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Corso di Biotecnologie interfacoltà Modulo: Laboratorio di Microbiologia medica ed applicata Prof.ssa Christine Schwienbacher UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI FERRARA Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica Sezione di Microbiologia Anno Accademico 2011 - 2012

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Corso di Biotecnologie interfacoltàModulo: Laboratorio di Microbiologia

medica ed applicata Prof.ssa Christine Schwienbacher

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI FERRARA

Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica

Sezione di Microbiologia

Anno Accademico 2011 - 2012

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Presentazione corso batteriologico:

• Urinocoltura:

semina quali-quantitativa

• Valutazione della crescita batterica su diversi terreni

• Antibiogramma secondo Kirby-Bauer

• Identificazione mediante sistema biochimico (API oppureEnterotube)

• PAR test

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Campione urine

ESAMINARE IL CAMPIONE ENTRO

2 ORE DAL PRELIEVO oppure

CONSERVARE A +4°C PER 24 ORE

Semina quali-quantitativa (Ricerca patogeni causa

di infezione) : TSA terreno TVC totale.

TERRENI SELETTIVI:

MacConkey, mEnterococcus, Columbia agar, Cetrimide agar

Chromogenic UTI Medium

Dopo incubazione

Interpretazione:

lettura piastre

2-Identificazione : test

biochimici (Enterotube II)

1-Antibiogramma

(Test sensibilità MIC=

Minima concentrazione

inibente)

PAR test

(Potere antibatterico residuo)

Refertazione

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• FASE 1

– Semina quali-quantitativa urine su piastra di diversi terreni:

– TCV => TSA TERRENO GENERICO BASE

– TERRENI SELETTIVI:

• Agar MacConkey 3

• Agar mEnterococcus, Columbia agar, Cetrimide agar

• Chromogenic Urinary Tract Infection(UTI) Medium

• FASE 2:

– Interpretazione semina su piastra

– Allestimento PAR test

• FASE 3

– Interpretazione PAR test

• FASE 4:

– Allestimento Antibiogramma

– Allestimento API oppure Enterotube

• Fase 5:

– Interpretazione Antibiogramma

– Interpretazione API oppureEnterotube

– Conclusioni finali: REFERTO

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FASE 1: Semina quali- quantitativa urine su TSA agar, MacConkey, mEnterococcus , Columbia agar, Cetrimide agar e Chromogenic Urinary Tract (UTI) Medium.

AGAR MACCONKEY n.3Terreno selettivo per differenziare in modo ottimale i coliformi

ed enterobatteri patogeni non fermentanti il lattosio :

Composizione

.

DescrizioneÈ una modificazione altamente selettiva del terreno MacConkey,adatta per la crescitae il conteggio dei batteri coliformi ed anche per la loro differenziazione dagliAltri coliformi, gli enterobatteri patogeni come Salmonella e Shigella, che nonfermentano il lattosio.La presenza i una frazione particolare di sali biliari in aggiunta al cristal-violetto, ilterreno migliora la differenziazione fra coliformi e microrganismi che nonfermentano il lattosio. I cocchi gram positivi (esempio Staphylococcus spp.) sonocompletamente inibiti.

Peptone 20.0 g/l

Lattosio 10.0 g/l

Sali biliari n3 1.5 g/l

Sodio cloruro 5.0 g/l

Rosso neutro 0.03 g/l

Cristal violetto 0.001 g/l

Agar 12.0 g/l

pH = 7.0 +/- 0,2

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ASPETTO DELLE COLONIE

Le caratteristiche delle colonie rappresentano un’identificazione

solo presuntiva, che deve essere confermata mediante test

biochimici specifici (esempio Enterotube II).

I batteri che fermentano il lattosio (es. E. coli) danno coloniecircondate da un alone di sali biliari precipitati (questa reazione èdovuta all’azione di acidi prodotti dalla fermentazione del lattosiosui sali biliari e il successivo assorbimento del rosso neutro(perciò le colonie di E. coli risultano di colore rosso-viola).I batteri che non fermentano il lattosio (es. Salmonelle) nonmodificano il colore del terreno; danno una reazione alcalina e lecolonie appaiono trasparenti.

Tecnica:Inoculare le piastre ed incubare a 35±2°C per 16- 24 ore perbatteri che non fermentano il lattosio e fino a 48 h per batteri che fermentano illattosio.

MICRORGANISMO COLORE OSSERVAZIONI

ESCHERICHIA COLI COLONIA VIOLA CON ALONE DI

PRECIPITAZIONE ROSSO

PSEUDOMONAS AERUGINOSA INCOLORE -ROSA COLONIE IRREGOLARI

COCCHI GRAM+ INIBITI : NON CRESCONO

ENTEROBACTER AEROGENES ROSSO MATTONE SENZA ALONE DI

PRECIPITAZIONE

COLONIE PIÙ PICCOLE DI E.COLI

SALMONELLA/SHIGHELLA INCOLORE TRASPARENTE

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mENTEROCOCCUS

Terreno selettivo per l’isolamento degli Enterococchi.

Composizione

Descrizione

Questo terreno evidenzia gli enterococchi (streptococchi del gruppo D); tutte le

colonie rosse, marroni o rosa sono da considerare presunti enterococchi.

Inibito E. coli.

Conservazione delle piastre di terreno prima dell’uso: temperatura di +2 /+8°C.

Triptosio 20.0 g/l

Estratto di lievito 5 .0 g/l

Destrosio 2.0 g/l

Sodio fosfatomonoacido idrato 4 .0 g/l

Sodio azide 0.4 g/l

Tetrazolio cloruro (TTC) 0.1 g/l

Agar 10.0 g/l

pH = 7.2 +/- 0,2

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mENTEROCOCCUS

Terreno selettivo per l’isolamento degli Enterococchi.

ASPETTO DELLE COLONIE

MICRORGANISMO COLORE

ENTEROCOCCHI (STREPTOCOCCHI DEL GRUPPO D)

COLONIE DI COLORE ROSA-ROSSO SCURO-MARRONE

ESCHERICHIA COLI NESSUNA CRESCITA

ENTEROCOCCUS FAECALIS CRESCITA ABBONDANTE CON COLONIE DI COLORE ROSA -ROSSO SCURO

Tecnica: Inoculare le piastre ed incubare a 37±2°C per 24-48 ore per evidenziare le

caratteristiche colturali dei microrganismi cresciuti.

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CHROMOGENIC TRACT URINARY INFECTION (UTI) MEDIUM

Terreno cromogeno per l’identificazione presuntiva e la differenziazione della maggior parte di

patogeni che possono causare infezioni del tratto urinario (UTI).

Il terreno contiene due substrati cromogeni specifici che sono scissi da enzimi prodotti da

Enterococcus spp., da Escherichia coli e dai coliformi.

Contiene, inoltre, triptofano per mettere in evidenza l’attività dell’enzima triptofano deaminasi che, a

sua volta, indica la presenza di Proteus spp..

Lo scarso contenuto di elettroliti che presenta il terreno Chromogeni UTI impedisce la sciamatura

del batterio Proteus spp..

Composizione

DescrizioneIl bersaglio del primo cromogeno, X-Glucoside, è la b-glucosidasi e consente di identificare in

modo spedifico gli enterococchi che formano colonie blu.

L’altro cromogeno, Rosa-Galattoside, è scisso dall’enzima b-galattosidasi che è prodotto da

Escherichia coli, che forma colonie rosa.

Quando vi sono incertezze di identificazione si può eseguire il test biochimico seguente: si

preleva dalla piastra una colonia di E. coli sospetta e si esegue il test dell’indolo con reattivo

DMAC.

Peptone 15.0 g/l

Miscela cromogena 13.0 g/l

Agar 15.0 g/l

pH=7,0+/-0,2

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I coliformi vengono differenziati perché si avviene la scissione

di entrambi i cromogeni formando colonie di colore porpora.

Il terreno contiene inoltre triptofano che si comporta da

Indicatore dell’attività triptofano deaminasica: Proteus, Morganella e

Providencia spp. formano colonie circondate da un alone marrone.

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E’ importante precisare che i batteri con “pattern” enzimatici atipici

possono fornire reazioni anomale.

Per esempio, durante una semina

su terreno Chromogenic UTI, oltre il 45% di Enterobacter cloacae

saggiati ha evidenziato la mancanza della b-glucosidasi.

Le colonie di tali ceppi sono risultate di colore rosa, difficilmente

distinguibili da quelle di E. coli.

In questi casi si esegue su carta da filtro il test dell’indolo con reattivo

DMAC oppure utilizzare il reattivo di Kovacs, si dovrebbe evidenzia re il colore rosa - bordeaux della reazione positiva del test dell’indolo).

Questo test consente di differenziare E. coli da Enterobacter spp. ,

nonché Proteus mirabilis da altre specie.

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ASPETTO DELLE COLONIE:

Tabella delle reazioni colorimetriche tipiche

Tecnica:Inoculare le piastre ed incubare a 37±2°C per 24-48 ore per evidenziare le

caratteristiche colturali dei microrganismi cresciuti.

MICRORGANISMO b-D GALATTOSIDASI

b -GLUCOSIDASI

TDA TRIPTOFANO DEAMINASI

COLORE DELLE COLONIE

ENTEROCOCCHI + BLU

ESCHERICHIA COLI + ROSA

COLIFORMI + + PORPORA

PROTEUS /MORGANELLA E PORVIDENCIA SPP.

+ MARRONE

PSEUDOMONAS FLUORESCENTE

STAPHYLOCOCCUS PIGMENTAZIONE NORMALE

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Organism ß-galactosidase ß-glucosidase TDA Colony colour

Enterococci - + - Blue

E. coli + - - Pink

Coliforms + + - Purple

Proteus/Morganella& Providencia spp.

- - + Brown

Pseudomonads - - - Fluoresce

Staphylococci - - -Normal

pigmentation

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Terreno:

Chromogenic UTI Medium :

Blu-verdi = Colonie di Enterococchi

Rosa= colonie di Escherichia coli

Azzurre= colonie di coliformi (Gruppo KES)

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Pseudomonas

aeruginosa

Enterobacter

cloacae

Proteus mirabilis

Enterococcus

faecalis

Escherichia Coli

Staphylococcus

aureus

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Metodo: SEMINA QUANTITATIVA

• Materiale:– urine

– 1 piastra Macconkey3

– 1 piastra mEnterococcus

– 1 piastra Chromogenic Urinary Tract Infection (UTI) Medium

– 3 anse blu da 10 l (1 ansa blu per ogni terreno :

Macconkey3, mEnterococcus e Chromogenic UTI Medium)

– 1 pennarello

– Guanti

• Procedimento:

– Scrivere il nome e la data sul fondo delle piastre

– Immergere l’ansa blu da 10 l nella provetta delle urine per prelevare il campione eseminare su piastra Chromogenic UTI Medium nel seguente modo:

– Immergere l’ansa blu da 10 l nella provetta delle urine per prelevare il campione e

1 2

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Dipslide

• IL SISTEMA PERMETTE DI QUANTIFICARE L'INFEZIONE contando il numero di colonie: più di 20-25 corrispondono a una conta di 100.000

IL SISTEMA PERMETTE DI QUANTIFICARE L'INFEZIONE contando il numero di colonie: più di 20-25 corrispondono a una conta di 100.000 (Clicca sull'immagine per ingrandirla)

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Giorno 2:

INTERPRETAZIONE SEMINA IN PIASTRALettura piastra:

si esegue visivamente la conta delle colonie;

In caso di:

1)-assenza di crescita (nessuna colonia presente): il risultato si esprime come segue:

< 1000 CFU/ml;

2)-presenza di colonie:2.1- eseguire visivamente la conta delle colonie; 2.2- il N.° di colonie conteggiate deve essere moltiplicato x 100 se si utilizza l’ansa da 10 microlitri = 1/ 100 ml [oppure x 1000 se si utilizza l’ansa gialla da 1 microlitro];2.3- L’unità di misura si esprime nel seguente modo:

CFU/ml oppure UFC/ml (CFU o UFC = Unità Formante Colonia / ml).La determinazione della carica microbica deve essere eseguita per ogni tipo di colonia morfologicamente diversa.Per indicare positiva una urinocoltura (presenza di infezione) si deve ottenere una conta = o > a 105 CFU/ml (= 100.000 germi/ml) per campione ottenuto da mitto intermedio.In caso di valori inferiori a 10 4 CFU/ml sono indice di contaminazione.

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Giorno 2:

INTERPRETAZIONE SEMINA IN PIASTRALettura piastra:

si esegue visivamente la conta delle colonie;

Tipo colonia (specificare l’aspetto) numero

Somma delle colonie

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Test del POTERE ANTIMICROBICO RESIDUO (PAR test)

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• Il test individua

– Residui di farmaci antibiotici

– Residui di farmaci non antibiotici dotatidi attività antimicrobica

– Sostanze naturali con effettoantimicrobico simile

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Numerose piante sono dotate di potere antimicrobico:

• Vari cereali

• Carote

• Patate

• Liliacee come aglio e cipolla

• Crocifere (senape, rafano)

• Propoli

• Aloe vera

• Estratti di semi di pompelmo

• Rosmarino

• Ceci

• Salvia

• Timo

• Fragole

• Aceto di mele

Numerosi oli essenziali hanno azione antisettica perché contengono

FENOLI ED ALDEIDI (Thymol da Thymus vulgaris)

ALCOOLI (Linalol da Lavandula vera, L. latifolia/spica)

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• Alcuni farmaci NON antibiotici sono dotati di attivitàantibatterica evidenziabile nei liquidi biologici: Esempi:

– Neurolettici

– Antimalarici

– Antistaminici

– Diuretici

– Anti-ulcera

– Anti-ipertensivi

– Anestetici

• Alcuni fattori naturali e principi attivi diversi dagliantibiotici sono dotati di attività antibattericaevidenziabile nei liquidi biologici: Esempi:

– Frazioni del complemento

– Opsonine ed anticorpi specifici

– Proteine di derivazione fagocitaria

– Beta-lisine

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Par test: saggio di diffusione in agar

Inoculo con spore

di Bacillus subtilis

Dischetto imbevuto di urine

Dischetto sterile (CONT NEG)

Dischetto imbevuto di

Penicillina (CONT POS)

37 °C

PAR positivo PAR negativo

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POS

POSNEG

NEGURINE

URINE

PAR TEST POSITIVO PAR TEST NEGATIVO

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Par test: interpretazione

Par - Coltura - Il risultato della coltura è avvalorato

Par- Coltura + Il risultato della coltura è avvalorato

Par+ Coltura - Attenzione alle basse cariche batteriche

Germi difficili?

Esecuzione di test di approfondimento

Richiesta di informazioni cliniche (paziente sintomatico?, terapia antibiotica in atto?)

Assunzione di sostanze antibatteriche con l’alimentazione?terapie alternative con effetto antimicrobico?

Par+ Coltura + Se i paziente è in terapia antibiotica, questa è inefficace

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Par test: ruolo nella diagnosi delle infezioni delle vie urinarie

• Il Par test in associazione all’urinocoltura èfondamentale per una corretta diagnosi delleinfezioni delle vie urinarie

• In assenza di dati clinici: Aiuta il microbiologonell’interpretazione dell’esame colturale

• Strumento aggiuntivo nella diagnosi delle infezionidelle vie urinarie

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Il PAR test è un saggio di diffusione da eseguire in piastre di agar nutritivo inoculato con spore del microrganismo Bacillus subtilis. E’ utilizzato per determinare la presenza di sostanze dotate di

potere antibatterico nei liquidi biologici (latte, urine, sangue, ecc.).

Materiale-piastre di PAR test con la coltura vitale di Bacillus subtilis;

-pinzetta;-dischetti BLANK di diametro 13 mm da utilizzare per immergere nel campione di urine in esame;

-dischetti CONTROL di diametro 13 mm imbibiti di antibiotico come controllo positivo;-dischetti BLANK di diametro 13 mm da utilizzare come controllo negativo.

PROCEDIMENTO:Prelevare con pinzetta un dischetto BLANK ed immergerlo nel campione di urine in esame;

allontanare il liquido in eccesso;-porre il dischetto sulla piastra di PAR Test esercitando una leggera pressione su di esso in modo

da assicurare un buon contatto con la superficie dell’agar;

-porre su ogni piastra un dischetto CONTROL come controllo positivo e un dischetto BLANK come controllo negativo.

-Incubare le piastre a 37 °C per 24 - 48 ore.

Giorno 4: PAR TEST

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ATTENZIONE: prima di passare da un dischetto al successivo pulire accuratamente la pinzetta usata con alcool isopropilico, in modo da evitare il trasferimento di eventuali sostanze antibatteriche da

un dischetto all’altro.

Giorno 4: PAR TEST

DISCHETTO IMBEVUTO

DI URINADISCHETTO BLANK

(CONTROLLO NEGATIVO)

DISCHETTO CONTROL

(CONTROLLO POSITIVO)

INOCULO CON SPORE

DI BACILLUS SUBTILIS

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Giorno 5:

INTERPRETAZIONE DEL PAR TEST

-Osservare controluce le piastre dopo incubazione per individuare la presenza di un

alone di inibizione attorno al dischetto imbibito con il campione in esame.In presenza di alone significa che sono presenti nel campione sostanze ad azione

battericida.-Il controllo negativo non deve presentare alcun alone;

-Il controllo positivo deve esibire un alone chiaramente visibile.

URINEPOS

NEG

URINE

POS

NEG

PAR TEST POSITIVO PAR TEST NEGATIVO

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TEST DELLA SENSIBILITA’ DEI BATTERI AGLI ANTIBIOTICI: metodo di diffusione in agar

Materiale:1 piastra petri con terreno Mueller-Hinton

1 provetta di soluzione fisiologica 4-5 ml.1 ansa

1 tampone sterile

guanti pennarello

pinzettedischetto antibiotato

PROCEDIMENTO:1-INOCULO DELLE PIASTRE DI MUELLER HINTON AGAR:

-scegliere , da una coltura in MAC CONKEY AGAR, 4 o 5 colonie ben isolate e morfologicamente simili e con un’ansa sterile toccare la parte superiore della colonia;

- sospendere in una provetta contenente 4- 5 ml di soluzione fisiologica;-agitare bene le colonie raccolte con l’ansa nella provetta del terreno liquido,

aiutandosi con il vortex, fino ad ottenere una soluzione con torpidità omogenea = CORRISPONDENTE AD UNA TORBIDITA’ DI MAC FARLAND ( corrispondente a 106 di

batteri).

-Immergere un tampone sterile nella provetta, prelevare una certa quantità di sospensione; eliminare l’eccesso di sospensione presente nel tampone con cura ,

ruotando diverse volte e premendo contro la parte superiore della provetta, sopra dal menisco della sospensione.

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Giorno 2: ANTIBIOGRAMMAMETODICA DI KIRBY- BAUER o TEST DI DIFFUSIONE IN AGAR o TEST DI SENSIBILITA’

MIC ( MINIMA CONCENTRAZIONE INIBENTE)

Metodo di diffusione in agar (KIRBY-BAUER) è un metodo quantitativo per valutare la sensibilità agli antibiotici basato sulla misurazione degli aloni di inibizione.

Si utilizzano piastre pronte del terreno agarizzato Mueller Hinton.

MUELLER HINTON AGAR

Terreno raccomandato per i test di sensibilità agli antibiotici

ComposizioneInfuso di carne di manzo 300 g/LIdrolisato di caseina 17,5 g/lAmido solubile 1,5 g/l

Agar 17,0 g/l

Conservazione delle piastre di terreno prima dell’uso: temperatura di +2 /+8°C.

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-Inoculare strisciando il tampone uniformemente sulla superficie della piastra del terreno Mueller-Hinton Agar ruotando la piastra di circa 60° . Ripetere per altre due volte per garantire una semina uniforme e quindi una crescita confluente ( per fornire aloni di

inibizione uniformemente circolari).

-Prima di porre i dischetti impregnati di antibiotico, lasciare assorbire l’inoculo chiudendo la piastra con il coperchio e lasciarla a temperatura ambiente per 5 minuti.

2-DEPOSIZIONE DEI DISCHETTI-per mezzo di una pinza, pulita e disinfettata con alcool isopropilico, porre i dischetti di antibiotici sulla superficie del terreno effettuando una leggera e delicata pressione del

dischetto sul terreno.

-Temperatura e tempo di incubazione in termostato: + 35 / +37 °C per 16-18 ore.

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Giorno 3:

INTERPRETAZIONE ANTIBIOGRAMMA

-INTERPRETAZIONE DEGLI ALONI

-Dopo incubazione si esegue la lettura delle piastre: misurare gli aloni di

inibizione completa (arrotondando al millimetro più prossimo), utilizzando un

calibro o un idoneo dispositivo di misurazione = righello.

Si misura il diametro dell’alone comprendente anche il diametro del

dischetto. In base all’ampiezza dell’alone si classifica l’efficacia

dell’antibiotico e in base a apposite tabelle si classifica il microrganismo

come sensibile, moderatamente sensibile oppure resistente .

In caso di nessun alone si ha assenza di inibizione e quindi non

efficacia dell’antibiotico.

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Diametro alone di inibizione (mm)

Antibiotico Contenuto del

disco(g)Resistente Intermedi

o

Moderatament

e sensibile

Sensi

bileAc.nalidixico(NA) 30 13 14-18 / 19

Ampicillina(AMP) 10 13 / 14-17 17

Ceftazidime(CAZ) 30 14 / 15-17 18

Nitrofurantoina(F) 300 14 15-16 / 17

Norfloxacina(NOR) 10 12 13-16 / 17

INTERPRETAZIONETabella di riferimento

- Esaminare la piastra e misurare i diametri degli aloni di inibizione usando un righello

- Interpretare gli aloni di inibizione usando la tabella di riferimento

Antibiotico Diametro alone di inibizione interpretazioneAcido nalidixicoAmpicillinaCeftazidimeNitrofurantoinaNorfloxacina

Diametro

dell’alone di

inibizione

Dischetto

antibiotato

Prato o coltura

batterica

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Diametro alone di inibizione (mm)

Antibiotico Contenuto del

disco(g)Resistente Intermedio Moderatamente

sensibile

Sensi

bileNetilmicina(NET) 30 13 14-18 / 19

Ac.Pipemidico ( Pi)

2 10 / 11-16 16

Cefuroxima (CXM) 30 14 / 15-17 18

20 14 15-16 / 17

Clindamicina(CC)

15 10 11-14 / 14

INTERPRETAZIONETabella di riferimento

- Esaminare la piastra e misurare i diametri degli aloni di inibizione usando un righello

- Interpretare gli aloni di inibizione usando la tabella di riferimento

Antibiotico Diametro alone di inibizione interpretazione

Diametro

dell’alone di

inibizione

Dischetto

antibiotato

Prato o coltura

batterica

Eritromicina (E)

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Diametro alone di inibizione (mm)

Antibiotico Contenuto del

disco(g)Resistente Intermedio Moderatamente

sensibile

Sensi

bileCefoperazon (CF) 30 13 14-18 / 19

Piperacilina ( PiP)

1 10 / 11-16 16

Gentamicina (GM) 10 12 / 13-16 16

100 14 15-16 / 17

Oxicillina (OX)

10 10 11-14 / 14

INTERPRETAZIONETabella di riferimento

- Esaminare la piastra e misurare i diametri degli aloni di inibizione usando un righello

- Interpretare gli aloni di inibizione usando la tabella di riferimento

Antibiotico Diametro alone di inibizione interpretazione

Diametro

dell’alone di

inibizione

Dischetto

antibiotato

Prato o coltura

batterica

Penicilllina (P)

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.

Giorno 2: IDENTIFICAZIONE MICROBICA

In campo microbiologico molto importante è l’isolamento e l’identificazione delle colture

microbiche cresciute dopo semina su terreno selettivo. Se sul terreno selettivo sonopresenti colonie ben isolate si procede con l’identificazione batterica basata suspecifici test biochimici necessari per identificare il genere e la specie batterica.

Per l’ identificazione si utilizzano dei sistemi pronti appositamente preparati che sibasano sulla capacità di fermentazione degli zuccheri e di test biochimici chepossiedono i batteri a seconda della famiglia microbica di appartenenza.Questi sistemi di identificazione sono i SITEMI API ( esempio API STAF per Staphylococcuso API E per enterobacteriaceae) oppure gli ENTEROTUBE , per esempio ENTEROTUBE IIutilizzato per identificare i batteri appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceacresciuti su terreno selettivo MacConkey Agar.

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Giorno : IDENTIFICAZIONE MICROBICA

Materiale:-ENTEROTUBE II : un kit formato da una provetta di plastica con 12 sezioni, ciascunadelle quali contiene un substrato di coltura diverso. Presenta un ago metallico perl’inoculazione che passa attraverso i vari substrati e sporge da entrambe le estremitàdella provetta;-colture isolate cresciute su MacConkey Agar.

PROCEDIMENTO:-Inoculazione : con l’estremità del filo metallico che sporge si preleva una colonia benisolata dal terreno di coltura e si fa passare attraverso tutte le sezionidell’Enterotube II.

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Giorno 2: Interpretazione Enterotubeistruzioni per l’impiego

2)

INOCULARE ENTEROTUBE II RUOTANDO

PRIMA L’AGO ED ESTRAENDOLO POI

CON MOVIMENTO ROTATORIO

ATTRAVERSO TUTTI GLI SCOMPARTI DEL

TUBO. REINSERIRE NELL’ENTEROTUBE

L’AGO (SENZA STERILIZZARE) FINO A

FAR CORRISPONDERE LA TACCA

ALL’APERTURA DEL TUBO. LA PUNTA

DEVE ARRIVARE FINO ALLO SCOMPARTO

DEL CITRATO.

1)SVITARE ENTRAMBI I CAPPUCCI DELL’

ENTEROTUBE II.

LA PUNTA DELL’AGO DA INOCULO SI TROVA

SOTTO IL CAPPUCCIO BIANCO. PRELEVARE

UNA COLONIA BEN ISOLATA DIRETTAMENTE

CON LA PUNTA DELL’AGO.

FARE ATTENZIONE A NON PENETRARE

NELL’AGAR.

3)

SPEZZARE L’AGO, PIEGANDOLO IN

CORRISPONDENZA DELLA TACCA. LA

PARTE DI AGO CHE RIMANE

ALL’INTERNO DELL’ENTEROTUBE II

ASSICURA, DURANTE L’INCUBAZIONE ,

UN AMBIENTE ANAEROBIO NECESSARIO

PER LA VERA FERMENTAZIONE DEL

DESTROSIO E PER LA

DECARBOSSILAZIONE DELLA LISINA E

DELL’ORNITINA E PER

L’EVIDENZIAZIONE DELLO SVILUPPO DI

GAS.

4)

CON L’AGO RIMASTO PERFORARE LA

PELLICOLA DI PLASTICA IN

CORRISPONDENZA DEGLI ULTIMI 8

SCOMPARTI ( ADONITOLO,

LATTOSIO,ARABINOSIO,SORBITOLO, VOGES-

PROSKAUER,DULCITOLO/FENILALANINA,UREA,CITRAT

O) PER CREARE UN AMBIENTE

AEROBIO. RIAVVITARE EMTRAMBI I

CAPPUCCI.

5)INCUBARE ENTEROTUBE II. ALLA

TEMPERATURA DI + 35° / + 37°C PER 20 – 24

ORE IN POSIZIONE VERTICALE IN

PORTAPROVETTE, CON LO SCOMPARTO DEL

DESTROSIO RIVOLTO VERSO L’ALTO.

6)DOPO INCUBAZIONE PROCEDERE CON LA

LETTURA REGISTRARE SULL’APPOSITO

FOGLIO DI IDENTIFICAZIONE LE REAZIONI

POSITIVE, TRANNE INDOLO E VOGES-

PROSKAUER, CONFRONTANDO IL TUBO CON

LA TABELLA DELLE REAZIONI E/O CON UN

ENTEROTUBE II NON INSEMENZATO.

GLI SCOMPARTI CHE NON PRESENTANO

VARIAZIONI CORRISPONDONO A REAZIONI

NEGATIVE.

7)

EFFETTUARE DUE TEST

1- TEST DELL’INDOLO;

2-TEST DI VOGES-PROSKAUER.

TENERE ENTEROTUBE II IN POSIZIONE

ORIZZONTALE ED AGGIUNGERE I

REAGENTI FACENDO UN FORO NELLA

PELLICOLA SUL FONDO

DELL’ENTEROTIBE . (I REAGENTI

VERRANO AGGIUNTI DIRETTAMENTE NEI

SEGUENTI SCOMPARTI:

1- NELLO SCOMPARTO H2S/INDOLO

INIETTARE 3 o 4 GOCCE DEL REAGENTE DI

KOVACS o REAGENTE DI JAMES

POSITIVO= VIRAGGIO AL ROSSO ENTRO

POCHI MINUTI;

2- NELLO SCOMPARTO DI VOGES-

PROSKAUER, INIETTARE 3 GOCCE DI VP

1 (SOLUZIONE DI ALFANAFTANOLO) E 2

GOCCE DI VP 2 (IDRATO DI POTASSIO).

POSITIVO =QUANDO VI NOTA UNA

VARIAZIONE DI COLORE , VIRA AL

ROSSO, DOPO

10 MINUTI.

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REAZIONI

SUBSTRATO OSSERVAZIONI

NEGATIVO POSITIVO

DESTROSIO O GLUCOSIO

ROSSO GIALLO Dalla fermentazione del substrato si ha acidificazione con variazione di colore dell’indicatore

SVILUPPO DI GAS CERA ADESA CERA STACCATA

La cera serve per creare le condizioni di anerobiosi e aiuta la fermentazione con sviluppo di gas.

In presenza di gas si ha il sollevamento o il distacco della cera dall’agar delo scomparto.

LISINA GIALLO VIOLA Per decarbossilazione della lisina si forma cadaverina, composto alcalino che provoca il viraggio dell’indicatore dal giallo al viola.

ORNITINA GIALLO VIOLA Per decarbossilazione della ornitina si forma putrescina, composto alcalino che provoca il viraggio dell’indicatore dal giallo al viola.

H2S BEIGE NERO-MARRONE L’acido solfidrico reagisce con ioni ferro e forma un precipitato insolubile nero di solfuro di ferro.

INDOLO INCOLORE ROSSO La produzione dell’indolo nella decomposizione del triptofano si evidenzia dalla colorazione rossa che assume il REAGENTE DI KOVACS aggiunto nello scomparto dopo l’incubazione.

ADONITOLO

ROSSO GIALLO

Durante la fermentazione dei carboidrati si formano prodotti acidi che sono rivelati dalla variazione di colore dell’indicatore.

In presenza di colore arancio la reazione è negativaLATTOSIO

ARABINOSIO

SORBITOLO

VOGES- PROSKAUER

INCOLORE ROSSO

Dalla fermantazione del destrosio si forma l’acetoina che viene rivelata dall’aggiunta nello scomparto dei reagenti di Voges-Praskauer dopo incubazione. Se entro 10 minuti si nota una colorazione rossa la reazione è positiva.

DULCITOLO VERDE GIALLO La fermentazione del dulcitolo porta ad acidificazione con viraggio dell’indicatore al colore giallo.

Interpretazione Enterotube: Tabella delle reazioni

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Giorno 3: Interpretazione Enterotube

InterpretazioneL’identificazione del microrganismo preso in esame si ottiene

procedendo con la determinazione di un profilo numerico.

Il profilo numerico è un codice di 5 cifre da ricercare nella lista dei profili microbici

identificati e catalogati nel l’INDICE ANALITICO. Registrazione dell’identità del

microrganismo:

Codice identificativo:

Specie microbica :

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API® Yeast Identification

API 20C AUX – 48 to 72-hour identification of yeasts