Relazione Tirocinio Analisi Sierologiche

INDICE INDICE

Indice

1 Introduzione 2

2 Tipologie di Esami 2

3 Attività svolte 33.1 Attività in sala prelievi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33.2 Attività in laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

3.2.1 Toxoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53.2.2 Helicobacter pylori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.2.3 Tempo di protrombina (PT) e tempo di tromboplastina parziale

(PTT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

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2 TIPOLOGIE DI ESAMI

1 Introduzione

Dal 13 Settembre al 9 Ottobre 2010, ho svolto un’attività di tirocinio presso il labo-ratorio della struttura Ospedaliera in Recanati ASUR Zona Territoriale n° 8 Civitano-va Marche. Il laboratorio ha punti di prelievo dislocati sul territorio, assicurando leprestazioni ai ricoverati nei reparti ospedalieri, ai pazienti del Pronto Soccorso e agliUtenti esterni. ll laboratorio analisi esegue i prelievi ematici e di campioni biologici(urine, feci, escreato, liquido spermatico, tamponi, ecc...). I campioni i cui particolaritest non sono effettuati direttamente vengono inviati ai vari laboratori specialistici.

2 Tipologie di Esami

Tra i vari settori del laboratorio mi sono occupata dei test sierologici e in particolareho seguito l’iter di alcuni di essi come:

• Il Tempo di protrombina (PT), rilevante nel monitoraggio di pazienti sottopostia terapia anticoagulante e il Tempo di Tromboplastina Parziale (PTT) general-mente espresso come rapporto paziente/controllo.

• Il test di rilevazione CMV che permette la determinazione delle IgM e delle IgGanti-citomegalovirus nel siero umano.

• Il test di rilevazione EBV destinato alla diagnosi del virus di Epstein-Barr. Il testricerca gli anticorpi di tipo VCA IgM per diagnosticare le infezioni recenti, glianticorpi VCA/EA IgG e gli anticorpi EBNA IgG per la diagnosi delle infezionipiù vecchie.

• Il test di rilevazione degli anticorpi elettrofili IgM MNI nella mononucleosi in-fettiva da campioni di plasma, siero o sangue intero umano.

• Il test D-Dimer per l’esclusione della diagnosi dei trombi venosi profondi e delleembolie polmonari.

• I test per la determinazione quantitativa di farmaci in campioni di siero.

• Il test di rilevazione dell’antigene dello Streptococco di gruppo A da tamponifaringei.

• Il test di ricerca qualitativa degli antigeni di Helicobacter pyolori nelle feci umanee degli anticorpi nel siero o nel plasma.

• Il test di ricerca qualitativa delle IgM anti Mycoplasma pneumoniae nel siero.

• Il test di ricerca delle reagine luetiche nel siero (VDRL) utilizzato nell’accerta-mento della sifilide. Questo test consiste nella determinazione, mediante provedi flocculazione, dell’esatto titolo di anticorpi (reagine aspecifiche) antitrepone-ma presenti nel siero.

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3 ATTIVITÀ SVOLTE

• Il test LC-Partigen su saliva per la determinazione dell’albumina,α1-antitripsina,C1q e delle immunoglobuline IgA, IgD, IgM, IgG.

• Il test Waaler Rose, esame di emoagglutinazione su vetrino, per determinazioniqualitative di fattori reumatoidi nel siero umano.

• Il test Tacrolimus per la determinazione quantitativa di Tacrolimus in campionidi sangue intero umano. Il tacrolimus è un farmaco immunosoppressore effi-cace per il trattamento delle reazioni di rigetto degli organi in seguito a trapianti.

3 Attività svolte

La mia attività di tirocinio era suddivisa in due parti:

1. prima parte in sala prelievi in cui assitevo medici e infermieri

2. seconda parte in laboratorio in cui seguivo il lavoro di una biologa

3.1 Attività in sala prelievi

Il sistema informatico del Laboratorio è una parte essenziale per ottimizzare le attivi-tà. In ogni fase, dall’accettazione all’esecuzione fino alla validazione e stampa delreferto, permette di seguire i vari processi, di intervenire, di consultare e di confer-mare o correggere ogni dato analitico da qualsiasi postazione di lavoro.

In fase di accettazione il paziente, munito di impegnativa e tessera sanitaria, puòprenotare presso lo sportello gli esami richiesti. Gli esami da effettuare sono cari-cati all’interno della pagina specifica del paziente nel computer centrale. Il sistemaproduce inoltre etichette con codice a barre "intelligente", capace di gestire il diversotipo di campione del paziente e di svolgere per lui solo le analisi che sono state prece-dentemente caricate. Questa fase automatizzata permette la completa eliminazionedi tutti gli errori preanalitici. Tutti i settori sono dotati di strumenti automatici adalta tecnologia e collegati online al sistema informatico. I risultati dei test vengonoinviati dallo strumento e acquisiti dal computer centrale. Prima della trasmissionedel dato al referto, viene effettuato dall’Operatore, addetto a quella apparecchiatura,un primo controllo e, trasmesso il risultato, viene operato un controllo complessi-vo del referto. Per la validazione, il sistema informatico propone sempre i dati ed ireferti precedenti del paziente e segnala cromaticamente i valori fuori range o quel-li dubbi. A questo punto i risultati acquisiti delle analisi vengono stampati o iniviatidirettamente al medico curante.

Il mio lavoro in sala prelievi consisteva nella preparazione delle provette da asso-ciare a ciascun tipo di esame e la consegna del foglio indicante le modalità e il giornodi ritiro della risposta (cfr. Tabella 1). Il tempo di riposta delle analisi differisce in baseal tipo di esame, in modo particolare la risposta richiederà più tempo se il prelievodeve essere inviato ad altri laboratori.

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3.1 Attività in sala prelievi 3 ATTIVITÀ SVOLTE

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3.2 Attività in laboratorio 3 ATTIVITÀ SVOLTE

Questa prima fase è stata utile per riuscire a distinguere i vari tipi di esami che ven-gono effettuati e i vari settori in cui il laboratorio opera. Prima di passare in laborato-rio, insieme alla Dottoressa con la quale collaboravo ci occupavano delle spedizioni,preparavamo cioè gli esami che dovevano essere inviati al laboratorio di Civitanova,Macerata e Ancona.

3.2 Attività in laboratorio

In laboratorio ho prestato particolare interesse all’esame di rilevazione del Toxoplas-ma Gondii, agente patogeno della Toxoplasmosi, pericoloso se presente nel siero delledonne in gravidanza.

Ho focalizzato la mia attenzione su tre casi particolari ed esemplificativi.

3.2.1 Toxoplasma

Il Toxoplasma Gondii è il protozoo responsabile della Toxoplasmosi, una malattiainfettiva che può indurre patologie infettive neonatali se contratta in gravidanza.

Si tratta di un parassita intracellulare obbligato, di piccole dimensioni che esistein tre forme: la forma proliferativa o trofozoita, la cisti tissutale e l’oocisti. Questo mi-croorganismo compie una parte del suo ciclo vitale nell’ intestino del gatto, e quindi,una volta eliminato con le feci, può contaminare l’ ambiente circostante. L’ospitedefinitivo del Toxoplasma è il gatto, mentre mammiferi e uccelli costituiscono gliospiti intermedi.

La trasmissione diretta tra il gatto domestico e l’uomo non è molto frequente,viceversa il contagio avviene più comunemente grazie ad alimenti. L’uomo infat-ti può infettarsi ingerendo ortaggi crudi o mal lavati, per scarsa igiene delle mani,alimentandosi con carne cruda o poco cotta di animali infetti.

Rare sono le infezioni accidentali mediante contatto con materiale infetto e pene-trazione del parassita attraverso soluzioni di continuo delle cute.

Toxoplasma in gravidanza

Circa il 20 – 30% della popolazione ha avuto un contagio da Toxoplasma anche se nonha sviluppato la malattia in modo apparente. L’interesse clinico principale è per lapossibilità di contrarre la toxoplasmosi in gravidanza. La trasmissione del Toxoplas-ma dalla madre al feto si verifica essenzialmente per via ematogena transplacentare;infatti il parassita è in grado di superare la barriera placentare a condizione che la faseparassitemica sia di durata sufficiente (8-10 giorni).

La Toxoplasmosi può avere delle gravi ripercussioni sul benessere fetale. La proba-bilità che il feto ha di subire l’ infezione cresce con il progredire dell’ epoca di gravi-danza, mentre la gravità delle lesioni segue un andamento inverso ovvero è tanto mi-nore quanto più il contagio fetale è tardivo. Le conseguenze variano a seconda delperiodo gestazionale:

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• primo trimestre: il passaggio attraverso la placenta avviene in meno del 20% deicasi, ma può essere talora causa di aborto

• secondo trimestre: il feto viene infettato in circa un terzo dei casi. Possibiliconseguenze, non presenti in tutti i casi, sono idrocefalo (una patologia in cuiaumentano gli spazi liquidi nel cervello), calcificazioni cerebrali, ritardo men-tale, calcificazioni epatiche, corioretinite (=problemi agli occhi)

• terzo trimestre: il passaggio transplacentare avviene nel 65% dei casi, il neona-to potrà nascere apparentemente sano, ma portatore di una forma latente ditoxoplasmosi che si potrà manifestare a distanza di mesi o di anni sotto formadi lesioni discrete a carico dell’occhio (corioretiniti recidivanti), del SNC ( ri-tardi mentali , disturbi comportamentali) o sotto forma di epatosplenomegalia(=aumento di volume di fegato e milza)

Toxo-test

Essendo la toxoplasmosi un’infezione che decorre spesso in maniera asintomatica ocon sintomi di scarsa entità, la sua diagnosi si basa quasi esclusivamente su speci-fiche indagini di laboratorio. Il test per la toxoplasmosi si chiama Toxo-test e vieneeffettuato attraverso il prelievo del sangue.

Il toxotest va alla ricerca di specifici anticorpi (IgM-IgG) e consente di stabilire sesi è contratta o meno la malattia, se la malattia è stata superata, se è in atto o se èstata contratta di recente. Questi sono dati molto importanti nel caso di una donna ingravidanza. Il toxo-test rientra infatti nelle analisi di routine prescritte dai ginecologifin dall’inizio della gestazione (ancora meglio sarebbe sottoporsi al test prima di in-traprendere una gravidanza), al fine di scoprire nel sangue la presenza o meno deglianticorpi della toxoplasmosi. Se il soggetto risulta immune non occorrono ulterioriaccertamenti nel corso della successiva gravidanza; se invece i titoli anticorpali nonraggiungono livelli protettivi la paziente deve essere controllata periodicamente ognimese fino al momento del parto con indagini sierologiche, e deve osservare speci-fiche misure di profilassi. Se nel corso della gravidanza si verifica una sieroconver-sione, cioè un aumento del titolo di anticorpi IgG, è essenziale confermare l’avvenutainfezione mediante ricerca degli anticorpi di classe IgM e iniziare immediatamenteil trattamento. In caso di risposta positiva verrà valutato il rischio di infezione peril prodotto del concepimento in base all’anamnesi (epoca di gestazione) e con ladiagnosi prenatale. Quando l’indagine sierologia viene effettuata per la prima voltain corso di gravidanza è utile ricercare contemporaneamente gli anticorpi specifici ditipo IgG e IgM.

Metodica di laboratorio per la rilevazione della Toxoplasmosi

Il test di rilevazione della Toxoplasmosi è stato uno degli esami di cui mi sono occu-pata.

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Figura 1: strumento AxSYM

In laboratorio il test viene effettuato mediante lo strumento AxSYM (Figura 1).L’AxSYM TOXO IgM e TOXO IgG è un dosaggio immunoenzimatico a cattura di mi-croparticelle (MEIA) utilizzato per la determinazione degli anticorpi IgM e IgG controil Toxoplasma gondii in campioni di siero o plasma umano.

Per effettuare il test sono necessari i campioni e i reattivi. I reattivi sono conservatinella cella frigorifera del laboratorio. Ciascuna confezione di reattivo contiene:

• un flacone di microparticelle rivestite di T. gondii in tampone TRIS con stabiliz-zanti delle proteine. Conservanti: sostanze antimicrobiche.

• un flacone di anticorpi (capra) anti-IgM umane coniugate con fosfatasi alcalinain tampone TRIS con stabilizzanti delle proteine. Conservante: sodio azoturo.

• un flacone di diluente del dosaggio in tampone TRIS con stabilizzanti delle pro-teine. Conservanti: sostanze antimicrobiche.

• un flacone di tampone di neutralizzazione del fattore reumatoide, citrato. Con-servanti: sostanze antimicrobiche.

Prima di caricare i reattivi ci occupavamo di controllare la data di scadenza sulla con-fezione dei reagenti e di aprire il tappo del flacone. Fatto ciò era possibile inserire laconfezione dei reagenti in una posizione vuota del carosello dei reagenti.

A questo punto le provette dei campioni da analizzare venivano inserite negli ap-positi segmenti in dotazione, verificando che l’etichetta con il codice a barre iden-tificativo del paziente fosse posizionato in modo corretto per la lettura. Il suppor-to veniva posto nel carosello dei campioni. Per procedere con il test si premeva ilpulsante verde di “Avvio”.

Tutte le fasi della reazione sono gestite dallo strumento.

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Il campione e tutti i reagenti AxSYM TOXO IgM e TOXO IgM necessari per effet-tuare un test vengono dispensati dal puntale dell’area di campionamento in diversipozzetti della cartuccia di reazione situata nell’area di campionamento. La cartuc-cia di reazione viene trasferita immediatamente nell’area di processo, dove l’appositopuntale esegue ulteriori dispensazioni.

La reazione si svolge nel seguente ordine

1. AREA DI CAMPIONAMENTO:

• il puntale dell’area di campionamento diluisce il campione e dispensa un’ali-quota del campione diluito e delle microparticelle rivestite di T. gondii inun pozzetto di incubazione della cartuccia di reazione.

• Gli anticorpi anti-T. gondii si legano alle microparticelle rivestite di T. gondiidando luogo alla formazione di un complesso antigene-anticorpo.

2. AREA DI PROCESSO:

• Il diluente del dosaggio viene aggiunto alla miscela di reazione ed un’ali-quota del complesso antigene-anticorpo viene trasferita nella celletta a ma-trice. Le microparticelle si legano irreversibilmente alla matrice di fibre divetro.

• La celletta a matrice viene lavata con il tampone di neutralizzazione del fat-tore reumatoide per rimuovere dal complesso antigene-anticorpo gli even-tuali anticorpi che potrebbero dar luogo ad interferenza.

• La celletta a matrice viene lavata per rimuovere il materiale non legato.

• Gli anticorpi anti-IgM umane coniugati con fosfatasi alcalina vengono dis-pensati nella celletta a matrice e si legano al complesso antigene-anticorpo.

• La celletta a matrice viene lavata per rimuovere il materiale non legato.

• Il substrato 4-metil-umbelliferil fosfato viene aggiunto alla celletta a ma-trice ed il prodotto fluorescente viene misurato mediante il sistema otticoMEIA.

Lo strumento necessita di una manutenzione gionaliera che consiste nel:

• lavare l’interno del puntale

• vuotare il contenitore dei rifiuti monouso

• aggiornare l’inventario

• risciacquare a fine lavoro la pompa della soluzione 1

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(a) strumento VIDAS BIOMERIEUX

(b) Kit (c) cartuccia e cono

Figura 2: Strumento VIDAS

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Metodiche a confronto

Se il test effettuato con lo strumento AxSYM risulta positivo, potrebbe essere utile, alfine di una più precisa diagnosi, ripetere il test utilizzando una metodica differente.

Lo strumento utilizzato in questo caso è il VIDAS (cfr. figura 2a)Questo strumento esegue esami immunoenzimatici con la tecnica ELFA (Enzyme

Linked Fluorescent Assay) ovvero associa il metodo immunoenzimatico ad una rive-lazione finale in fluorescenza.

Lo strumento è composto da cinque sezioni (A, B, C, D, E). Ogni sezione ospita seicanali; in ogni canale si esegue un test.

Ogni sezione può essere impiegata per esami di un solo tipo: pertanto se per uncampione sono richieste 3 tipi di analisi, occorre utilizzare 3 sezioni diverse. Prima dieffettuare il test è essenziale che il campione, messo in routine nel computer centrale,venga trasmesso allo strumento, nel nostro caso VIDAS. Avvenuto ciò, lo strumento èin grado di riconoscere il campione e di effettuare l’esame per lui richiesto.

Tutto l’occorrente, per fare le analisi, si trova nel kit (cfr. figura 2b ).Il kit è composto da:

• 60 cartucce reattive pronte per l’uso

• 60 coni che fungono da puntale e da fase solida con adeso gli anticorpi. Og-ni cono è contrassegnato ed è importante estrarre dalla confezione solo i coninecessari e poi richiudere il sacchetto.

• Standard (1·1 ml) costituito da siero umano contenente IgM anti-toxoplsma +stabilizzante proteico + + 1g/ldi sodio azide

• Controllo positivo (1·2 ml) costituito da siero umano contenente IgM anti-toxo-plasma + stabilizzante proteico + 1g/ldi sodio azide

• Controllo negativo (1·2 ml) costituito da siero umano privo di IgM, anti-toxo-plasma + stabilizzante proteico + 1 g/l di sodio azide

• Scheda master lot

Per l’esecuzione di questo test ho prelevato i campioni di siero, non emolizzati enon contaminati, da analizzare e ho preparato le strip e i coni. Ogni campione hala propria strip e il proprio cono (cfr. figura 2c).

In questa prima fase manuale ho prelevato 100 µl di campione attraverso unapipetta con puntali monouso e l’ho depositato nella prima celletta della strip (car-tuccia).

Ho inserito nella sezione riservata da quella programmazione, tanti coni e tantestrip (con il siero/plasma già depositato) quanti sono i pazienti programmati, facendoattenzione che le posizioni concordino con la lista di lavoro e lasciando gli sportelliaperti fino all’ultimo momento.

Dopo aver controllato di aver messo i coni ho chiuso gli sportelli e avviato l’analisicliccando sul cerchietto azzurro della sezione di lavorazione. Nella barra in basso del

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POZZETTO REATTIVI

1 Pozzetto del campione

2Diluente del siero: tampone TRIS (50 mmol/l) pH 7,4 + stabilizzanti

proteici e chimici + 1g/l di sodio azide (300 µl)

3Tampone di prelavaggio: TRIS (50 mmol/l) pH 7,4 + stabilizzanti

proteici e chimici + 1g/l di sodio azide (600 µl)

4-5-7-8Tampone di lavaggio: TRIS (50 mmol/l) pH 7,4 + stabilizzanti proteici

e chimici + 1g/l di sodio azide (600 microlitri)

6Coniugato: immuno-complesso (antigene toxoplasmico-anticorpomonoclonale di topo anti-P30 marcato con fosfatasi alcalina + 1g/l

di sodio azide + Gentamicina allo 0,02% (400 µl)

9 Pozzetto vuoto

10Cuvetta di lettura. Substrato: 4 metil-umbelliferil fosfato + 1g/l di

sodio azide (300 µl)

Tabella 2: Tabella dei pozzetti e dei reattivi.

desktop, dove sono presenti le icone corrispondenti alle sezioni di lavoro, appare, perquelle in uso, la scritta “riservata” e l’orario di fine analisi. Al termine degli esami irisultati vengono stampati automaticamente e trasferiti al computer centrale.

Tutte le fasi della reazione sono gestite dallo strumento. Infatti, tutti i reattivinecessari sono già presenti nella cartuccia.

La cartuccia è costituita da 10 pozzetti ricoperti da un foglio di alluminio etichet-tato e sigillato. Sopra vi è stampato un codice a barre che corrisponde al tipo di testda effettuare, al numero di lotto utilizzato e alla data di scadenza della confezione.L’etichetta in corrispondenza del primo pozzetto è ritagliata per consentire l’intro-duzione del campione. L’ultimo pozzetto è una cuvetta ottica che consente la let-tura in fluorimetria. I pozzetti intermedi contengono i diversi reattivi necessari perl’analisi (cfr.Tabella 2).

Le fasi del test, successive alla prima di tipo manuale, consistono in una suc-cessione di cicli di aspirazione/rilascio della miscela di reazione. Dopo una fasi didiluizione del siero, le IgM sono catturate dall’anticorpo policlonale presente sullaparete del cono, quindi viene aspirato/rilasciato all’interno del cono. Le IgM anti-toxoplasma vengono rilevate specificamente dall’antigene toxoplasma inattivato, asua volta rilevato da un anticorpo monoclonale di tipo anti-toxoplasma coniugatocon fosfatasi alcalina. Nella fase finale il substrato (4-Metil-umbelliferil fosfato) vieneaspirato/rilasciato dal cono; l’enzima del coniugato ne catalizza l’idrolisi in un prodot-to fluorescente (4-Metil-umbelliferone). L’intensità della fluorescenza emessa è mis-urata a 450 nm. Il valore del segnale di fluorescenza è proporzionale alla concen-

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trazione degli anticorpi presenti nel campione. Al termine dell’esame, un indice iviene calcolato automaticamente dallo strumento in rapporto allo standard S1 inse-rito in memoria. Se i < 0,55 il risultato è negativo, dubbio se 0,55 < i < 0,65, positivo sei > 0,65.

Calibrazione strumenti

Un aspetto molto importante da non trascurare è la calibrazione dei nuovi lotti.In laboratorio ho effettuato più calibrazioni su lotti diversi e su strumenti diversi.

Calibrazione AxSYM Toxo IgM Tramite gli schermi Calibrazione e Tipo calibra-zione presenti sullo strumento si possono richiedere le seguenti calibrazioni: stan-dard (su 6 punti), principale (su 2 punti).

Scelto il tipo di calibrazione si dispensava il calibratore nella posizione del seg-mento indicata dalla lista richieste. Dopo la dispensazione, il calibratore veniva ripos-to in frigorifero. Il calibratore veniva caricato in qualsiasi posizione sul carosello deicampioni. Al termine della calibrazione sul menu “risultati”, “Rivedi calibrazione”,“visualizza curva di calibrazione” si poteva verificare l’esito della calibrazione e pro-cedere alla stampa. L’AXSYM esclude automaticamente la calibrazione se non rientranei limiti preimpostati.

Per l’esecuzione del Controllo di qualità interno si utilizzano i controlli (positivo enegativo) forniti dalla Ditta Abbott. Questi sono conservati in frigorifero.

Calibrazione VIDAS Toxo IgM Ogni qual volta si apriva un nuovo lotto, prima dieseguire le analisi, venivano registrate nello strumento VIDAS, tramite la schede MLE(scheda delle specifiche acclusa ad ogni confezione), le specifiche del lotto. Se questaoperazione non viene fatta, lo strumento non può eseguire le analisi.

La scheda MLE veniva posizionata nell’apposito supporto di plastica con il codicea barre rivolto verso l’alto. Successivamente il supporto veniva introdotto in unoscomparto delle cartucce. Per la lettura delle specifiche il tempo necessario è di cir-ca 3 minuti. Al termine della registrazione venivano raffrontate le informazioni vi-sualizzate sullo schermo con quelle indicate sulla scheda. Le specifiche venivanomemorizzate solo se i dati coincidevano.

In ogni confezione VIDAS TOXO IgM sono inclusi un controllo positivo, uno nega-tivo e uno standard che serve per aggiustare la calibrazione. Lo standard S1 vieneanalizzato in doppio rispetto ai controlli positivo (C1) e negativo (C2).

I controlli devono essere utilizzati all’apertura di ogni nuova confezione al fine diverficare che i reattivi non siano alterati.

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IgM IgG Interpretazione

- - nessuna infezione

+ - infenzione recente

+ + infezione recente

- + immunità (infezione passata)

Tabella 3: Tabella dei risultati del Toxo-test

Casi di Toxoplasmosi

In laboratorio ho avuto la possibilità di esaminare tre casi esemplificativi di Toxoplas-mosi. Prima di procedere con la loro descrizione è bene riportare l’interpretazionedei possibili risultati (cfr. Tabella 3).

Gli anticorpi IgM sono i primi, dopo quelli IgA, che compaiono in seguito ad un’in-fezione. L’espressione di questi anticorpi ad un livello elevato in assenza di IgG è in-dice di infezione attiva, per cui è necessario sottoporsi a terapia, durante la gravi-danza. L’espressione di bassi livelli di IgM in concomitanza ad alti livelli di IgG puòsignificare che l’infezione è pregressa. L’espressione degli anticorpi IgG in asssenzadi anticorpi di tipo IgM garantisce l’immunità dalla malattia. In questa situazionenon c’è alcun pericolo per il feto durante tutta la gravidanza. Un’ulteriore ausilio allavalutazione della condizione immunitaria nei confronti della toxoplasmosi può es-sere fornito dal dosaggio delle IgA. Normalmente questa classe di anticorpi compareprecocemente e scompare dopo 6 – 9 mesi; la contemporanea presenza di IgM edIgA indica quasi con certezza una infezione recente. Purtroppo le IgA non sempresono prodotte dall’organismo ovvero non sempre sono identificabili e ciò le rendeuna diagnostica non di prima scelta. La presenza di anticorpi di tipo IgG, con IgMnegative, indica che la donna è immune. L’immunità per la toxoplasmosi permanetutta la vita.

Se si ha una sieroconversione in gravidanza, cioè compaiono anticorpi specificidi tipo IgM in una donna precedentemente negativa, si devono fare altri esami perescludere il passaggio del protozoo al feto.

Primo caso Nel primo caso la signora C.D., alla ventiduesima settimana di gravi-danza, richiede in data 17/09/2010 l’esame per la Toxoplasmosi.

I risultati dell’esame indicano una positività sia per le IgG che per le IgM. Sullabase di tali risultati si può constatare la presenza di un’infezione recente. In questocaso però è importante datare l’evento infettivo cioè identificare, con maggiore pre-cisione possibile, quando è stato il momento in cui è avvenuta l’infezione stessa.

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In sostanza è necessario capire se l’infezione è avvenuta prima della gravidanza odurante la gravidanza.

In questo caso, sfogliando la cartella clinica della paziente, si è visto che questaaveva già effettuato il test per la Toxoplasmosi nel febbraio 2007. Anche in quella datail risultato del test era positivo sia per le IgM che per le IgG.

In questo caso si esegue il "test di avidità delle IgG". Questo test si basa sul fat-to che le IgG che si formano nelle fasi iniziali dell’infezione hanno poca affinità conl’antigene, si legano poco e possono essere rimosse tramite lavaggio con urea: tantopiù l’avidità delle IgG sarà bassa tanto più recente sarà l’infezione.

Un’alta avidity (superiore a 0,35) è indicativa di infezione passata, cioè il sistemaimmunitario si è "allenato" a riconoscere il suo antigene e quindi l’affinità di legame èpiù alta. Viceversa, una avidity bassa (compresa fra 0,00-0,29) è indicativa di infezionerecente.

Il test dell’Avidity delle IgG anti-Toxoplasma aveva dato un risultato pari a 0,39.Questo valore di avidità conferma l’indicazione di infezione passata. In conclusione irisultati ottenuti nel 2007 indicano un’infezione acquisita oltre i 6 mesi precedenti ladata del prelievo ed essendo la signora alla 22° settimana di gravidanza, ciò escludequalsiasi tipo di patologia nel neonato.

Il test effettuato nel 2010, anche se positivo è indice di un’infezione passata. Inquesto caso il test dell’avidity non è stato ripetuto, perchè già affettuato nell’anno2007. La positività è da ricollegare al fatto che gli anticorpi IgM possono persistereper molto tempo, accompagnati da titoli medio-elevati di IgG.

Secondo caso Nel secondo caso la signora M.A., alla tredicesima settimana digravidanza, richiede in data 24/08/2009 l’esame per la Toxoplasmosi.

I risultati dell’esame indicano una positività sia per le IgG che per le IgM. Anche inquesto caso si può constatare la presenza di un’infenzione recente.

L’approccio analitico più affidabile è quello basato sulla determinazione dell’avidi-tà delle IgG specifiche. Il test dell’avidity, a differenza del caso precendente, dà unvalore pari a 0,24 (valore basso). Tale valore è indicativo di un’infezione recente, ac-quisita entro i due mesi precedenti la data del prelievo. A questo punto è necessarioconfrontare tale dato con l’inizio della gravidanza. La signora M.A. trovandosi alla13° settimana di gravidanza potrebbe avere la toxoplasmosi in atto ma soprattutto hacontratto la toxoplasmosi durante la gravidanza.

Terzo caso Nel terzo caso la signora T.B., non in gravidanza, richiede in data12/07/2010 l’esame per la Toxoplasmosi.

I risultati dell’esame indicano una positività sia per le IgG che per le IgM. Anche inquesto caso è essenziale il test dell’avidità per riuscire a datare l’infezione.

Il test dell’avidity, a differenza del caso precendente, dà un valore pari a 0,17 (valo-re basso, ancora più basso del caso precedente). Tale valore stabilisce che l’infezioneda Toxoplasma è in atto; in ques’ultimo caso però la paziente non essendo in gravi-danza non corre il rischio di complicazioni fetali.

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3.2.2 Helicobacter pylori

L’Helicobacter pylori (Hp) è un batterio dalla caratteristica conformazione a spirale; iltermine helicobacter significa appunto "batterio a forma di spirale", con pylori invecesi indica il sito dove il batterio si stabilisce con più facilità: il piloro, ovvero la porzioneterminale dello stomaco.

È un batterio microaerofilo, perciò per la sua sopravvivenza richiede dell’ossigeno,ma in piccole quantità.

Questo batterio è capace di causare una infiammazione della mucosa gastrica(gastrite) e delle ulcere.

Il succo gastrico è composto da acido cloridrico concentrato ed enzimi digestivi,che possono sciogliere rapidamente anche i cibi più duri o i microrganismi più re-sistenti, ciò faceva pensare che lo stomaco fosse un ambiente sterile. La scoperta dell’Helicobacter pylori ha modificato questa convinzione.

L’ Helicobacter pylori, ha un modo tutto particolare di adattarsi all’ambiente in-ospitale dello stomaco: lo stomaco è protetto dal suo stesso succo gastrico, da unospesso strato di muco che ricopre la mucosa gastrica, e l’Helicobacter pylori approfit-ta di questa protezione, vivendo e moltiplicandosi proprio nello strato mucoso. Alriparo dal succo gastrico, neutralizza poi l’acido che riesce a raggiungerlo, medianteun’ enzima che possiede, chiamato "ureasi". Un’altra difesa dell’Helicobacter py-lori consiste nel fatto che le difese immunitarie naturali dell’organismo, non possonoraggiungerlo nel muco gastrico.

I pazienti che ospitano l’organismo si dividono in due gruppi essenziali. Il primogruppo non mostra segni o sintomi di malattia gastrointestinale e viene considera-to come “colonizzato”. Il secondo gruppo mostra segni e sintomi gastrointestinali eviene considerato come “infetto”.

Si ritiene che l’Hp si trasmetta per via oro-fecale, in seguito all’ingestione di ci-bo o altro materiale contaminato con materiale fecale. E’ inoltre possibile che l’ Hp,risalendo dallo stomaco alla bocca in seguito a reflusso gastro-esofageo, possa trasmet-tersi anche tramite contatto orale.

Test diagnostici

I test diagnostici per la rilevazione dell’H. pylori possono essere classificati come in-vasivi o non invasivi.

In laboratorio mi sono occupata più volte del test rapido ImmunoCard STAT! HpSaper la ricerca qualitativa degli antigeni di H. pylori nelle feci umane (cfr. figura 3a).

Il test utilizza un anticorpo monoclonale anti-H. pylori sia come anticorpo di rile-vazione che come anticorpo di cattura.

Prima di effettuare il test è necessario avere a disposizione tutto l’occorente neces-sario.

Il materiale fornito consiste di un dispositivo per il test e un diluente.Il dispostivo è una membrana cromatografica contenuta in una cassetta di plas-

tica e racchiusa in una confezione singola di alluminio con essicante. La membrana

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(a) Test

(b) Procedimento

Figura 3: Test rapido immunocard STAT! HpSa

contiene un anticorpo di cattura monoclonale anti-H. pylori per il test e una proteinaanimale per il controllo.

La membrana contiene anche anticorpi anti-H. pylori coniugati con lattice rossoed anticorpi anti-proteina coniugati con lattice blu che servono per rilevare il risulta-to.

Il diluente, che serve per diluire il campione, consiste in una soluzione salina tam-ponata contenente sodio azide e viene fornito in un flacone contagocce monouso diplastica con tappo rosso.

Metodica di laboratorio per la rilevazione dell’ Helicobacter pylori nelle feci

Per effettuare il test ho utilizzato un dispositivo test ImmunoCard STAT! HpSa perogni campione di paziente. Rimosso il dispositivo dalla confezione di alluminio, laprima cosa da fare è etichettare il dispositivo con il numero che identifica il paziente,in modo da evitare qualsiasi tipo di errore come quello di scambio dei campioni.

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A questo punto il campione deve essere trasferito nel flacone del diluente.Per far questo ho aperto il contenitore a tenuta d’aria, dove è conservato il campio-

ne, e usando il bastoncino applicatore inserito nel cappuccio del flacone del diluentedel campione ho trasferito una piccola parte di feci nel diluente.

Ho chiuso accuratamente il flacone e ho agitato quest’ultimo al vortex per 15 secon-di in modo da sospendere il campione fecale nel diluente del campione.

Munita di carta assorbente, per evitare schizzi, ho rotto la punta del flacone deldiluente.

Tenendo il flacone del diluente in posizione verticale, ho dispensato 4 gocce delcampione nel pozzetto circolare indicato con una freccia. Qualora il dispositivo peril test non assorbe prontamente il campione diluito, si può prelevare il campione conuna pipetta, toccare con quest’ultima il fondo del pozzetto, in modo da muovere leparticelle solide delle feci che potrebbero impedire l’assorbimento e dispensare dinuovo il campione prelevato.

Infine, per vedere i risultati è necessario incubare il test per 5 minuti.Passati i 5 minuti è possibile leggere direttamente dal test il risultato.Il risultato del test è negativo se nella finestra centrale del dispositivo accanto alla

lettera “C” compare una sola linea di colore blu. Questo significa che gli antigeni H.pylori sono assenti o al di sotto del livello di rilevazione.

Il risutalto del test è positivo se nella finestra centrale del dispositivo comparechiaramente, oltre alla linea di colore blu, una linea rosa-rossa accanto alla lettera“T”.

L’intensità della linea dipenderà dalla concentrazione degli antigeni presenti nelcampione.

E’ da ricordare infine che il test è di tipo qualitativo e quindi non si devono for-mulare interpretazioni quantitative dei valori ottenuti in base all’intensità della lineapositiva (cfr. figura 3b).

Altri test diagnostici

Un altro test diagnostico per la rilevazione dell’ Helicobacter pyolori è il test qualita-tivo VIDAS H. pylori IgG (HPY). Questo test è automatizzato dallo strumento VIDAS epermette la ricerca degli anticorpi IgG anti-Helicobacter pylori nel siero o nel plasmaumano, non emolizzato o contaminato, con la tecnica ELFA.

Ogni test richiede un cono e una cartuccia HPY.Per effettuare il test è necessario distribuire 100 µl del campione nel primo pozzet-

to della cartuccia.A questo punto i coni e le cartucce possono essere inseriti nello strumento, nel-

la postazione destinata al test. E’ importante controllare la concordanza dei codici(colori e lettere) dei coni e delle cartucce.

Si può quindi avviare l’analisi . Tutte le fasi del procedimento vengono gestiteautomaticamente dallo strumento e al termine del test, dopo 35 minuti, i risultati

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vengono analizzati automaticamente dallo strumento che calcola e stampa il valoredel test.

3.2.3 Tempo di protrombina (PT) e tempo di tromboplastina parziale (PTT)

I test attualmente utilizzati per valutare l’efficienza della coagulazione sono:

• PT: tempo di protrombina

• PTT: tempo di tromboplastina parziale

Prima di effetttuare questi tipi di test i campioni di sangue venivano opportunamentecentrifugati.

Tempo di protrombina Il tempo di protrombina misura il tempo, espresso insecondi, necessario alla formazione del coagulo di fibrina quando al plasma del pazien-te (raccolto con anticoagulante citrato di sodio) si aggiungono tromboplastina e cal-cio. Il tempo di troboplastina parziale (PTT) è un ulteriore esame per valutare la nor-malità del processo di coagulazione del sangue in rapporto a un sangue normale diriferimento.

Il PT è un esame utile per lo screening di disturbi della coagulazione in varie con-dizioni acquisite ( carenza di vitamina K, epatopatie, CID). Il PT viene anche impie-gato per controllare la terapia con anticoagulanti cumarinici.

Il PTT indaga principalmente il corretto funzionamento della via intrinseca dellacoagulazione ed è utile inoltre per il monitoraggio della terapia eparinica.

Il range terapeutico del PT dipende dalla tromboplastina utilizzata in ogni labora-torio.

Il rapporto internazionale normalizzato (INR, valore normale 0,9-1,1) è stato in-trodotto dalla WHO per standardizzare internazionalmente il controllo della terapiaanticoagulante.

Il valore di INR è calcolato dal tempo di coagulazione del paziente. Nel calcoloviene incluso il valore di ISI. I produttori calcolano l’ISI (International Sensivity Index)in base alla tromboplastina standard internazionale. In questo modo, le differentisensibilità dei reagenti presenti in commercio sono compensate.

Per trovare l’INR si divide il tempo di coagulazione del paziente per il tempo dicoagulazione di un individuo sano (valore normale o controllo). Il ratio calcolato rap-presenta l’aumento del tempo di coagulazione del paziente rispetto a quello dell’in-dividuo sano. Tuttavia, poiché la sensibilità delle diverse tromboplastine è differente(dovuto alla loro origine), deve essere tenuto in considerazione il fattore di sensibilità(ISI). L’ISI è l’esponente al quale deve essere elevato il ratio (cfr. formula1).

INR =

[PT del paziente (sec)

PT controllo (sec)

]ISI(1)

Un valore normale di INR è compreso fra 0,9 e 1. Un individuo che non fa uso difarmaci anticoagulanti orali ha tipicamente un INR pari a 1. Un valore di INR pari a

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2 si traduce in un tempo di coagulazione raddoppiato rispetto al normale. Di con-seguenza, un INR pari a 3 è indice di un tempo di coagulazione triplicato rispettoal normale. Minore è il valore dell’INR maggiore è la viscosità del sangue e minoreè il tempo necessario a coagulare. Maggiore è l’INR, più tempo impiega il sangue acoagulare e maggiore è la sua fluidità, esponendo il soggetto al rischio di emorragie.In conclusione: maggiore è il valore di INR, maggiore è il tempo di coagulazione, piùè difficile la coagulazione.

Tempo di tromboplastina parziale Per effettuare questo test il plasma viene in-cubato per 3 min con un reagente che fornisce il fosfolipide procoagulante e una pol-vere tensioattiva (p. es., silicio micronizzato). Si aggiunge quindi Ca e si valuta il tem-po di coagulazione. (Dal momento che i reagenti in commercio e la strumentazionevariano notevolmente, ciascun laboratorio deve determinare il proprio range di nor-malità; di regola da 28 a 34 sec). Il PTT è sensibile a deficit di circa il 30-40% di tuttii fattori della coagulazione eccetto che per i fattori VII e XIII. Con rare eccezioni, unrisultato normale esclude l’emofilia. L’eparina prolunga il PTT e quest’ultimo vieneutilizzato spesso per il monitoraggio della terapia eparinica. Un tempo prolungatopuò anche essere causato da un deficit di uno o più fattori della coagulazione o dallapresenza di un inibitore di un fattore della coagulazione.

Controllo calibrazione strumento BCT

In laboratorio ho seguito il lavoro di ricostituzione del pool normale e patologico.Per far ciò abbiamo preso e separato i PT di tre giorni di prelievo. Li abbiamo

conservati all’interno di contenitori per le urine e poi separati in aliquote.Le aliquote preparate sono state poi poste in congelatore ad una temperatura di

-80°C.Queste possono essere utilizzate per due-tre mesi, fino all’esaurimento dell’aliquo-

ta stessa.Per il PT, PTT ci sono due sturmenti in laboratorio, uno dei quali collegato ad un

computer centrale, l’altro, di cui è stata sempre fatta la calibrazione, viene utilizzatoqualora il primo non funzionasse.

Una volta fatta la calibrazione il pool preparato viene fatto testare per cinque volte.Successivamente si calcola la media e con una proporzione si crea il range all’in-

terno del quale i valori patologici e normali devono stare.Ciò viene fatto per il PT, il PTT e il fibrinogeno al fine di ottonere una gamma di

valori accettabili.

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Relazione Tirocinio Analisi Sierologiche

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