RACCOMANDAZIONI PER LA GESTIONE DEI FALSI POSITIVI (FP) · PDF file 2018-09-13 · 4...

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    Position Paper GdS MM SIPMeL Francesca Veneziani, Gianni Antonio Galli, Lucia Malloggi, Marco Moretti, Margherita

    Morandini, Massimiliano Manno, Maria Aurora Burgio, Elisabetta Stenner, Giulio Marino, Dina Di Maria, Deborah Mazzei, Daniela Rubin, Matteo Cassin, Alessio Gamboni e Piero Cappelletti, a nome del Gruppo di Studio sui Marcatori Miocardici (GdS MM) della Società Italiana di

    Patologia Clinica e Medicina di Laboratorio (SIPMeL)

    RACCOMANDAZIONI PER LA GESTIONE DEI FALSI POSITIVI (FP) E DEI FALSI NEGATIVI (FN) DI TROPONINA (CTN)

    I. Introduzione: cosa intendiamo quando parliamo di specificità della cTn

    1. Le troponine sono cardio-specifiche.

    2. Specificità clinica di cTn.

    3. Specificità analitica di cTn.

    II. FALSI POSITIVI E FALSI NEGATIVI DI TROPONINA.

    1. Le dimensioni del problema.

    2. Elenco ragionato dei FP/FN di troponina

    3. Come comportarsi in presenza di un possibile FP/FN di troponina?

    III. RACCOMANDAZIONI PER LA MINIMIZZAZIONE DEL RISCHIO DI FP/FN DI TROPONINA

    1. Metodologia

    2. Raccomandazioni per la prevenzione e correzione di FP/FN di cTn

    3. Schema d’azione

    IV. BIBLIOGRAFIA

    I. INTRODUZIONE: cosa intendiamo quando parliamo di specificità della cTn.

    Quando parliamo di “specificità” di cTn, dobbiamo distinguere bene se parliamo di specificità tessutale (sono le cTn cardio-specifiche?), di specificità clinica (individua la cTn i pazienti sani rispetto alla patologia ischemica?) o di specificità analitica (i metodi di cTn sono interferiti?).

    1. Le troponine sono cardio-specifiche.

    La specificità tessutale assoluta di cTnI è data dalla sua genetica: 3 geni codificano per le 3 isoforme di cTnI cardiaca, muscolo-scheletrica veloce e muscolo-scheletrica lenta. Il gene per la cTnI cardiaca è posizionato sul cromosoma 19 (19q13.4) ed è costituito da 6 esoni e 7 introni. L’esone 3 è assente nei geni della cTnI scheletrica; esso determina gran parte del domain N-terminale, specifico della cTnI cardiaca, che è una proteina di 209 aa con massa molecolare di 24 kDa [1].

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    La storia della specificità tessutale di cTnT è più dinamica. Anche qui 3 geni per 3 isoforme. Il gene dell’isoforma cardiaca è posto sul cromosoma 1 (1q32.3) ed è costituito da 17 esoni e 16 introni che danno origine ad una proteina di 287 aa e di 35.9 kDa. Lo splicing alternativo e l’esone attivo solo nelle forme embrionali determinano più isoforme (da 1 a 4) nel miocardio fetale e in corso di malattia muscolare [1].

    Già con il test di 2° generazione, che utilizza la coppia di anticorpi M11.7 e M7, fu dimostrata la cardio-specificità delle isoforme cardiache di cTnT e la diversità in massa molecolare delle forme ri-espresse in Malattia Renale Cronica [2]. L’aumento di cTnT in malattia renale [3], forse legata al catabolismo renale dei frammenti di cTnT circolanti [4], potrebbe essere utilizzata sotto il profilo diagnostico in questa situazione clinica (aumentata sensibilità clinica) [5]. Recentemente sono state segnalate alcune aspecificità legate alla ri-espressione di forme fetali in malattie muscolari [6], di cui tener conto.

    2. Specificità clinica di cTn.

    Per specificità clinica di un marcatore miocardico di Sindrome Coronarica Acuta (SCA) si intende, per definizione, la capacità di identificare i soggetti non affetti da patologia ischemica. Ma non ci deve attendere dal marcatore troponinico quello che non può dare e cioè l’etiologia del danno miocardico, come chiarito dalle definizioni di Infarto del Miocardio (IMA) succedutesi dal 2000 fino alla recentissima del 2018 [7].

    I livelli di cTn non sono, da soli, in grado di identificare con diagnosi differenziale i pazienti con patologia cardiaca, perché non è un marcatore di ischemia, che non esiste [8], ma solo l’entità del danno miocardico. Altri marcatori, come CK-MB massa, “sembravano” più specifici, solo perché erano meno sensibili e quindi “vedevano” solo i danni più eclatanti di natura ischemica [9].Questo concetto ampiamente descritto nella definizione di IMA del 2018 [7], peraltro, era già insito nella prima definizione di SCA/IMA: la troponina svela solo il danno miocardico, l’origine ischemica deve essere provato con altri mezzi (ECG, Eco, imaging, prove da sforzo, ecc.).

    3. Specificità analitica di cTn.

    Se dunque sappiamo che cTn è tessuto-specifica ma non patologia-specifica, quando parliamo di FP/FN facciamo riferimento agli aspetti analitici, cioè alle possibili interferenze che limitano la capacità dei metodi immunologici sandwich (quelli utilizzati nella pratica) di identificare solo la molecola di cTn.

    Tutte le successive generazioni (siamo alla 5°) dei metodi per cTnT si basano sull’uso degli anticorpi di cattura M7 MAb (che riconosce l’epitopo definito dagli aminoacidi 125-131 della porzione centrale della molecola, dedicata al legame con la tropomiosina) e di rivelazione M11.7 MAb (che riconosce l’epitopo definito dagli aminoacidi 136-141, sempre del domain centrale) [10].

    Viceversa, la grande variabilità analitica degli oltre 20 metodi per cTnI [10,11] deriva:

    1) dai diversi anticorpi scelti: nonostante le indicazioni delle specifiche di qualità IFCC 2001 di privilegiare epitopi di parte stabile (aa 30-110) si assiste ad una dispersione dei siti epitopici scelti dai vari produttori; in aggiunta la maggior parte delle Ditte usa 1

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    anticorpo di cattura e 1 anticorpo di riconoscimento mentre ormai la letteratura scientifica suggerisce la formula “2+2”: 2 anticorpi di cattura e 2 anticorpi di riconoscimento;

    2) dal diverso disegno del test (potenziamento segnale; volumi; tempi di incubazione) e dai diversi segnali utilizzati (spettrometria, fluorescenza, chemiluminescenza, elettrochimica);

    3) dalla diversa sensibilità alle diverse forme di rilascio (complesso ternario TIC, complesso binario IC predominante, forme libere): non esistono informazioni esaustive su quali forme e in che percentuale vengano riconosciute dai diversi kit e se la calibrazione avvenga, come richiesto dalle specifiche di qualità IFCC del 2001, contro un mix rappresentativo di tutte le forme circolanti possibili;

    4) dalle modificazioni post-traslazionali quali la fosforilazione dei residui serinici 22/23 e 41/42, l’ossidazione dei gruppi SH delle cisteine 80 e 97, la produzione di frammenti (in letteratura si trovano segnalazioni di produzione da 8 a 11 frammenti) e proteolisi.

    Il tentativo di rendere omogenei i test per cTnI passa attraverso lo sforzo di Standardizzazione operato da AACC e NIST (National Institute for Standardization and Technology) che ha portato nel passato all’individuazione di un materiale di riferimento (standard reference material SRM 2921) contenente complesso TIC, la cui applicazione ha dimostrato di diminuire la variabilità dei kit per cTnI da 20-40 volte a 2-5 volte [12, 13]. Un Working Group-IFCC sta provando da tempo a produrre un materiale di riferimento secondario commutabile [14], ma i risultati si fanno attendere anche perché SRM 2921 ha mostrato limiti di conservabilità e di degradazione, al punto che molti Autori considerano l’impresa dell’armonizzazione e standardizzazione dei metodi cTnI non raggiungibile e auspicano piuttosto semplificazioni ed unificazioni metodologiche attuate dal mercato.

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    II. FALSI POSITIVI E FALSI NEGATIVI DI TROPONINA.

    1. Le dimensioni del problema.

    La determinazione di quanti siano nella realtà di tutti i giorni i FP/FN analitici di cTn non è facile. Infatti, se consultiamo la letteratura specifica delle diverse cause di FP/FN, dovremo concludere che la dimensione del problema dovrebbe essere rappresentata da una percentuale a 2 cifre per anno, dato che le cause principali per FP (emolisi, fibrina, interferenze immunologiche) e per FN (emolisi, fibrina, autoanticorpi) assommate raggiungerebbero una incidenza superiore al 10%. In Laboratori che fanno tra 5.000 e 50.000 cTn/anno, che rappresentano l’83% del campione della IV Indagine sui Marcatori Miocardici di GdS MM SIPMeL [15], sarebbero da 500 a 5000 casi di interferenza/anno. Tuttavia, in letteratura si trovano indicazioni di sintesi di FP/FN inferiori o vicini all’1% [16,17]. Anche nella IV Indagine del GdS MM [15] il 35% dei rispondenti ne percepisce meno di 6/anno, il 47% tra 10 e 50/anno e solo il 18% più di 100/anno, indipendentemente dalla quantità totale di cTn eseguite per anno e dal tipo di strumentazione utilizzata. Un solo rispondente cita 10% di interferenze per anno. Gli altri percepiscono un’incidenza prevalentemente intorno allo 0.1% (Figura 1). Quindi, nella pratica, le interferenze di rilevanza clinica sono rare, anche se vanno riconosciute perché potenzialmente pericolose.

    Figura 1. Numero di casi di FP/FN di troponina stimati/misurati e percentuali di rispondenti nella IV Indagine GdS MM [15]. Quali sono le ragioni della discrepanza tra potenziali incidenze e reali criticità? Innanzitutto, la maggior parte delle p