1

http://www.chimica2011.it/

QUALITAQUALITA’’ E SICUREZZA E SICUREZZA DEGLI ALIMENTIDEGLI ALIMENTI

Prof. DANILA MOSCONEProf. DANILA MOSCONEChimica Chimica AnaliticaAnaliticaDip. Dip. didi ScienzeScienze e e TecnologieTecnologie ChimicheChimiche

2

ALIMENTIALIMENTI

Si definiscono alimenti i prodotti commestibili che l’uomo deve assumere per assicurare, insieme con la respirazione, il normale svolgimento delle funzioni fisiologiche dell’organismo.L’assunzione di alimenti risponde ad uno dei bisogni elementari di ogni essere vivente, compreso l’uomo.

Ai consumatori devono essere offerti alimenti di

ALTA QUALITA’ e SICURI.

Ai consumatori devono essere offerti alimenti di

ALTA QUALITA’ e SICURI.

La catena di produzione alimentare diviene sempre piùcomplessa ed ogni singolo anello della catena deve essere

altrettanto forte per salvaguardare la salute dei consumatori. Ciò indipendentemente se l’alimento è prodotto

in loco oppure importato da paesi terzi.

“from field to fork”

Il principio guida deve essere:

3

Lo studio degli alimenti può essere condotto tenendo presenti quattro aspetti fondamentali:

� chimico generale (chimica dei principi alimentari: proteine, carboidrati, lipidi, vitamine)

� analitico (chimica analitica applicata all’esame degli alimenti)

� tecnologico (descrizione dei processi di preparazione, trattamento e conservazione dei prodotti alimentari)

� chimico-igienico (contaminazione chimica degli alimenti)

ALIMENTIALIMENTI

Aspetto

Odore SaporeNon si può contare solo su questi parametri per sapere se un alimento è sicuro e di qualità!

4

Cosa significa“Alta Qualità dell’Alimento?”

Qualità

Nutrizi

onali

Sicurezza Chimica

PesticidiMetalli pesanti Micotossineetc

Sicurezza

Sicurezza Microbiologica

+

Stima di malattie di origine alimentare Stima di malattie di origine alimentare negli Stati Uniti ogni annonegli Stati Uniti ogni anno

76 milioni di personesi ammalano

76 milioni di personesi ammalano

5,000 personemuoiono!

5,000 personemuoiono!

Sono stati identificati più di 250 tipi diversi di malattie a trasmissione alimentare.

5

Anche un piccolo assaggio non ci mette al sicuro….

Solo 10 batteri possono causare alcune malattie di origine alimentare!

Mal di stomaco Diarrea

Febbre

Disidratazione(a volte severa)OOPS!

6

Condizioni gravi meno comuni, Condizioni gravi meno comuni, ma possibilima possibili

ParalisiMorte

Meningite

Persone con un elevato rischio per Persone con un elevato rischio per malattie a trasmissione alimentaremalattie a trasmissione alimentare

Donne in attesaDonne in attesa Bambini ed anziani

persone con sistema immunitario indebolito e persone con alcune malattie croniche

persone con sistema immunitario indebolito e persone con alcune malattie croniche

7

CostoCosto delledelle malattiemalattie a a trasmissione alimentaretrasmissione alimentare

• 10 - 83 miliardi di $ ciascun anno

• Costi specifici:Spese mediche Azioni legaliAffari persi

Cosa proponiamo noi?

Nuovi metodi di analisi della qualità e salubrità degli alimenti tramite l’utilizzo

di biosensoribiosensori

8

CHE COSCHE COS’’EE’’ UN BIOSENSORE?UN BIOSENSORE?

Un biosensorebiosensore è un strumento analitico in cui èpresente un elemento biologico strettamente connessoo integrato con un trasduttore di segnale.

Quali sono glielementielementi biologicibiologici?

I I pipiùù diversidiversi…………

•Enzimi•Anticorpi•DNA•Batteri•Fettine di tessutoanimale o vegetale•……

Che cos’è un trasduttore di segnale?

Sensore: : un un dispositivodispositivo cheche converteconverte unaunaforma forma didi energiaenergia in in unun’’altraaltra, cioè chetrasforma una grandezza fisica che sivuole misurare in un segnale di naturadiversa (tipicamente elettrico) piùfacilmente misurabile o memorizzabile.

•sensori di luce (o sensori ottici): fotocellule, tubi fotoelettrici •sensori di calore: calorimetri.•sensori di radiazione: contatori Geiger.•sensori di corrente elettrica: galvanometri, amperometri.

AnalitaAnalitaComponente Componente biologicobiologico

TrasduttoreTrasduttoredi segnaledi segnale Registratore Registratore

9

Cosa hanno in comune?

Analita/biorecettore/trasduttore/processore di segnale

Biosensore

Piccole molecole/membrana olfattiva/cellule nervose/cervello

Luce Visibile /bastoncelli e coni/ cellule nervose/cervello

Naso

Occhi

AnalitiAnaliti

• piccole molecoleglucosio, alcool, CO, CO2, agenti nervini, urea, pesticidi, aspirina, paracetamolo, penicillina, TNT,colesterolo, amminoacidi

• bio-macromolecoleDNA, RNA, enzimi, proteine, ormoni, virus

• batteriantrace, E. coli, Salmonella

10

Interazioni Biologiche

• Interazioni deboli, non-covalenti• Spontanee (self-assembly)• Altamente specifiche (differenze anchedi un singolo atomo)• Complementare (chiave/serratura)

RecettoriRecettori BiologiciBiologici

Enzima Anticorpo Acido Nucleico

Cristalli PiezoelettriciCristalli PiezoelettriciGenerano correnti elettriche grazie alla vibrazione diquarzi quando piccole quantità di analiti si legano a recettori biologici immobilizzati.

Promettenti per interazioni anticorpo/antigene, DNA

Trasduttore di segnale

••Fibre OtticheFibre OtticheSempre più usate grazie allo sviluppo di fibre che possono trasportare fotoni a siti remoti.

Assorbimento, reflettanza, fluorescenza, scattering, chemiluminescenza, etc.

Quantum dots (cristalli semiconduttori di dimensioni nanometriche).

11

Trasduttore di segnale

• SensoriSensori elettrochimicielettrochimici ((elettrodielettrodi))Amperometrico: Il più comunemente usato in reazioni enzimatiche cheimplicano ossidasi e riduttasi. Glucosio ossidasi, Colesterolo ossidasi, etc.

Potenziometrico: reazioni che implicano variazioni significative di pH Es. penicillinasi, ureasi.

• MisuratoreMisuratore TermicoTermicoFormazione/rottura di legami chimici in reazioni enzimatiche che provocano variazionidi entalpia.

Inoltre, variazioni di calore di soluzionespecialmente con formazione di specie cariche(p. es. protoni).

Tipicamente possono essere misurate ≈≈≈≈millesimi di °K di variazione di temperatura.

Esempi di biosensoriEsempi di biosensori

Strumento per la misura del Glucosio nel sangue

(per pazienti diabetici)

12

Il Padre dei Biosensori

Professor Leland C Clark Jnr1918–2005

Enzima Glucosio Ossidasi….+

Trasduttoreelettrochimico…

STRUMENTO

ELETTRODO +ENZIMA = biosensore

CAMPIONE

13

Acido Gluconico

Ossigeno

GlucosioOssidasi

Glucosio

AcquaAcqua ossigenataossigenata

ElettrodiElettrodi StampatiStampati

1 cm

Produzione di massa

Basso costo

Monouso

Piccoli volumi di campione

14

15

ELETTRODI STAMPATI

ELETTRODO + ENZIMAELETTRODO + ENZIMA

16

Potentiostato - GalvanostatoPG580 Uniscan Instruments

17

Esempi di biosensoriEsempi di biosensori

ANTRACEANTRACE

’Biosensore’ per CO dei vecchi minatori di

carbone

test di gravidanzaMisura l’ormone hCG nelle urine.

BIACOREBIACORE

Applicazioni in analisi degli alimentiApplicazioni in analisi degli alimenti:

ComposizioneComposizione

Analisi Sensoriale

Determinazione dei Patogeni

Carboidrati, vitamine, acidi organici,

Pesticidi, antibiotici, tossine, Pesticidi, antibiotici, tossine, ormoniormoni

Freschezza dei pesciMaturazione del formaggioControllo del confezionamentoControllo della cottura

Salmonella spp. Clostridium botulinum E. coli

18

ANALIZZATORE BIOCHIMICO YSI 2700 SELECTANALIZZATORE BIOCHIMICO YSI 2700 SELECT

CARATTERISTICHE TECNICHE : Ammontare di campione : da 5 a 65 microlitri. Tempo di Risposta: circa 90 secondi

APPLICAZIONIDestrosio SaccarosioDestrosio in patate Destrosio e Saccarosio in latte concentrato Lattate nella carne Etanolo in birra e vini Lattosio in formaggi Glutammati in brodi Colina in mangimi Destrosio e Saccarosio in gelati

19

SENZYTEC 1 è un analizzatore in gradodi determinare diversianaliti negli alimenti, come zuccheri, acidi, etanolo; è sufficientescegliere l’appropriatosensore usa e getta, inserirlo nella sondaed aggiungere pochegocce di campione per una rapida misura

ANALISI DEL VINOANALISI DEL VINO

• Glucosio• Zuccheri (glucosio + fruttosio) • Etanolo• L-Malico• L-Lattico• D-Lattico• Fruttosio• Saccarosio• Polifenoli

•Glucosio•Zuccheri (Glucosio + Fruttosio) •Etanolo

ANALISI DELLA FRUTTAANALISI DELLA FRUTTA

20

Valutazione dello stato di Valutazione dello stato di freschezza dei prodotti della pescafreschezza dei prodotti della pesca

dove ATP, ADP, AMP = dove ATP, ADP, AMP = adenosinaadenosina trifosfatotrifosfato, , adenosinaadenosina difosfatodifosfato, , adenosinaadenosina monofosfatomonofosfato

IMP, HXR = inosina IMP, HXR = inosina monofosfatomonofosfato, inosina, inosina

HX, X, U = ipoxantina, xantina, acido uricoHX, X, U = ipoxantina, xantina, acido urico

Indicatore di freschezzaIndicatore di freschezza: : la degradazione dei nucleotidi, nel muscolo di pesce la degradazione dei nucleotidi, nel muscolo di pesce

Dopo la morte del pesce:Dopo la morte del pesce:

ATP ATP �������� ADP ADP �������� AMPAMP �������� IMP IMP �������� HXR HXR �������� HX HX �������� X X �������� U U

DEGRADAZIONE

21

PoichPoichéé l'ATP, ADP ed AMP scompaiono circa 24 ore l'ATP, ADP ed AMP scompaiono circa 24 ore dopo la morte, per potere valutare la freschezza del dopo la morte, per potere valutare la freschezza del pesce, pesce, èè stato introdotto un parametro Kstato introdotto un parametro K11 basato sulla basato sulla degradazione dei rimanenti composti, che può essere degradazione dei rimanenti composti, che può essere

definito come segue:definito come segue:

KK11 = (HXR + HX) / (IMP + HXR + HX) * 100= (HXR + HX) / (IMP + HXR + HX) * 100

AllAll’’aumentare del Kaumentare del K1 1 diminuisce il grado di diminuisce il grado di freschezza del pesce:freschezza del pesce:

KK11 <<<<<<<< 2020 èè molto fresco, molto fresco,

20 20 <<<<<<<< KK11 <<<<<<<< 4040 deve essere cucinato,deve essere cucinato,

KK1 1 >>>>>>>> 4040 non non èè consigliabile per consigliabile per ll’’alimentazione umana.alimentazione umana.

E' quindi possibile stimare la freschezza del pesce E' quindi possibile stimare la freschezza del pesce misurando soltanto misurando soltanto tre tre dei sei metaboliti.dei sei metaboliti.

Le reazioni enzimatiche coinvolte nella degradazione Le reazioni enzimatiche coinvolte nella degradazione dell'IMP ad acido urico sono le seguenti:dell'IMP ad acido urico sono le seguenti:

IMP IMP ---- NTNT------>> HXR + PiHXR + Pi

HXR + Pi HXR + Pi ---- NPNP ------> HX + ribosio> HX + ribosio--11--fosfatofosfato

HX + 2OHX + 2O22---- XOXO ------> UA + 2H> UA + 2H22OO22

Dove Dove NT, NP, XONT, NP, XO e Pi rappresentano rispettivamente la e Pi rappresentano rispettivamente la 55’’--nucleotidasinucleotidasi, , lala nucleoside fosforilasi, nucleoside fosforilasi, lala xantina xantina ossidasiossidasi ed il fosfato.ed il fosfato.

Valutazione dello stato di freschezza Valutazione dello stato di freschezza dei prodotti della pescadei prodotti della pesca

22

Valutazione dello stato di freschezza dei Valutazione dello stato di freschezza dei prodotti della pescaprodotti della pesca

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8

giorni

K%

18°C 4° C

4°C con ghiaccio Scong. dopo 30d a -20°C

Scong. dopo 90d a -80°C

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Punti

Trote iridee conservate in differenti condizioni di temperaturaTrote iridee conservate in differenti condizioni di temperatura ::

T = ambiente, 4oC, 4 oC con ghiaccio

-20 oC per 1 mese, poi scongelate e mantenute a 4oC

-80 oC per 3 mesi, poi scongelate e mantenute a 4oC

A A T ambienteT ambiente la conducibilitla conducibilitààelettrica elettrica scende al di sotto di scende al di sotto di 1010 gigiàà alal primo primo giornogiorno

A A 4 4 ooCC la conducibilitla conducibilitààelettrica elettrica scende al di sotto di scende al di sotto di 1010 dopo dopo il terzoil terzo giornogiorno

A A 4 4 ooCC con ghiacciocon ghiaccio la la conducibilitconducibilitàà elettricaelettrica scende scende al di sotto di 10al di sotto di 10 dopo il dopo il 5 5 giornogiorno

Per i pesci Per i pesci congelati non si congelati non si èèosservata conducibilitosservata conducibilitààelettrica elettrica

Monitoraggio della fermentazione alcolica in relazione a diverse tecniche

di vinificazione in rosso

23

Torrevento (BA)140 Q di uve“Montepulciano” e “Troia”in botti d’acciaio rotanti

•volume����300 e 150 Hl•SO2���� 5 g/Hl•yeast S.cerevisiae����25g/Hl•T ����17-30°C

Di Majo Norante (CB)400 Q di “Montepulciano d’Abruzzo” in fermentoreverticale termocondizionato

volume ���� 270 Hl •SO2 ���� 4 g/Hl•yeast S.cerevisiae ���� 20 g/Hl•T���� 21 - 28 °C

Solopaca (BN)650 Q di “Aglianico”fermentato in un fermentoreverticale

•volume���� 800 Hl •SO2 ���� 5 g/Hl•yeast S.cerevisiae����20 g/Hl•T ���� 26-38 °C

MONITORAGGIO DI METABOLITI MONITORAGGIO DI METABOLITI DETERMINANTI DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICADETERMINANTI DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICA

Applicazione in enopolio di biosensori elettrochimici (FIA) per il dosaggio di glucosio, fruttosio, glicerolo ed etanolo durante la fermentazione alcolica al fine di controllarne il decorso ed eventuali anomalie.

�Glucosio+ O2 GOD→ acido gluconico +H2O2

�Fruttosio + 2 PMS+FDH→ chetofruttosio + 2 PMSHPMSH----->2 PMS+ + 2e

�Etanolo + O2 AO→ acetaldeide +H2O2

�Glicerolo + ATP (Mg2+) GK→ glicerolo-3-p + ADP

Glicerolo-3-p +O2 + H2O GPO→ glicerone-3-p+H2O2

24

Azienda viti-vinicola Di Majo Norante(CB)

capacità���� 270 Hl cicli di innaffiatura a pioggia del cappello ���� 3’/4hSO2 ���� 4 g/Hllieviti S.cerevisiae ���� 20 g/Hltemperatura ���� 21 - 28 °C

400 Q.li di uve “Montepulciano d’Abruzzo” divise in due partite da 200 Q.li e vinificate in fermentatori verticali termocondizionati:

La fermentazione alcolica termina prima nella tesi “triplice delestage” (65 ore)rispetto alla tesi “duplice delestage”(75 ore) e presenta una fase “lag” minore

�

Il delestageaggiuntivo a 20 ore dall’inizio ha favorito la crescita dei lieviti incrementando la velocità di fermentazione

�

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

g/L

0

2

4

6

8

10

12

14

% v

ol

glucosiofruttosioetanolo

Delestage

Delestage

Svinatura

Tempo (ore)

Tesi “duplice delestage”

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

g/L

0

2

4

6

8

10

12

14

% v

ol

glucosiofruttosioetanoloDelestage

Delestage

Delestage

Svinatura

Tesi “triplice delestage”

25

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

Tempo (ore)

g/L

0

2

4

6

8

10

12

14

% v

olglucosio

fruttosioetanoloSvinatura

Tesi “rimontaggi” (ogni 2 ore)

���� Fase “lag” breve (rapido adattamento dei lieviti al mezzo) e difficoltà a consumare completamente il fruttosio

���� L’elevata temperatura raggiunta (38°C), in sinergia con l’effetto tossico dell’etanolo, può aver modificato, nei lieviti, la funzionalità dei sistemi di trasporto di membrana degli zuccheri

0

1

2

3

4

5

6

7

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

g/L

0

2

4

6

8

10

12

14

16

% v

ol

Delastage

Delastage

Etanolo

Glicerolo

Di Majo N.-Tesi “duplice delestage”

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tempo (ore)

g/L

0

2

4

6

8

10

12

14

16

%vo

l

Delestage

Svinatura

Glicerolo

Etanolo

Torrevento-Tesi “unico delestage”

Rapido incremento della concentrazione di gliceroloed etanolo e della velocità di fermentazione subito dopo l’operazione di svuotamento

�

Il fenomeno è attribuito all’accumulo dei due alcoli nella cellula durante la fase di stress anaerobico ed al loro rilascio nel mezzo in seguito alla ripresa della funzionalitàdella membrana dovuta alla ossigenazione spinta

�

26

Cosa significa“Alta Qualità dell’Alimento?”

Qualità

Nutrizi

onali

Sicurezza Chimica

PesticidiMetalli pesanti Micotossineetc

Sicurezza

Sicurezza Microbiologica

+

acqua

Pesticidi derrate alimentari

Concentrazioni ammissibili in (µµµµg/L) delle sostanze tossiche nelle acque di uso potabile

Parametro Concentrazione massima ammissibile

Antiparassitari 0.1

per componenti totali 0.5

Idrocarburi policiclici aromatici 0.2

Cianuri 50

Arsenico 10

Cadmio 5

Mercurio 1

Piombo 50

27

ORGANOFOSFATI

PESTICIDI

CARBAMMATI

TRASMISSIONE DELL’ IMPULSO NERVOSO

28

BIOSENSORE PER LA MISURA DI PESTICIDI

Biosensore:

--enzima Acetilcolinesterasienzima Acetilcolinesterasi

AcetiltiocolinaAcetiltiocolina + H+ H22OO Tiocolina + acido aceticoTiocolina + acido aceticoAChEAChE

elettroattivaelettroattiva

SPE

MISURAMISURA

Tampone + substratoStep 1Step 1

misura dell’attività enzimaticaprima dell’esposizione alpesticida (i0)

3 Steps � Step 1: misura dell’attivitàenzimatica iniziale (i0)

� Step 2: inibizione

�Step 3: misura dell’attivitàenzimatica residua (ii)

29

tempo diincubazione lavaggio

Step 2Step 2

Soluzione con Pesticida

Step 3Step 3Tampone + substrato

misura dell’attività enzimaticadopo dell’esposizione al

pesticida (ii)

I%=[( iI%=[( i00--iiii)/i)/i00]]••100100

STUDIO DEL DESTINO DEI PESTICIDI DURANTE LA FERMENTAZIONE ALCOLICA

Paraoxon

Aldicarb

30

DeterminazioneDeterminazione del del PiomboPiombonelnel lattelatte

• Acqua potabile 10 µg/l

• Aria 0.5 µg/m3

• Alimenti 0,02-1 mg/Kg

Latte = 0.02 mg/kgLatte = 0.02 mg/kg

Massimo Massimo livellolivello ammissibileammissibile

(Dir. 92/46/CEE)(Dir. 92/46/CEE)

31

ICP-MSASSORBIMENTO ATOMICO

Il Il PiomboPiombo sisi misuramisura ……....

Strumento ElettrochimicoStrumento Elettrochimico

SPE Sensor

32

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4

10

20

30

40

Potential (V)

Cu

rren

t

1 – STEP di PRE-CONCENTRAZIONE

Il Pb2+ è ridotto a Pb° e accumulato sulla superficie del sensore su cui èstato depositato un film di bismuto

2 – STEP di STRIPPING

Il Pb viene ridisciolto riossidandolo e si osserva un picco la cui altezza èproporzionale alla concentrazione del Pb nel latte

Analisi Analisi didi StrippingStripping

METODO UFFICIALE AOAC DI METODO UFFICIALE AOAC DI TRATTAMENTO DEL LATTETRATTAMENTO DEL LATTE

PROBLEMI: METODO LUNGO E TEMPERATURE MOLTO ALTEPROBLEMI: METODO LUNGO E TEMPERATURE MOLTO ALTE

���� Seccare i campioni per tutta la notte a 120 120 °°CC

���� Collocare il campione in forno a 250 250 °°CC ed aumentare lentamente la temperatura a 350 350 °°CC fino a quando cessano i fumi prodotti

���� Aumentare la temperatura lentamente a 500500°°CCLasciar incenerire per tutta la notte a 500500°°CC

Se la cenere è grigia invece che bianca: HNO3 + 3 h di forno

33

Precipitazione delle ProteinePrecipitazione delle Proteine

Trattamento del LATTETrattamento del LATTE

latte

Acidi

1. Addizione di H2O2 e Sonicazioneper 30 min

2. Addizione di HClO4 e Sonicazioneper 15 min

3. Addizione di HCl e Centrifugazionea 48000g per 10 min

4. Filtrazione del supernatante

5. Diluzione 1:4

6. Filtrato a pH 2

TEMPO TOTALE = 1 h

Sviluppo di un programma Sviluppo di un programma ad hocad hoc

34

10 ppb

20 ppb

10 ppb

20 ppb

milk

milk

Procedura di misuraProcedura di misura

REAZIONE ENZIMATICAS

P

SEGNALE ELETTROCHIMICO

Y Y Y

Y Y Y

35

TRICOTECENI TIPO-A ED AFLATOSSINA B1

Fusarium

Tricotecene di tipo-A

TT--2 HT2 HT--22

TDI*:0.06 µg/kg: T-2 + HT-2

Livello MassimoCirca 200 ppb

25-50 ppb (baby food)* t-TDI: Temporary-Tolerable Daily Intake

Aspergillus

Aflatossina B1

O

O

O

OO

OMe

AFBAFB11

Livello Massimo

2 ppb – Maize, cereal, etc.

5 ppb – Unprocessed food

MISURA AFLATOSSINA B1

Trattamento del campione

Misura elettrochimica

500 µl di AFB1 o PBS

25.0 g di grano macinato + 2.5 g di NaCl

Estrazione per 3 min ad alta velocitàdi agitazione con 50 ml dimetanolo/acqua (80/20)

Centrifugazione a 6000 rpm per 10 min

Diluzione 1:5 v/v in PBS

Centrifugazione a 6000 rpm per 10 min

AFB1 (ng mL-1)

0.1 1 10 100

Cur

rent

(µA

)

0

1

2

3

4

curva standard in PBS

MisuraMisura AFBAFB11 nelnel solventesolvente didi estrazioneestrazione

AFB1 in estratti di grano

EC50 = 1.2 ng/mlLOD = 0.2 ng/mlWR = 0.2 - 5 ng/ml

TEMPO TOTALE DI ANALISITEMPO TOTALE DI ANALISI(incluso trattamento)(incluso trattamento)MENO di 25 min!!!MENO di 25 min!!!

36

Analisi di BATTERI PATOGENI Analisi di BATTERI PATOGENI neglineglialimentialimenti

Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and E. coli sono considerati la maggiorcausa di tossinfezioni alimentari nei paesiindustrializzati.

I metodi colturali standard richiedono fino a 5-6 giorniper dare un risultato.

Metodo colturale standard per la Metodo colturale standard per la SalmonellaSalmonella

(ISO 6579:2002)(ISO 6579:2002)

•••• Pre-arricchimento per permettere la riattivazione e la multiplicazione delle cellule danneggiate;

•••• Arricchimento Selettivo per aumentare il rapporto tra il batterio in esame e i microrganismi competitori;

•••• Isolamento su agar selettivo delle colonie caratteristiche;

•Conferma tramite tests biochimici e sierologici.

Tempo: fino a 5 giorniTempo: fino a 5 giorni

Il nostro obiettivo è stato lo sviluppo di immunosistemi elettrochimici semplici e rapidi per la misura specifica della Salmonella.

Secondo la legislazione Europea, la Salmonella deve essere assentein 25g di prodotto alimentare.

37

MISURA

magneteElettrodoElettrodo

Screen Printed Screen Printed

Immunosensore Elettrochemico

Principio di misura

HRP

-

salmonella

IMB

anti-mouse IgG

MAb

PAB

S . E n te r itid is

1 .e + 3 1 .e + 4 1 .e + 5 1 .e + 6 1 .e + 7 1 .e + 8 1 .e + 9

Cor

rent

e (µ

A)

4

8

1 2

1 6

2 0

Salmonella

LOD = 3 x 10LOD = 3 x 1033 CFU/mlCFU/ml

CURVA DI CALIBRAZIONE USANDO LE MBsCURVA DI CALIBRAZIONE USANDO LE MBs

38

Pre-enrichment Time (h)0 2 4 6 8 10 12

Cur

rent

(µµ µµA

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18PORK

TURKEY

0 2 4 6 8 10 120

5

10

15

20

25

Pre-enrichment Time (h)

Cur

rent

(µµ µµA

)

BEEF

Pre-enrichment Time (h)0 2 4 6 8 10 12

Cur

rent

(µµ µµA

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

CHICKEN

0 2 4 6 8 10 120

5

10

15

20

Pre-enrichment Time (h)

Cur

rent

(µµ µµA

)

Il tempo minimo di pre-arricchimento è risultato variabile, probabilmente a causa della presenza di microrganismi competitori naturalmente contenuti nei campioni di carne. Tuttavia un massimo di 6h di pre-arricchimento è stato sufficiente per rivelare la presenza di salmonella in tutti i casi.

▲ Campioni sperimentalmente contaminati (1-10 cell/25g)

● Campioni non-contaminati (negativi al test microbiologico)

CAMPIONI SPERIMENTALMENTE CONTAMINATICAMPIONI SPERIMENTALMENTE CONTAMINATI

Samples ELIME PCRCultural Method Agglutination

method

pork - - -

pork - - -

pork + + + S. infantis

turkey - - -

chicken - - -

chicken + + + S. Enteritidis

chicken - - -

beef - - -

beef - - -

beef + + +S. Anatum

Analisi dei campioni di carne non sperimentalmente contaminati con metodo elettrochimico, PCR e metodo colturale classico

10 campioni di carne non sperimentalmente contaminati sono stati analizzati e solo tre di questi campioni sono risultati positivi per Salmonella con il metodo classico culturale, la PCR (dopo 5 ore di pre-arricchimento) ed il metodo elettrochimico

(dopo 6 ore di pre-arricchimento).

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Il gruppo:Prof. G. PalleschiProf. D. MosconeDr G. VolpeDr L. MicheliDr F. RicciDr F. Arduini Dr F. ValentiniDr S. Piermarini Visiting Prof. A.Amine

B.E.A.T. B.E.A.T. BioElettroAnaliticaBioElettroAnalitica ““Tor VergataTor Vergata””

www.uniroma2.it/dipartim/BEATwww.uniroma2.it/dipartim/BEAT

Dr J. Calvo QuintanaDr D. NeaguDr V. BiagiottiDr D. RomanazzoDr G. AdornettoDr F. CaprioDr F. Dell’UntoDr A. De StefanoDr D. MigliorelliDr A. PorchettaDr U. Sozzo

…gli studenti in tesi…