistente Cert. UNI EN ISO 9001:2000b) Procedure Operative Standard già adottate C.I., MTA, QA, QC, DPIc) Formazione Personalec) Coordinamento Biobanche Oncologiche Nazionali

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BioBanca Istituzionale- BioBanca Oncologica di Riferimento Regionale Istituto Tumori G Paolo II IRCCS BariAvanzamento al 31.11.2013

Ingresson. 2 livelli, 280 mq

Livello 2:Area Stocckaggio per Diagnostica/ricerca Criocontenitori, -80°C, -143°C,-173°CArea Stocckaggio Materiale terapeutico Criocontenitori,-143°C,-173°C, discesa

Livello 1: Elaborazione datiLaboratorio manipolazione, aliquotaggioLaboratorio Produzione Derivati

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Attività Strutturazione/certificazione Biobanca di Riferimento Regionale: accessibilità esterna

a) Survey Risorse Biologiche presenti nelle UO di Ematologia regionali

b) Survey Risorse Biologiche presenti nelle UO di Anatomia patologica regionali

c) Sviluppo DataBase

d) Sviluppo Portale Web

Prog. Dimostratore

Attività in corso

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Attività Caratterizzazione Tessuti Biobanche Network con assays standardizzati per innovativi aspetti biomolecolari: accessibilità esterna

UUOO partecipanti Istituto Tumori IRCCS, BariUniFgDip Fisiologia 1, UniBaITB-CNR, BariDip Fisiologia 2, UniBaCSS, IRCCS, S. Giovanni Torondo

Progetto Dimostratore

OBBIETTIVI Standardizzazione Assays Innovativi Definizione Procedure Operative Scheda Informativa Utenza

Ricadute industriali

Altri risultati

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Le attività svolte al 31/12/2013

Attività UO n.2 Dip Scienze Mediche e Chirurgiche, Università Foggia

Risultati raggiunti -Installazione e messa a punto dell’apparecchiatura e dei protocolli di analisi e separazione.

-Analisi dei campioni pilota e procedure di validazione.

-Analisi dei protocolli di separazione presenti nello strumento AutoMACS Pro Separator.

-Invio agli Istituti di Ematologia pugliesi, di un questionario per censire lo stato dell’arte (raccolta e banking) e possibile utilizzo dello strumento e dei programmi a disposizione per la separazione delle diverse sottopopolazioni cellulari.

Raccolta e analisi dei dati così ottenuti.

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Immagini UO 2 UniFg

AutoMACS Pro Separator, Miltenyi

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Le attività svolte al 31/12/2013Attività UR3/UR5. Dip Bioscienze, Biotecnologie e Biofarmaceutica Università di Bari, Aldo Moro

Risultati raggiunti

Risultati raggiunti -Installazione e messa a punto dell’apparecchiatura e dei protocolli di acquisizione e gestione delle immagini.

-Messa a Punto delle analisi di compartimentalizzazione di proteine in diversi modelli sia di tessuti tumorali che di colture cellulari 3D (matrigel, collagene, etc).

-Analisi dei campioni pilota con procedure di validazione e diffusione dei risultati ottenuti su riviste internazionali.

Altri risultati • Formazione• Co-funding

Imprese coinvolte Tipo di contatto Frequenza di contatto

Le attività svolte al 31/12/2013

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Immagini 1: Unità 3/5(foto delle strumentazioni)

Microscopio confocale

Laser multi-fotoni

Targa del Confocale: BioBoP/Università

Targa del multi-fotoni: BioBoP/Università

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Immagini 2: Unità 3/5(foto dei prodotti)

Espressione di tre proteine ‘markers’ in tessuti di PDAC umani- realizzata in collaborazione con Prof. F. Alves/Gottingen, Germania

Co-localizzazione di tre proteine in tessuto di mammella umana realizzata in collaborazione con CNR di Bari

Co-localizzazione di due proteine con aree di infiltrazione (ECM proteolisi) in tessuto di mammella umane- realizzata in collaborazione con prof. S. Roger/ Tours, Francia.

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Immagini 3: Unità 3/5(foto dei prodotti)

Cellula metastatica in tumore di prostata con particolare della proteina NHE1 in un punto cellulare invasivo.

Co-localizzazione di proteine markers dell’invasione con aree di infiltrazione del tumore

Ricostruzione 3D della localizzazione della proteina NHE1 ( in rosso) in corrispondenza di aree di digestione della matrice extracellulare (in verde) in un tumore umano di mammella.

1 µm

SOLVENT

Immagine 2D di un gruppo di cellule tumorali che invadono il tessuto normale in un tumore umano di mammella. In verde la proteina NHERF1, in rosso i capillari e in blu il DNA.

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Attività UR4Istituto Tecnologie Biomediche - CNR - BARI

Risultati raggiunti Sequenziamento massivo e analisi del profilo di Epressione genica dei tessuti normali e tumorali collezionati nella biobanca oncologica

Ricadute industriali • Produzione di un kit per l’analisi del trascrittoma per l’identificazione di biomarcatori

Altri risultati

Attività svolte al 31.12.2013

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Analisi del trascrittoma per l’identificazione di biomarcatori in diverse condizioni fisio-patologiche

Analisi della biodiversità molecolare con approcci di metagenomica e metatrascrittomica

Analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento massivo

Interessi ScientificiLa genomica funzionale

La maggior parte del genoma umano è trascritto e ha una funzione biochimica (ENCODE Project -Encyclopedia of DNA Elements)

Il trascrittoma di una cellula è in grado di catturare un livello di complessità maggiore rispetto al genoma

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Metodo per la preparazione e amplificazione di librerie rappresentative di cDNA per il sequenziamento massivo, loro uso, kit e cartucce per kit di automazione Inventori

Tullo ApolloniaSbisà Elisabetta Mangiulli Marina Pesole Graziano

Messa a punto di un PROTOCOLLO UNIVERSALE che permette di preparare una libreria rappresentativa di cDNAs, partendo da quantità esigue di RNA totale, che può essere utilizzata con tutte le piattaforme di sequenziamento di nuova generazione presenti sul mercato

BrevettoRM2010A000293- PCT/IB2011/052369

Attività svolta nell’ambito del progetto

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Sistema automatico per l’aspirazione e dispensazione di liquidi per l’estrazione di acidi nucleici da cellule e tessuti e per la preparazione di campioni per la qPCR, per la PCR in emulsione e per l’arricchimento delle biglie dopo la rottura dell’emulsione nel workflow della piattaforma di sequenziamento massivo GS FLX Titanium Series (Roche).

Liquid Handler

Sviluppi futuriI dati provenienti dal sequenziamento insieme a quelli clinici consentiranno l’individuazione di nuovi biomarcatori. Tale attività di ricerca, oltre a consentire la comprensione di meccanismi di base e di possibili nuove applicazioni, contiene in sé le potenzialità di fornire servizi diretti a laboratori di analisi, parchi scientifici e distretti tecnologici nell'ambito dell'identificazione di bersagli terapeutici, protocolli diagnostici e/o prognostici per patologie tumorali.

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Le attività svolte al 31/12/2013

Attività 1. UO6 Laboratorio di Oncologia, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza, San Giovanni Rotondo (Fg)

Risultati raggiunti Sviluppo e validazione di metodologie di analisi dello stato di metilazione genica mediante Quantitative RT PCR - Metilazione Specifica (QMSP)

Ricadute industriali • Sviluppo di strumentazioni automatizzate e standardizzate per analisi epigenetiche

• Sviluppo di kit diagnostici genetico/epigenetico molecolari

Altri risultati Partecipazione a gruppi di studio internazionali sulla genetica ed epigenetica dei tumori, quali il Clinical Lung Cancer Genome Project (CLCGP) ed il Network Genomic Medicine (NGM).

Imprese coinvolte Tipo di contatto Frequenza di contatto

EISAI S.r.l. Laboratorio centralizzato

Studio Clinico Multicentrico

MASMEC S.p.A. MASMEC BIOMED(sviluppo di strumentazioni automatizzate per analisi genetico molecolari e di kit diagnostici)

Collaborazione stabile

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Sistema di analisi di modificazioni genetiche ed epigenetiche

HT7900 Fast Real time PCR System con sistema di analisi in LDA (Low Density Array) (Life Technology).

Sistema di PCR in Real Time dotato di blocco Low Density Array (LDA) che permette di analizzare fino a 380 diversi target precedentemente depositati su una apposita card. Conferendo allo strumento funzionalità di microarray a bassa densità.

Vantaggi LDA: il sistema permette di analizzare in simultanea fino a 384 diverse sequenze geniche in maniera direttamente quantitativa ed altamente controllata.

Genetica ed Epigenetica*Nei nostri corpi esistono centinaia di tipi diversi di cellule. Anche se ognuna di esse discende dallo stesso stato iniziale, le caratteristiche di un neurone sono molto diverse da quelle, ad esempio, di una cellula epatica. In presenza dei circa 30.000 geni del genoma umano, l'importanza del "silenzio" non va sottovalutata, come in una qualunque esecuzione orchestrale. Al procedere della divisione cellulare, il destino delle singole cellule viene governato dall'utilizzo selettivo, e dal silenzio, dei geni. Questo processo viene regolato dai fattori epigenetici. I profili di metilazione del DNA giocano un ruolo chiave in tutti quei fenomeni in cui i geni vengono attivati o disattivati, dalla deposizione di una sfumatura viola sul petalo di una petunia alla crescita di un tumore maligno.L'impossibilità di reprimere certi geni può produrre una pericolosa cacofonia. Una metilazione troppo ridotta del DNA può modificare la configurazione della cromatina. Ciò influisce sull'attivazione e la repressione di determinati geni dopo la divisione cellulare. Una metilazione eccessiva può distruggere il lavoro protettivo fatto dai soppressori tumorali e dai geni riparatori del DNA. Tali epimutazioni sono state osservate in un ampio spettro di tumori. Queste possibilità epigenetiche consentono l'esplorazione di nuove strade terapeutiche.L'epigenetica fornisce anche uno strumento per spiegare come il materiale genetico risponda alle mutevoli condizioni ambientali. L'ambiente può anche portare a cambiamenti epigenetici che riguarderanno le generazioni future.Proprio come un direttore d'orchestra decide la dinamica dell'esecuzione di una sinfonia, i fattori epigenetici regolano l'interpretazione del DNA all’interno di ciascuna cellula vivente. La comprensione di questi fattori potrebbe rivoluzionare la biologia evolutiva e dello sviluppo, portando a profonde implicazioni in molti campi, dalla medicina all'agricoltura. Potremo allora rispondere a Watson, “L'alfabeto dei geni è come la parola di Dio e la sua traduzione è la sua mano".

*Riadattato da http://epigenome.eu/it/1,3,0 a cura di Tom Davies 2013.

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Il materiale biologico della biobanca viene studiato per la presenza di ipermetilazione in geni tumore-associati.

BioBanca

Studi di Metilazione

Analisi dei dati

Validazione Clinica

Biomarcatori di prognosi e

risposta alle terapie

Studi In vitro

Paziente

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Controllo di Qualità

Agilent Bioanalyzer 2100

Estrazione di DNAEstrazione di DNAPhase separation

QMSPQMSP

Serial dilutions Standard curve

BioBanca

DNA

E’ stata messa a punto una metodica che consente di quantificare lo stato di metilazione di geni specifici quali MGMT e KEAP1 .

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Standard curve ACTB

Standard curve MGMT

MGMT Methylated

MGMT Unethylated

Specificity QMSP93% (95%CI: 84%-100%)

MGMT methylation status:SIGMA: Stupp Including Gliadel® for Glioma.

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Attività PROGRAMMATE

1. UO6 Laboratorio di Oncologia, IRCCS Casa Sollievo della Sofferenza, San Giovanni Rotondo (Fg)

Fase I. Sviluppo di kit per l’analisi QMSP dei geni MGMT, KEAP1, PTEN, GSTP1, E- caderina, TIMP3

Fase II. Validazione analitica degli assay sviluppati.

Fase III. Analisi di un “training set” di campioni: valutazione dell’associazione tra stato di metilazione, caratteristiche clinico-patologiche, prognosi e risposta ai trattamenti.

Fase IV. Validazione dei risultati ottenuti nella Fase III su set di campioni indipendenti

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Attività promozionali svolte al 31.12.2013

Formazione Alta QualificazioneAddestramento/ Sviluppo CompetenzeAttrazione Giovani Ricercatori

Partecipazione Networks nazionali RIBBOBBMRI.it

Partecipazione Networks Internazionali EORTCBBMRI.euESBBR

Sito web della Rete: http://www.biobop.it/

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Attività programmate 2014

OperativitàPortale WebDatabase biospecimens disponibili in reteProcedure Operative della ReteCarta dei ServiziOpuscolo illustrativo attività network

FormazioneTecnici in BiobankingBiobank Manager

Realtà IndustrialeMeetingMailing ListContatto attivo con soggetti industriali

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Biobanca Regionale DataBase

Uni FG- Ematologie CSS SGR

UniBa

ITBCNR

IRCCS Tumori

Bari

BioBOP

Tessuti UmaniCaratterizzzazione Biologica Realtà Produttiva

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Contatti

Biobanca: sito web www.biobop.itEmail: [email protected]

Coord Scient. Angelo Paradiso [email protected] 320 4387181

RUP G. Salomone [email protected] 320 4387175

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BioBOP-BioBanca Oncologica PuglieseNetwork per l’utilizzo di tessuti oncologici controllati e caratterizzati per lo sviluppo di nuovi approcci diagnostici, farmacologici e biomedicali