Universidad autnoma ChapingoDepartamento de ingeniera agroindustrial

Supervivencia de Lb. acidophilus como microflora acompaante de yogur

(Protocolo de investigacin)

Presentan:Arline Grajales Daz Zeus Hernndez Prez Obeth Perdomo Valentn

Director:Dr. Sandine Shirota

Chapingo, Texcoco, Edo. Mxico. Mayo 2014 I. INTRODUCCINEn el siguiente documento se presentara informacin acerca de la investigacin que se realizara, con respecto al momento de inoculacin adecuado en yogur, para asegurar la mejor supervivencia de L. acidophilus, con la finalidad de poder obtener un yogur con caractersticas probiticas ya que de acuerdo a investigaciones realizadas con dicha especie se ha catalogado a L. acidophilus probitico y a pesar de que ya existen productos de esta ndole quienes lo fabrican no especifican la manufactura de su proceso.El documento expone la primera fase de la investigacin que consiste en la presentacin del protocolo de investigacin, el cual contempla dentro de su contenido la investigacin previa donde se habla sobre la historia del yogur, las cepas participantes en la fermentacin as como de las propiedades y diferencias del yogur probitico y el yogur natural, tambin en el marco terico se explica que es una cepa probitica y las caractersticas que las definen y les dan dicho calificativo. Explica adems los factores que pueden verse involucrados durante la fermentacin y hace referencia a investigaciones que ya han sido llevadas a cabo con L. acidophilus.Posteriormente al marco terico se presenta los antecedentes y la justificacin que respaldan a la investigacin que se pretende realizar de la misma forma se plantea el problema de investigacin con las hiptesis que dirigirn la investigacin y el diseo experimental, aunado a el problema se exponen los objetivos tanto general como particular. El protocolo de investigacin abarca tambin un apartado de materiales y mtodos en el cual se explica cmo se inoculara L. acidophilus y en qu momento as como el mtodo que se llevara a cabo para realizar la cuenta de clulas viables y cada cunto y cmo.En el documento se da a conocer el cronograma de actividades y los recursos de los cuales se dispone para llevar a cabo la investigacin.1

II. REVISIN BIBLIOGRFICAEl tracto intestinal humano constituye un complejo ecosistema de microorganismos. Ms de 400 especies de bacterias han sido identificadas en las heces de un solo sujeto (Finegold et al., 1977). La poblacin bacteriana en el intestino grueso es muy alta y alcanza el mximo de 1012 ufc g-1. En el intestino delgado el contenido bacteriano es considerablemente inferior, 104-108 ufc g-1, mientras que en el estmago se encuentran slo 101-102 ufc g-1 debido al bajo pH (Lourens-Hattingh, 2001).Las bacterias cido lcticas (BAL) abarcan una amplia gama de gneros e incluyen un nmero considerable de especies. Estas bacterias son el componente principal de los starters usados en las fermentaciones, especialmente para los productos lcteos, y algunos de ellos tambin son componentes naturales de la microflora gastrointestinal y Lactobacilus es uno de los ms importantes (Djomne et al, 2011).Durante los ltimos quince aos, el gnero Lactobacilus ha evolucionado y existen hasta la fecha ms de 80 especies. Estn presentes en la leche cruda y productos lcteos como quesos, yogures y leches fermentadas (Djomne et al, 2011).El yogur es un producto de la fermentacin de cido lctico de la leche por la adicin de una cultivo starter que contiene Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. (Mc.kinley, 2005). El yogur es uno de los productos lcteos de mayor distribucin. El yogur en diferentes formas con diversos nombres locales se hace en todo el mundo. El uso de yogur se remonta a muchos siglos, aunque no hay registro exacto de la fecha en que se hizo por primera vez. La singularidad de yogur es atribuible a la fermentacin simbitica que intervienen en su fabricacin. La composicin de yogur es dependiente del tipo y fuente de leche y una variedad de factores estacionales. (Hussain, et Al, 2009). Aunque los productos lcteos fermentados como yogures fueron desarrollados originalmente como un medio de preservar los nutrientes de la leche, pronto se descubri que, por la fermentacin con microorganismos diferentes, exista una oportunidad para desarrollar una amplia gama de productos con diferentes sabores, texturas, consistencias y recientemente, atributos de la salud (Ganesh, 1993). 2

S. thermophilus y L. bulgaricus exhiben una simbitica relacin durante el procesamiento de yogur, con la relacin entre la especie en constante cambio (Radke-Mitchell un Sandine, 1984). Durante la fermentacin, S. thermophilus crece rpidamente al principio, utilizando esencial aminocidos producidos por L. bulgaricus y S. thermophilus, a cambio, produce cido lctico, que reduce el pH a un nivel ptimo para el crecimiento de L. bulgaricus (Lourens-Hattingh, 2001).La palabra "probitico", derivado del griego lenguaje, significa "para la vida" y ha tenido muchas definiciones en el pasado. Definiciones tales como 'sustancias producidas por protozoos que estimulan el crecimiento de otros "o" los microorganismos y sustancias que tienen un efecto beneficioso sobre el animal husped, contribuyendo a su equilibrio microbiano intestinal (Fuller, 1989).La supervivencia de las bacterias probiticas en los productos lcteos fermentados, depende de factores tan variados como la cepas utilizadas, la interaccin entre las especies presentes, las condiciones del cultivo, la composicin qumica de la fermentacin (por ejemplo, hidratos de carbono de origen), acidez final, contenido de slidos en la leche, la disponibilidad de nutrientes, factores de crecimiento e inhibidores, la concentracin de azcares (presin osmtica), oxgeno disuelto (especialmente para Bifidobacterium sp.), el nivel de inoculacin, la temperatura de incubacin, tiempo de fermentacin y la temperatura de almacenamiento.Diferencias entre el yogur probitico y el yogur naturalLa adicin de bacterias probiticas se hace no slo debido a ciertos efectos que promueven la salud reclamados en el tracto intestinal. Otros efectos beneficiosos para la salud incluyen la mejora del sistema inmune, reduccin de la intolerancia a la lactosa, el control de la diarrea y la reduccin de colesterol LDL.3

El pH del yogur probitico y el yogur natural es en ambos casos bajo sin embargo se registra que el pH del yogurt probitico es ms alto que el del yogurt natural, posiblemente debido a la baja cuenta viable de bacterias probiticas durante el periodo de almacenamiento (Hull, et Al, 1984). El promedio de protena contenido de yogur probitico es de 5.4, mientras que el contenido medio de protenas de yogurt natural es de 5,3. Segn Janhoj et al. (2006) quien inform que el contenido de protenas de bajo contenido graso yogur agitado vara entre 3,4 y 6,0%. El contenido medio de materia grasa del yogur probitico es de 0,76, mientras que el contenido medio de materia grasa de yogur natural fue de 0,29. (Janhoj et Al. 2006) inform que la grasa contenido oscilaba desde 0,3 hasta 3,5%. El promedio total contenido de slidos de yogur probitico es de 17%, mientras que el promedio total contenido de slidos de yogur natural es de 19,2%. Muhammad et al. (2005) quienes reportaron el rango ms alto de slidos totales en yogur es de 17.1 %, pero en el caso del yogur natural estos resultados son significativamente diferentes (Hussain, et Al, 2009).De acuerdo a los estudios realizados por (Hussain, et Al, 2009). Los valores medios de la aceptabilidad general del yogur probitico y el yogur natural fueron 4,95 y 4,20 con un estndar desviacin de 1,52 y 1,66 respectivamente. Color, sabor y aroma son los factores importantes que determinan la aceptacin o rechazo de un producto alimenticio. Entre probitico y las muestras de yogur natural, el promedio general puntuacin de aceptabilidad fue mayor para el yogur probitico en comparacin con el yogur natural. Lactobacillus acidophilus es una cepa disponible en el mercado que se ha utilizado en los Estados Unidos en la leche y el yogur productos desde mediados de los 1970, los suplementos dietticos desde mediados de 1980 y ha sido objeto para la investigacin cientfica in vitro e in vivo por dcadas.Propiedades biolgicas deseables en las cepas probiticas: Husped original del humano.4

Resistencia a cidos y bilis. Adherencia a las clulas del intestino humano. Colonizacin. Antagonismo con bacterias patgenas. Produccin de substancias antimicrobianas.Lactobacillus acidophilus es una cepa humana que se aisl en el 1970 en la Universidad del Estado de Carolina Norte. Desde el aislamiento, esta cepa se ha estudiado ampliamente en muchas investigaciones in vitro y en aplicaciones in vivo.La funcin probitica requiere que la cepa sobreviva a lo largo del tracto gastrointestinal. Lb. acidophilus fue recuperado de las heces humanas de los sujetos alimentados con leche no fermentada que contiene NCFM. Esta diferencia significativa expresada como un incremento en el total de lactobacilus en las heces, fue atribuida a la buena supervivencia de las cepas durante el trnsito. Estos datos demostraron que la cepa NCFM es viable en el estmago, pncreas y cidos biliares. (Brassart, 2003). Lactobacillus acidophilus es un habitante normal del intestino de muchos animales incluido el hombre. Juega tal vez uno de los ms importantes roles en el mantenimiento del balance de la flora intestinal, a travs de la produccin de inhibidores microbianos y por la produccin de enzimas.Las bacterias probiticas tales como las bifidobacterias y lactobacilos poseen propiedades antimicrobianas (Hughes un Hoover, 1991). Tanto L. acidophilus y B. bifidum tienen ha demostrado que es inhibitoria frente a muchos de los patgenos de alimentos comnmente conocido soportados. Varios estudios indicaron el control preventivo de infecciones intestinales a travs de la administracin en leche de L. acidophilus o B. bifidum o ambos (Lourens-Hattingh, 2001).Cepas de Lactobacillus acidophilus pueden ser consumidos en un nmero de productos alimenticios incluyendo los basados en leche acidfila. En el yogur blgaro tradicional L. acidophilus es encontrado como parte de la microflora natural. 5

Biogurt/Biogarde Company produce un producto acidfilo usando Streptococus thermophilus y L. acidophilus como iniciadores, resultando un yogurt llamado biogurt.Bio-yogur, contiene L. acidophilus y B. bifidum (AB-yogurt), es un vehculo potencial por el cual los consumidores puede tomar en las clulas probiticas. El nmero de probitico bacterias necesarias para producir un efecto beneficioso, no tiene ha establecido. Kurmann y Rasic (1991) sugirieron para lograr potenciales efectos teraputicos ptimos, la nmero de organismos probiticos en un producto probitico debe cumplir con un mnimo recomendado de> 106 cfumL-1 (Lourens-Hattingh, 2001).Davis (1970) adicion L. acidophilus a el yogur despus de su manufactura Gilliland y Speck (1977) reportaron que era inestable este mtodo y que los organismos rpidamente moran durante el almacenamiento en refrigeracin, con menos del 1% de sobrevivientes a los 7 das a 5C.Cuando se aadi un cultivo de L. acidophilus antes de la fabricacin de yogur en el momento de la adicin de arranque, los organismos de L. acidophilus aumentaron 3-5 veces en la leche del yogur llegar a 1-2 por ml en el yogur conjunto. Los organismos sobrevivieron bien en 5 C con 50% viables despus de 2 semanas y 15% viables despus de 4 semanas.En contraste, cuando se aadi un cultivo de L. acidophilus despus de la fabricacin para configurar y se enfri el yogur, los organismos de L. acidophilus pierden rpidamente viabilidad, con menos que 1% sobreviviente despus de 4 das de almacenamiento a 5 C (Hull, et al, 1984). Para una cultura que se considera un candidato valioso para su uso como un complemento diettico y para ejercer una positiva influencia, debe cumplir con ciertos requisitos (Martin un Chou, 1992). El cultivo debe ser un habitante normal del tracto intestinal humano, sobrevive paso por el tracto digestivo superior en gran nmero, ser capaz de llenar un nicho ecolgico, y tener efectos beneficiosos cuando en el intestino. Con el fin de sobrevivir, la cepa debe ser resistente a sales biliares presentes en el intestino grueso, las condiciones gstricas (pH 1-4), enzimas presentes en el intestino (lisozima) y metabolitos txicos producidos durante digestin. 6

Las bacterias utilizadas en la tradicional fermentacin del yogur Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus, no pertenecen a la flora nativa intestinal, no son resistentes a los cidos biliares y no logran sobrevivir el paso a travs del intestino. Estas bacterias tradicionales del yogur tienen efectos positivos como resultado de los metabolitos producidos durante la fermentacin, ya sea por una accin inhibitoria frente a patgenos o mejora de la digestin de la lactosa (Lourens-Hattingh, 2001).La supervivencia de los microorganismos se ve afectada por el pH bajo del medio. Hood y Zottola (1988) reportaron que L. acidophilus (cepa BG2FO4) mostr una rpida disminucin en su nmero a pH de 2,0 pero a pH 4,0 el nmero de clulas viables no disminuyeron significativamente. L. acidophilus sobrevive mejor que los microorganismos tradicionales del cultivo del yogur, L. bulgaricus y S. thermophilus, bajo condiciones cidas.En un estudio realizado por Gilliland y Speck (1977), L. acidophilus aadido al yogur disminuy en nmero durante el almacenamiento en refrigeracin. Sustancias producidas por L. bulgaricus caus esta inestabilidad. El perxido de hidrgeno producido durante la fabricacin y almacenamiento de yogur que pareca ser la principal sustancia responsable de la antagonismo de L. bulgaricus hacia L. acidophilus. Agregando catalasa reduce el antagonismo. Hull, Roberts, y Mayes (1984) se refirieron a la dramtica prdida de viabilidad de L. acidophilus como muerte acidfila. L. acidophilus no pudo sobrevivir en el yogur comercial cuando altas poblaciones de L. bulgaricus estuvieron presentes. Hull et al. (1984) observaron que el Lb. acidophilus tena mejor estabilidad en yogur durante el almacenamiento en refrigeracin si se adiciona al mismo tiempo que los cultivos de yogur tradicionales, y que permite el crecimiento durante el proceso de fermentacin. Lb. acidophilus aadido despus de la fabricacin del yogur muere rpidamente y la tasa de supervivencia despus de 4 das de almacenamiento a 51C era slo el 1%. Estos resultados fueron apoyados por Gilliland y Speck (1977). La muerte de las clulas de L. acidophilus se atribuy a los efectos del perxido de hidrgeno producido en el yogur. La mejor supervivencia de L. acidophilus se obtuvo debido al aumento de la tolerancia a perxido de hidrgeno cuando los cultivos de acidophilus y el yogur crecan de forma simultnea. Al parecer, L. acidophilus desarroll la capacidad de dividir el perxido de hidrgeno.7

El tamao del inculo de bacterias probiticas es un factor clave importante para asegurar suficientes clulas viables al final del producto alimenticio. Segn Samona y Robinson (1994).Los beneficios para la salud de Lactobacillus acidophilus incluyen: inmunidad contra las infecciones o cncer, proporciona un sustituto de bacterias buenas en el tracto intestinal despus de una terapia con antibiticos, reduce la incidencia de diarrea en los seres humanos, ayuda a disminuir el colesterol y mejora los sntomas de intolerancia a la lactosa.Se puede recomendar el uso del probitico Lb. acidophilus con una proporcin de 100g/gal en la fabricacin de un saludable yogur como un yogur jerkey o un yogur aflanado capaz de ser almacenado a temperatura ambiente (Ganesh, 1993).Recientemente, se ha estudiado el papel de las leches fermentadas que contienen bacterias cido lcticas (BAL), tales como Lactobacillus, Bifidobacterium y Streptococcus thermophilus. (Sakai et al. 2004) Se ha estudiado una amplia gama de otros beneficios para la salud, incluyendo el mejoramiento de la digestin de lactosa, la prevencin de la diarrea, regulacin del sistema inmune y la reduccin del colesterol en el suero, los cuales se han atribuido al consumo de leche fermentada.Lb. acidophilus ofrece una amplia gama de beneficios para la salud que incluyen: proporcionar apoyo inmune a infecciones y cncer, es un saludable sustituto de bacterias buenas en el tracto intestinal despus de la terapia antibitica, reducir la incidencia de diarrea en los seres humanos (nios y adultos), ayuda a reducir el colesterol, mejora los sntomas de intolerancia a la lactosa. Efecto antitumoral de Lb. acidophilus fue reportado por Goldin y Gorbach (1984). Los suplementos orales que contienen clulas viables de L.acidophilus disminuyen la -Betaglucuronidasa, azoreductasa y nitroreductasa, enzimas bacterianas, que catalizan la conversin de procarcingenos en carcingenos. El efecto anticancergeno de Lb. Acidophilus puede deberse a la eliminacin directa de procarcingenos y la activacin del sistema inmunolgico del cuerpo. Los estudios en animales han demostrado que la suplementacin diettica con Lb. acidophilus hace que disminuya del nmero de clulas de cncer de colon (Rao et Al., 1999)8

Segn la Asociacin Nacional de yogur, para un yogur refrigerado la poblacin total de microorganismos vivos y activos de un cultivo en yogur debe ser 108 ufc/g en el momento de fabricacin y del yogur congelado debe ser por lo menos 107 ufc/g en el momento de la fabricacin.Hull et al (1984), observ Lb. acidophilus adicionado en el yogurt antes de su fabricacin, en la etapa de la adicin del starter se multiplica durante su fabricacin y alcanza 107 microorganismos viables por mililitro en el producto terminado y sobrevive a 5C durante varias semanas. La mejor supervivencia de Lb. acidophilus se da cuando se agrega junto con el cultivo starter (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus.), debido a la presunta tolerancia transitoria del cultivo al perxido de hidrgeno.El pH es el ms crucial de los elementos para el cultivo de Lb. acidophilus, un yogur con pH