RACCOMANDAZIONI PER LA GESTIONE DEI FALSI POSITIVI (FP) … · 2018-09-13 · 4 II. FALSI POSITIVI...

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1 Position Paper GdS MM SIPMeL Francesca Veneziani, Gianni Antonio Galli, Lucia Malloggi, Marco Moretti, Margherita Morandini, Massimiliano Manno, Maria Aurora Burgio, Elisabetta Stenner, Giulio Marino, Dina Di Maria, Deborah Mazzei, Daniela Rubin, Matteo Cassin, Alessio Gamboni e Piero Cappelletti, a nome del Gruppo di Studio sui Marcatori Miocardici (GdS MM) della Società Italiana di Patologia Clinica e Medicina di Laboratorio (SIPMeL) RACCOMANDAZIONI PER LA GESTIONE DEI FALSI POSITIVI (FP) E DEI FALSI NEGATIVI (FN) DI TROPONINA (CTN) I. Introduzione: cosa intendiamo quando parliamo di specificità della cTn 1. Le troponine sono cardio-specifiche. 2. Specificità clinica di cTn. 3. Specificità analitica di cTn. II. FALSI POSITIVI E FALSI NEGATIVI DI TROPONINA. 1. Le dimensioni del problema. 2. Elenco ragionato dei FP/FN di troponina 3. Come comportarsi in presenza di un possibile FP/FN di troponina? III. RACCOMANDAZIONI PER LA MINIMIZZAZIONE DEL RISCHIO DI FP/FN DI TROPONINA 1. Metodologia 2. Raccomandazioni per la prevenzione e correzione di FP/FN di cTn 3. Schema d’azione IV. BIBLIOGRAFIA I. INTRODUZIONE: cosa intendiamo quando parliamo di specificità della cTn. Quando parliamo di “specificità” di cTn, dobbiamo distinguere bene se parliamo di specificità tessutale (sono le cTn cardio-specifiche?), di specificità clinica (individua la cTn i pazienti sani rispetto alla patologia ischemica?) o di specificità analitica (i metodi di cTn sono interferiti?). 1. Le troponine sono cardio-specifiche. La specificità tessutale assoluta di cTnI è data dalla sua genetica: 3 geni codificano per le 3 isoforme di cTnI cardiaca, muscolo-scheletrica veloce e muscolo-scheletrica lenta. Il gene per la cTnI cardiaca è posizionato sul cromosoma 19 (19q13.4) ed è costituito da 6 esoni e 7 introni. L’esone 3 è assente nei geni della cTnI scheletrica; esso determina gran parte del domain N-terminale, specifico della cTnI cardiaca, che è una proteina di 209 aa con massa molecolare di 24 kDa [1].

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PositionPaperGdSMMSIPMeLFrancescaVeneziani,GianniAntonioGalli,LuciaMalloggi,MarcoMoretti,Margherita

Morandini,MassimilianoManno,MariaAuroraBurgio,ElisabettaStenner,GiulioMarino,DinaDiMaria,DeborahMazzei,DanielaRubin,MatteoCassin,AlessioGamboniePieroCappelletti,anomedelGruppodiStudiosuiMarcatoriMiocardici(GdSMM)dellaSocietàItalianadi

PatologiaClinicaeMedicinadiLaboratorio(SIPMeL)

RACCOMANDAZIONIPERLAGESTIONEDEIFALSIPOSITIVI(FP)EDEIFALSINEGATIVI(FN)DITROPONINA(CTN)

I.Introduzione:cosaintendiamoquandoparliamodispecificitàdellacTn

1.Letroponinesonocardio-specifiche.

2.SpecificitàclinicadicTn.

3.SpecificitàanaliticadicTn.

II.FALSIPOSITIVIEFALSINEGATIVIDITROPONINA.

1.Ledimensionidelproblema.

2.ElencoragionatodeiFP/FNditroponina

3.ComecomportarsiinpresenzadiunpossibileFP/FNditroponina?

III. RACCOMANDAZIONI PER LA MINIMIZZAZIONE DEL RISCHIO DI FP/FN DITROPONINA

1.Metodologia

2.RaccomandazioniperlaprevenzioneecorrezionediFP/FNdicTn

3.Schemad’azione

IV.BIBLIOGRAFIA

I.INTRODUZIONE:cosaintendiamoquandoparliamodispecificitàdellacTn.

Quandoparliamodi“specificità”dicTn,dobbiamodistinguerebeneseparliamodispecificitàtessutale(sonolecTncardio-specifiche?),dispecificitàclinica(individualacTnipazientisanirispettoallapatologiaischemica?)odispecificitàanalitica(imetodidicTnsonointerferiti?).

1.Letroponinesonocardio-specifiche.

Laspecificità tessutaleassolutadi cTnIèdatadalla suagenetica:3geni codificanoper le3isoformedicTnIcardiaca,muscolo-scheletricaveloceemuscolo-scheletricalenta.Ilgeneperla cTnI cardiaca è posizionato sul cromosoma 19 (19q13.4) ed è costituito da 6 esoni e 7introni.L’esone3èassenteneigenidellacTnIscheletrica;essodeterminagranpartedeldomainN-terminale, specifico della cTnI cardiaca, che è una proteina di 209 aa conmassamolecolaredi24kDa[1].

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LastoriadellaspecificitàtessutaledicTnTèpiùdinamica.Anchequi3geniper3isoforme.Ilgenedell’isoformacardiacaèpostosulcromosoma1(1q32.3)edècostituitoda17esonie16introni chedannoorigineadunaproteinadi287aaedi35.9kDa.Lo splicing alternativoel’esoneattivosolonelleformeembrionalideterminanopiùisoforme(da1a4)nelmiocardiofetaleeincorsodimalattiamuscolare[1].

Giàconiltestdi2°generazione,cheutilizzalacoppiadianticorpiM11.7eM7,fudimostratalacardio-specificitàdelleisoformecardiachedicTnTeladiversitàinmassamolecolaredelleforme ri-espresse inMalattia Renale Cronica [2]. L’aumento di cTnT inmalattia renale [3],forse legata al catabolismo renale dei frammenti di cTnT circolanti [4], potrebbe essereutilizzata sotto il profilo diagnostico in questa situazione clinica (aumentata sensibilitàclinica)[5].Recentementesonostatesegnalatealcuneaspecificitàlegateallari-espressionediformefetaliinmalattiemuscolari[6],dicuitenerconto.

2.SpecificitàclinicadicTn.

Per specificità clinica di un marcatore miocardico di Sindrome Coronarica Acuta (SCA) siintende,perdefinizione,lacapacitàdiidentificareisoggettinonaffettidapatologiaischemica.Manoncideveattenderedalmarcatoretroponinicoquellochenonpuòdareecioèl’etiologiadel danno miocardico, come chiarito dalle definizioni di Infarto del Miocardio (IMA)succedutesidal2000finoallarecentissimadel2018[7].

I livellidicTnnonsono,dasoli, ingradodi identificarecondiagnosidifferenziale ipazienticonpatologia cardiaca, perchénon èunmarcatoredi ischemia, chenon esiste [8],ma solol’entitàdeldannomiocardico.Altrimarcatori,comeCK-MBmassa,“sembravano”piùspecifici,solo perché erano meno sensibili e quindi “vedevano” solo i danni più eclatanti di naturaischemica [9].Questo concetto ampiamente descritto nella definizione di IMA del 2018 [7],peraltro,eragià insitonellaprimadefinizionediSCA/IMA: la troponinasvelasolo ildannomiocardico,l’origineischemicadeveessereprovatoconaltrimezzi(ECG,Eco,imaging,provedasforzo,ecc.).

3.SpecificitàanaliticadicTn.

SedunquesappiamochecTnètessuto-specificamanonpatologia-specifica,quandoparliamodi FP/FN facciamo riferimento agli aspetti analitici, cioè alle possibili interferenze chelimitano la capacità dei metodi immunologici sandwich (quelli utilizzati nella pratica) diidentificaresololamolecoladicTn.

Tuttelesuccessivegenerazioni(siamoalla5°)deimetodipercTnTsibasanosull’usodeglianticorpi di cattura M7 MAb (che riconosce l’epitopo definito dagli aminoacidi 125-131della porzione centrale della molecola, dedicata al legame con la tropomiosina) e dirivelazioneM11.7MAb(chericonoscel’epitopodefinitodagliaminoacidi136-141,sempredeldomaincentrale)[10].

Viceversa,lagrandevariabilitàanaliticadeglioltre20metodipercTnI[10,11]deriva:

1) dai diversi anticorpi scelti: nonostante le indicazioni delle specifiche di qualità IFCC2001diprivilegiareepitopidipartestabile(aa30-110)siassisteadunadispersionedeisitiepitopicisceltidaivariproduttori;inaggiuntalamaggiorpartedelleDitteusa1

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anticorpo di cattura e 1 anticorpo di riconoscimento mentre ormai la letteraturascientifica suggerisce la formula “2+2”: 2 anticorpi di cattura e 2 anticorpi diriconoscimento;

2) daldiversodisegnodel test(potenziamentosegnale;volumi; tempidi incubazione)edai diversi segnali utilizzati (spettrometria, fluorescenza, chemiluminescenza,elettrochimica);

3) dalla diversa sensibilità alle diverse forme di rilascio (complesso ternario TIC,complesso binario IC predominante, forme libere): non esistono informazioniesaustivesuqualiformeeinchepercentualevenganoriconosciutedaidiversikiteselacalibrazioneavvenga,comerichiestodallespecifichediqualitàIFCCdel2001,controunmixrappresentativoditutteleformecircolantipossibili;

4) dalle modificazioni post-traslazionali quali la fosforilazione dei residui serinici22/23 e 41/42, l’ossidazione dei gruppi SH delle cisteine 80 e 97, la produzione diframmenti(inletteraturasitrovanosegnalazionidiproduzioneda8a11frammenti)eproteolisi.

Il tentativo di rendere omogenei i test per cTnI passa attraverso lo sforzo diStandardizzazione operato da AACC e NIST (National Institute for Standardization andTechnology) che ha portato nel passato all’individuazione di un materiale di riferimento(standard referencematerialSRM 2921) contenente complesso TIC, la cui applicazione hadimostratodidiminuirelavariabilitàdeikitpercTnIda20-40voltea2-5volte[12,13].UnWorking Group-IFCC sta provando da tempo a produrre un materiale di riferimentosecondariocommutabile[14],mairisultatisi fannoattendereancheperchéSRM2921hamostrato limiti di conservabilità e di degradazione, al punto chemolti Autori consideranol’impresa dell’armonizzazione e standardizzazione dei metodi cTnI non raggiungibile eauspicanopiuttostosemplificazioniedunificazionimetodologicheattuatedalmercato.

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II.FALSIPOSITIVIEFALSINEGATIVIDITROPONINA.

1.Ledimensionidelproblema.

Ladeterminazionediquantisianonellarealtàdi tutti igiorni iFP/FNanaliticidicTnnonèfacile. Infatti, se consultiamo la letteratura specifica delle diverse causedi FP/FN, dovremoconcludere che la dimensione del problema dovrebbe essere rappresentata da unapercentuale a 2 cifre per anno, dato che le cause principali per FP (emolisi, fibrina,interferenze immunologiche) e per FN (emolisi, fibrina, autoanticorpi) assommateraggiungerebberounaincidenzasuperioreal10%.InLaboratorichefannotra5.000e50.000cTn/anno,cherappresentanol’83%delcampionedellaIVIndaginesuiMarcatoriMiocardicidi GdS MM SIPMeL [15], sarebbero da 500 a 5000 casi di interferenza/anno. Tuttavia, inletteraturasitrovanoindicazionidisintesidiFP/FNinferiorioviciniall’1%[16,17].Anche nella IV Indagine del GdS MM [15] il 35% dei rispondenti ne percepisce meno di6/anno, il 47% tra 10 e 50/anno e solo il 18% più di 100/anno, indipendentemente dallaquantità totale di cTn eseguite per anno e dal tipo di strumentazione utilizzata. Un solorispondente cita 10% di interferenze per anno. Gli altri percepiscono un’incidenzaprevalentemente intorno allo 0.1% (Figura 1). Quindi, nella pratica, le interferenze dirilevanzaclinicasonorare,anchesevannoriconosciuteperchépotenzialmentepericolose.

Figura 1. Numero di casi di FP/FN di troponina stimati/misurati e percentuali dirispondentinellaIVIndagineGdSMM[15].Quali sono le ragioni della discrepanza tra potenziali incidenze e reali criticità?Innanzitutto, la maggior parte delle possibili cause induce variabilità non clinicamenterilevantiorilevate(cioènonmis-classificanoipazienti)equindi ilclinicononlesegnala; insecondoluogo,ilmiglioramentotecnicodeikit(sostanzeproteggenti)eildisegnodeimetodiad alta sensibilità ha oggettivamente minimizzato l’impatto dei FP/FN; in terzo luogo, ilcorrettoutilizzodimetodiestrumenti(manutenzioni,calibrazioni,controlli)edeicampioni

da 1 a 3

10

50

250

2715,515,5

238

43,53,5

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(matriceadeguata;controllodell’integritàequalità)eliminaallabasebuonapartedellecausediinterferenza;infine,lecTnsonodisolitorichiesteinseriepercogliereilriseandfalldiIMAequindil’eventualevaloreanaliticamenteanomalovienevalutatonelcomplessodeiprelieviripetuti.

2.ElencoragionatodeiFP/FNditroponina

Tenuto conto delle caratteristiche fisiologiche (età, genere, attività fisica) e patologiche(malattie cardiologiche ischemiche e non, acute e croniche; patologie non primitivamentecardiologiche) del paziente e di quelle analitiche del test (variabilità analitica, variabilitàbiologica,differenzeIvsTefralaventinaditestcTnI)iFP/FNanaliticipossonoaverecausediverse.

PRE-ANALITICHE

A)Paziente

1. Supplementazionedibiotina(vitaminaB7).Puòarrivarea100-300mgpergiornoinalcunemalattiespecifichecomelaSclerosiMultipla(MS)conbiotinacircolantefinoa1200ng/mL.Labiotinainterferisceconilsistemastreptavidina-biotinausatoinmoltitestimmunometriciperpotenziareilsegnaleconeffettidiFPneimetodicompetitivieFN inquelli sandwich. Sono state riportate interferenzeFN (-37%)nelmetodoLOCISiemensoltrei300ng/mL[18];Abbotthainseritocorrettivifinoa1000ng/mL[19].FDA il 28 novembre 2017 ha emesso uno specificowarning[20]. Poiché si tratta disituazionimoltorare,Dorizzi[21]suggeriscediintercettareipazienticonosciuticomesupplementati di B7 a livelli pericolosi e di applicare correttivi (per esempiosospenderequalchegiornoleassunzionimassiccedibiotinaoppureutilizzaremetodiconseparazionemagnetica).

2. Digiuno/lipemia.Nonvisonodatisull’effettodelmancatodigiuno(lightmeal)macisonosull’effettodellalipemiaequindidipendedallecaratteristichedelpaziente[22].La lipemia interferisce con l’apparato strumentale (difficoltà di aspirazione) e peralterazionedelvolumedisponibileper i substrati (FN).Nonsipuòusare ilLipoclearperché non vi è accettabile recupero di cTn [23];meglio l’ultracentrifugazione [24];oppure,ripetereilprelievoincondizionipiùfisiologiche(sepossibile).Sonosituazionirare.

3. Iperfosfatasemiaalcalina.Èstatadescrittainterferenza(FP)daFosfatasialcalinainmetodiFPIAcheusanoALPcomesubstrato(STRATUS)giàavaloridi129U/L[25],epiùrecentementesumetodochemiluminescenteBeckmanCoulterAccessAccuTnI+3aconcentrazioni nella norma (58 U/L) di fosfatasi alcalina serica [26]. Interferenzararissima.

4. Ittero/iperbilirubinemia. Valorimolto elevati di bilirubina (>10mg/dL) sono statisegnalati interferire negativamente (FN) i metodi Abbott sia cTn che hs, ma non imetodiSiemens(cTnehs)eRoche[27].Situazionirare.

5. Emolisi in vivo.Può dipendere da malattie del soggetto (anemie emolitiche – vediTabella1),mapiùfrequentementedamanovrediprelievo[28].

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Patologieereditarie1.Difettinellasintesiemoglobinica

•Talassemia•Anemiafalciforme

2.Difettidellamembranaeritrocitaria•Sferocitosiedellissocitosiereditarie•Emoglobinuriaparossisticanotturna(PNH)

3.Difettidelmetabolismoeritrocitario4.Deficitdiglucosio-6-fosfatodeidrogenasiepiruvato-chinasi

Patologieacquisite1.Patologieimmuno-mediate

•Mycoplasmapneumoniae•Anemiaemoliticaautoimmune•Patologieautoimmunitarie(es.LES,LLC)

2.Ipersplenismo3.Ustionietraumi4.Infezioni

•Malaria•Clostridi

5.Danneggiamento“meccanico”incircolo•CoagulazioneIntravascolareDisseminata(CID)•Sindromeemolitico-uremica•Porporatromboticatrombocitopenica(TTP)•Valvolecardiache•SindromeHELLP(hemolysis,elevatedliverenzymesandlowplatelets)

6.Trasfusioneincongrua7.Farmaci,tossineedaltrecause.Tabella1.Anemiaemolitica:causepatologiche(modificatada28).

B)Prelievo

1. Emolisi invitro. I campioni emolitici sono circa il 3%dei campioni giornalierinellaroutine, di più (8.8%) inUrgenza (DE); definiti dallamodifica visibile del colore delcampione(darosaarosso)checorrispondea>0.3g/Ldiemoglobinaliberanelplasma[28].L’interferenzapuòesserenegativa(FN)comesucTnTRocheocTnILOCISiemensoppurepositiva(FP)comesucTnIORTHOoAbbottalivelliperòmoltodiversi:0.3g/L[29],0.6g/L[22],<1g/L[30],1.9g/L[31].SecondoBias[31],un’alterazionedel20%(consideratacriticanelriseandfalldiagnostico)èrinvenibilea150indicediemolisi.Inogni caso l’effetto dipende dall’entità dell’emolisi (tanto maggiore l’emolisi, tantomaggiorel’effettointerferente)edalleconcentrazionidicTn(tantopiùbasse,tantopiùevidente l’effetto interferente). L’effetto è diretto tipo “quenching”ma se l’attesa delcampione è prolungata anche per rilascio di proteasi. I criteri generali di nonaccettabilità dei campioni emolitici sono sufficienti a controllare il problema, maesistonoresistenzediffuseallaloroapplicazione[28].

2. Fibrina.Erratemanovrediprelievo,trasportoecentrifugazionepossonodeterminarepresenza di fibrina fino al 2.2% dei campioni [32], che può determinare

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intrappolamento dell’enzima indicatore o falsi legami tra fibrina e anticorpi diriconoscimento. L’utilizzo di plasma e di provette con acceleratori e separatori hadiminuito il problema. La ri-centrifugazione è apparsa in grado di diminuirel’interferenza [33], ma viene oggi contestata perché potrebbe diminuire laconcentrazionedicTnnonperrisoluzionedelproblemafibrinamaperdegradazionedell’analitaconrischiodimis-classificazionedeipazienti[34].

3. Materiali (provette ematrice). Non ci sono studi definitivi ma l’uso di provette aseparazionerapida(RST)nonhaportatoqueibeneficiattesiinterminididiminuzionedi FP in cTnT e cTnI Beckman [35]. Neanche per lamatrice ci sono studi definitivi,tuttavia ciascunmetodoha individuato lapropria:plasma-eparina (cTnTehs-cTnT,cTnIehs-cTnISiemensnellediverseversioniestrumenti,cTnIORTHO,cTnIehs-cTnIBeckman, cTnIAbbottArchitect e i-STAT) oEDTA (cTnAlereTriage, hs-cTnAbbott,cTnPathfast)[36].Poichévariazioniinsensonegativoopositivosonostatesegnalateunpo’pertuttiimetodisiacTnchehs-cTnconl’usoalternatodiplasmae/osiero,siraccomanda di utilizzare tassativamente la matrice indicata come preferenziale dalproduttoreedinonmescolaredatiprovenientidamatricidiverse(Raccomandazione6diWuetal)[17].

ANALITICHE

A)StrumentoIFliersoOutlierssonoqueidatispuri,random,nonripetibili,disolitoFP,moltovariabiliindimensioni(dapiccolevariazionia100x)nonlegatiallavariabilitàanalitica,nonclinicamentemotivati e dipendenti da micro-coaguli o debris e/o pulizia non ottimale del sistema e/orobustness del sistema [37]. Con i metodi hs-cTn sono probabilmente meno frequenti(0.13% per hs-cTnT; 0.59% per hs-cTnI)[38]. In ogni caso non sono state segnalate mis-classificazioni,perchéononsonoclinicamenterilevantioppuresonofacilmenteintercettati.B)MetodoVasemprericordatochedatiprovenientidametodidiversi (To I;22metodiper I;diversegenerazioni dello stesso test; diverso strumento per stessametodica; diversamatrice) nonsono immediatamente comparabili[17]; che TAE (TotalAnalyticalError) e RCV (ReferenceChangeValue) sono elevati; che i valori vanno considerati nelle serie indiagnosticadi SCA.Quindi la variabilità analitica è grandee gli sforzidi armonizzazioneperora contraddittori[37,39]. Tuttavia sono assolutamente critici: la verifica delle performance all’inizio delnuovometodo(Raccomandazione2diWuetal)[17],l’usodellacalibrazionegiornalieraelotto-lotto [37], il CQI giornaliero su 3 livelli di cui uno vicino al 99° percentile(Raccomandazione1diWuetal)[17]eilcontrollosistematicodeireagenti[37].C)AnalitaLastabilitàdell’analitanonsembrerebbeavereproblemisulbrevetermine a4°C, -20°C, -70°Cmanon tutti imetodi sonouguali edatinonsonoconclusivi: è comunquemegliononoltrepassarele2ore[40];sullungoterminec’èqualchestudiochesegnaladecrementidi0.4ng/L/annomaanchequidipendeinpartedaimetodi[41].D)Campione

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Si tratta di interferenze immunologiche legate ad anticorpi eterofili, HAMA, FattoreReumatoide (RF), macrotroponina (che danno prevalentemente FP) e anticorpi anti cTn oreagenticomebiotinaostreptavidina(chedannoFN).

1. Anticorpieterofili(HA)sonoprodotti incorsodi infezioni,controantigeninonbendefiniti, hanno specificità multipla e debole; gli anticorpi umani anti-topo (HAMA)sono invece anticorpi contro antigeni ben definiti e sono dotati di forte affinità,prodotti di solito dopo trattamento con immunoglobuline animali o altre forme dicontatto[42].Idatisullaloroprevalenzasonocontraddittorimaquellochevienepiùcitato proviene da Fleming et al [43]: fino al 3.1% dei pazienti in generale e fino al14.8% dei pazienti con sospetta SCA. Determinano più frequentemente FP perchélegano i 2 anticorpi delmetodo sandwich in assenza di antigene (cTn); talora FN inquantoostacolanoillegametral’antigeneeunodei2anticorpidicatturaorivelazione.I metodi più semplici di individuazione sono una prova di diluizione (il valore noncambianellesuccessivediluizionialraddoppio)e/ounbloccoconagentiantiHA(delcommercioosierianimali)cherimuovonol’interferenza.Imetodiattualicontengonoagenti bloccanti HA/HAMA e hanno ridotto l’incidenza dei FP/FNma non del tutto;metodidiversisicomportanodiversamenteconplasmiidentici,quinditestareconunaltrosistema(metodo/strumento)puòessereutile.

2. FattoreReumatoide.Èpresente inmoltipazientidimalattieautoimmunimaanchenel5%deisoggettisanienell’1%deipazienticonsospettaSCA[44].PuòdareFPconun’interferenza simile a quella degli HA in particolare quelli IgM. Dopo segnalazionidegli anni 90 in particolare nei metodi MEIA (Abbott), l’uso di antisieri policlonaliaggiuntihadi fattoeliminato ilproblema,chesièdimostratoesserealmenoinpartelegatoallaco-presenzadiHA[45].

3. Macrotroponina. Si tratta di immunocomplessi di troponina e anticorpi cheproduconomolecoledi circa500kD in gradodi reagire congli anticorpideimetodisandwichdellacTnIAbbott.SegnalateconcTnI[45],sonopresentiancheconhs-cTnIin prevalenze fino a 5% dei pazienti con sospetta SCA con il metodo Abbott [46]. Ivalori sono di solito sotto i 100 ng/L ma possono essere confondenti. Talorapresentano valori molte volte superiori a URL. La verifica (una volta esclusal’interferenzadaHA)èdatadallaprecipitazioneconPEG8000al25%inPBS,incubato1:1 per 10 min e poi centrifugato (recupero <15%) e dal trattamento con ProteinA/G/L-Sepharosee laconfermadallacromatografiadigel filtrazionecheconsentediindividuareilcomplessoimmunenell’eluato[46].

4. AnticorpianticTn.GlianticorpianticTnI(ATIA)sonostatiidentificatiinsoggettisani(attenzionea IMAsilentieaidanninon ischemici:determinanoautoACnel9.3%),epazienticonDCM, ICMecardiomiopatia ipertrofica[47];quellianticTnT(ATTA)neisani,miocarditi, ICM eDCM con prevalenza del 10% [48]. Sono quindi collegati allosmascheramentodiepitopitramiteduevieT-cellindipendente(tipoLPS)operT-cellauto-reattive;lapersistenzaincircolofavoriscel’autoimmunità.Possonoavereeffettipatologici come immunocomplessi oppure alterando il signaling intracellulare delCa++ [49]. Interferiscono con il midfragment 30-110 di cTnI, impedendo ilriconoscimento degli anticorpi del sandwich (FN). La discrepanza tra STEMI(confermato da ECG) e valori negativi di cTn di solito fa sorgere il sospetto. La

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confermaèconl’usodialtrimetodipercTnchenonabbianoepitopidiriconoscimentonel frammento incriminato e/o con il mix con un siero sicuramente positivo che sinegativizza[50].

NellaTabella2sonoriassuntelepossibilicausediFP/FNditroponinaelalorofrequenza.

FasiTTP InterferenzaFP

F+ InterferenzaFN

F+

PREANALITICHE Paziente Biotina + raro Digiuno/Lipemia + raro Iperfosfatasemia FPIA raro Ittero + raro Emolisiinvivo

cTnIAbbotteORTHO

cTnT;cTnILOCI

Prelievo 3% 3% Emolisiinvitro Fibrina +/- 2.2% +/- 2.2% Materiali ? ? Matrice + + ANALITICHE Strumento + raro + raroMetodo +/- raro +/- raroAnalita ? ? Campione HA/HAMA + 3.1% +/- raro FattoreReumatoide + 1% Macrotroponina cTnIAbbott 5% Autoanticorpianti-cTn cTnI 10%Tabella2. Schemadelle interferenzeFP/FNdicTn.F+: frequenza;TTP:TotalTestingprocess.3.ComecomportarsiinpresenzadiunpossibileFP/FNditroponina?

Indicazioni per la prevenzione, il contenimento e la risoluzionedei problemi conseguenti aFP/FN sono comparse già nel documento NACB del 1999 [51] e più dettagliatamente neldocumentosullespecifichediqualitàdicTndel2001(specificitàanticorpale,calibrazione,imprecisione analitica, specificità del metodo; matrice, provette, stabilità in vitro)[52].Nell’agosto 2005, l’OfficeofInVitroDiagnosticDeviceEvaluationandSafety(OVID) diUnitedStates Food and Drug Administration (FDA), su input di Advanced Medical TechnologyAssociation(AdvaMed),emetteunAlertriguardoFPditroponina,ripresoepubblicatodaLumetalnel2006[45].

Piùrecentemente,vièstataunaripresadiattenzionelegataanuovifattoriinterferentivenuti

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allaribalta(FNdaautoanticorpianticTn)edallanecessitàdipuntualizzarequestiaspetticonlenuovehs-cTn.Nel2014Vafaieetal[53]presentanounalgoritmoclinico-laboratoristicoperlagestionedeirisultatisospetti,nel2017Hermanetal[37]descrivonolecaratteristichedellavariabilitàederrorenelladeterminazioneditroponinachecontieneancheiFP/FNesemprenel2017Mairetal[39]propongonounalgoritmoprevalentementeclinicodigestionedeivaloriproblematicidicTn.

Nel2018, leRaccomandazionidel IIILMPGCommittee diAACC [17] contengono indicazionigenerali (Raccomandazione 1 su CQ) e specifiche (Raccomandazione 6 e 7 su variabilianaliticheepreanalitiche)utiliaifinidelcontenimentodeiFP/FN.

DallaIVIndaginedelGdSMM[15],apparepresenteun’attenzioneallaqualitàdelcampione(fibrina,emolisi) con interventi sia tecnici (ri-centrifugazione; ripetizionedel campione) siastrategici(formazionedelpersonale),politichediprevenzionebasatesullari-centrifugazioneolaripetizioneperrisultatipositivi(inalcunicasisututtiirisultatipositivinonnoti)talorainseriti in algoritmi gestionali più complessi, ricerche specifiche per accertare specifici FP(anticorpieterofiliefattorereumatoide)ecolloquioconilclinicoperviadirettae/oconnoteesplicativesulreferto(Tabella3).

FaseAnalitica

30.5% Ripetizione15.5%(3%sututtiipositivinonnoti)Manutenzioneinterna(aghi,circuiti)edesterna;verificastrumentale12%VerificaCQIecalibrazioni8%MisuracTnsudiversostrumento/metodo10%ProtocolloperAnticorpiEterofili8%

FasePre-analitica

61.5% Qualitàdelcampione:attenzioneallacentrifugazione(retrazionedelcoagulo3%;fibrina7%)eaiserumindex8%;ri-centrifugazione12%Qualitàdelprelievo3%Qualitàdellaprovetta/matrice(Li-eparina;agitazione)12%

FasePost-analitica

8% Protocollicondivisiconilclinico4%Notasulreferto4%

Tabella3.AzionidicontenimentoerisoluzionedeiFP/FNcTnsecondoirispondentilaIVIndaginesuiMarcatoriMiocardiciinItaliadelGdSMMSIPMeL[15].

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III. RACCOMANDAZIONI PER LA MINIMIZZAZIONE DEL RISCHIO DI FP/FN DITROPONINA

Alla luce della letteratura e dei dati esperienziali raccolti dalla IV Indagine sui MarcatoriMiocardiciinItalia,ilGdSMMproponeleseguentiRaccomandazioniperlaprevenzioneelacorrezionedeiFP/FNeunoSchemad’azione.

1Metodologia

LadeterminazionedellaForzadellaRaccomandazioniedelLivellodelleevidenzeèsecondoLMPGNACB/AACC. Infatti,benché ilmetodoGRADEsiaormai internazionalmenteaccettatoper le valutazioni cliniche, NACB [54] non lo considera adatto per le raccomandazioni dilaboratorio in quanto mancano lavori di alta evidenza come gli RCT; il rapporto con glioutcomeèspazialmenteetemporalmentedistante;laqualitàdeglistudi,anchediaccuratezzadiagnostica, riconoscemolti bias (in primis di blinding); lamaggior parte delle decisioni èpresa per consenso (per definizione di bassa qualità di evidenza) e, d’altra parte, è (odovrebbeessere)prevalentel’interesseel’obiettivodiraccomandazionipratichediguidance.NACBadotta,quindi,leindicazionidiUSPreventiveServicesTaskForce[55].

Il GdS MM SIPMeL, per consentire un confronto con le Raccomandazioni di riferimento econtestualmente per tenere conto della scarsa disponibilità di evidenze forti sugli aspettioperativi dell’implementazione, ha scelto di utilizzare come base il sistema modificato diChristenson e Azzay (56) per cui per ciascuna Raccomandazione se ne indica laclasse/consensodellastessa(Idevi;IIaèragionevole,IIbdovresticonsiderare;IIInondevi) e il livello/ qualità delle evidenze (A, B, C), così graduato:A Evidenze fondate sustudibendisegnatiebencondottiinpopolazionirappresentative(RCToSRoMetanalisi);Bevidenze sufficienti ma limitate in numero, qualità, consistenza degli studi individuali;generalizzabili nella pratica; o di natura indiretta (standard internazionali); C Evidenzeinsufficienti per determinare effetti incontrovertibili sugli esiti clinici per la limitatezza innumero o forza degli studi, debolezza di disegno o svolgimento, buchi nella catena delleevidenzeomancanzad’informazioni;opinionidiesperti(DelphimodificatotraicomponentidelGdSMM)[57].

IlPositionPapersaràmessoindiscussioneapertasulsitoSIPMeLesottopostoavalidazioneesterna del GdS EBLM SIPMeL e della Commissione Qualità SIPMeL, prima della versionedefinitiva che sarà pubblicata sulla Rivista societaria e nell’area Linee Guida eRaccomandazionidelsitosocietario.

2.RaccomandazioniperlaprevenzioneecorrezionediFP/FNdicTn

1. Siraccomandaunaperfettaconoscenzadelpropriometodo/strumento,inparticolareper quanto attiene la sua robustness (% attesa di outlier), la matrice preferita e lasensibilità analitica. CLASSE I; LIVELLODI EVIDENZAB (riferimenti bibliografici 17,37)

2. Si raccomanda la scrupolosaosservanzadelle regoledi calibrazionee ri-calibrazione(lotto-lotto), di uso di CQI e VEQ e delle caratteristiche della manutenzione perminimizzare la variabilità analitica e gli outlier. CLASSE I; LIVELLO DI EVIDENZA B

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(riferimentibibliografici17,37)3. SiraccomandadiseguireleLineeGuidaperl’accettabilitàdeicampioni,inparticolare

peremolisiefibrina.CLASSEI;LIVELLODIEVIDENZAB(riferimentibibliografici28-30)

4. Nellavalutazionedeivaloridi cTn tenerecontodello statodel soggetto (età,genere,attivitàfisica,ritmocircadiano),dellavariabilitàbiologica(inparticolareperlastimadiRCV)edellecaratteristicheanalitichedelmetodo/strumentoutilizzato.CLASSEIIa;LIVELLODIEVIDENZAC(riferimentoGdSMM,bibliografia37)

5. Valutare il risultato in riferimento al motivo della richiesta (sospetta SCA; prova didannomiocardico;valutazioneprognosticadisoggettocritico;ecc.).Ildatovasempreinterpretatonellaserie.Escluderepatologiecardio-vascolarichepossanosostenereunrisultatopositivodicTn.Escluderepatologienoncardio-vascolariincuiènotoesserviaumentidicTn(es.malattierenali).Solodopo(daunpuntodivistalogico;puòessereconcomitantedaunpuntodivistapratico)questaattentaanalisiclinica,pensareadunFP/FNpre-analitico e/o analitico. CLASSE IIa; LIVELLODI EVIDENZAC (riferimento39,53;GdSMM)

6. NelsospettodiFP/FNpre-analiticoe/oanalitico,siraccomandadiripetereildosaggiosuunnuovocampione,conattenzioneallafasepre-analitica(prelievo)edopoverificadello stato analitico del metodo/strumento. La ri-centrifugazione, infatti, risolve leinterferenze da fibrina ma perché può indurre mis-classificazione di pazienti. Sepossibile, si suggerisce di determinare la cTn con un altro metodo (T/I o diversometodoI;nonconmetodiPOCT).CLASSEI;LIVELLODIEVIDENZAC(riferimento39,53;GdSMM)

7. Se si tratta di un sospetto FP, come succede prevalentemente, si raccomanda diutilizzare, in sequenza, prove di diluizione, prove con bloccanti per eterofili(HBR/HBT)eprovedimixingconsierianimalipertestimoniarel’interferenzadaHAeHAMA. In caso di negatività delle prove precedenti, si raccomanda la ricerca delFattore Reumatoide e di utilizzare precipitanti come PEG 8000/6000 oultracentrifugazione per evidenziare Macro-troponina. Se possibile, si suggerisce ditestimoniare la speciemolecolare con cromatografia per gel filtrazione. CLASSE IIa;LIVELLODIEVIDENZAB(riferimenti37,39,42-46,53)

8. In caso di sospetto FN, si raccomandano prove di mixing con sieri umani pertestimoniare lapresenzadiautoanticorpianti-cTn.Quandopossibile,sisuggerisceditestimoniare il tipo di epitopo coinvolto. CLASSE IIa; LIVELLO DI EVIDENZA B(riferimenti37,39,47-50,53)

9. La gestione della ricerca dell’interferente va eseguita in sinergia con il clinico, siaperché ilquadroclinicopuòindirizzare ilsospetto(anchenellesituazionimoltorarecome supplementazione di biotina), sia perché vanno evitate interpretazionifuorvianti.CLASSEI;LIVELLODIEVIDENZAB(riferimenti17,37,39,53)

10. Tutti icasiFP/FN,anchedi lieveentità,vannoricercatieregistratiperun’opportunamisuradellaloroprevalenzaepertestimonianzadelleazionicorrettive.Devonoesserecomunicati in modo formale al fornitore del sistema diagnostico e alla comunitàscientifica.CLASSEIIb;LIVELLODIEVIDENZAC(riferimentoGdSMM).

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3.Schemad’azione

Sospettoclinico(cTnnoncorrispondeaquadroclinico)odilaboratorio(datiserialinoncongruenti)

Valutazioneclinica(inriferimentoalmotivodellaricerca):soggetto(età,genere,attivitàfisica,ritmocircadiano);patologiacardiacanonSCA;patologianon

cardiaca(es.ESRD)

FP/FNpre/analitico:controllometodo/strumento;nuovocampione(prelievo;materiali,matrice)è���������determinazione,ancheconaltrometodoè

ConfermaFP/FN

FPProvedidiluizioneProveconHBR

MixingconsierianimaliRicercaRF

PrecipitazioneconPEG

FNMixingconsieriumani

CromatografiagelfiltrazioneAdsorbimentoconProteinaAoIg Mutazionigenetiche(DCM/ICM)

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