Presentación de la formación...compromise final affinity 103 a 109 L mol-1 9High affinity to the...

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U C M Chemical Optosensors Group – Laboratory of Applied Photochemistry Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007 S S í í ntesis ntesis de de MIPs MIPs selectivos selectivos a a antibi antibi ó ó ticos ticos β β - - lact lact á á micos micos para para su su empleo empleo en en sistemas sistemas miniaturizados miniaturizados de de medida medida (CREAM, Ref QLK (CREAM, Ref QLK - - 1999 1999 - - 00 00 - - 00902) 00902) Desarrollo Desarrollo de de inmunoensayos inmunoensayos en en fase fase heterog heterog é é nea nea y de MIAs y de MIAs para para la la determinaci determinaci ó ó n n de de antibi antibi ó ó ticos ticos , , micotoxinas micotoxinas y y pesticidas pesticidas en en alimentos alimentos , , muestras muestras mediombientales mediombientales y y farmace farmace ú ú ticas ticas (NASCENT, Ref (NASCENT, Ref MRTN MRTN - - CT CT - - 2006 2006 - - 033873 033873 ) ) Dise Dise ñ ñ o o de de sondas sondas fluorescentes fluorescentes para para el el desarrollo desarrollo de de inmunoensayos inmunoensayos y y MIAs ( MIAs ( molecularly imprinted assays molecularly imprinted assays ). ). Desarrollo Desarrollo de de biosensores biosensores sobre sobre fibra fibra ó ó ptica ptica ( ( Futursen Futursen , Ref , Ref S S - - 0505/AMB/0374 0505/AMB/0374) S S í í ntesis ntesis de de MIPs MIPs compatibles con compatibles con muestras muestras acuosas acuosas para para la la determinaci determinaci ó ó n n de de contaminantes contaminantes en en alimentos alimentos y y aguas aguas

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UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry

Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007

SSííntesisntesis de de MIPsMIPs selectivosselectivos a a antibiantibióóticosticos ββ--lactlactáámicosmicos parapara susu empleoempleoen en sistemassistemas miniaturizadosminiaturizados de de medidamedida (CREAM, Ref QLK(CREAM, Ref QLK--19991999--0000--00902) 00902)

DesarrolloDesarrollo de de inmunoensayosinmunoensayos en en fasefase heterogheterogééneanea y de MIAs y de MIAs parapara la la determinacideterminacióónn de de antibiantibióóticosticos, , micotoxinasmicotoxinas y y pesticidaspesticidas en en alimentosalimentos, , muestrasmuestras mediombientalesmediombientales y y farmacefarmaceúúticasticas (NASCENT, Ref (NASCENT, Ref MRTNMRTN--CTCT--20062006--033873033873))

DiseDiseññoo de de sondassondas fluorescentesfluorescentes parapara el el desarrollodesarrollo de de inmunoensayosinmunoensayos y y MIAs (MIAs (molecularly imprinted assaysmolecularly imprinted assays). ). DesarrolloDesarrollo de de biosensoresbiosensores sobresobrefibrafibra óópticaptica ((FutursenFutursen, Ref , Ref SS--0505/AMB/03740505/AMB/0374)

SSííntesisntesis de de MIPsMIPs compatibles con compatibles con muestrasmuestras acuosasacuosas parapara la la determinacideterminacióónn de de contaminantescontaminantes en en alimentosalimentos y y aguasaguas

UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry

Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007

DERIVADOS DEL PIRENODERIVADOS DEL PIRENO

N

S

COOH

CH3

CH3

NH

O

H HO

PAAPPAAP ( )3

N

S

COOH

CH3

CH3

NH

O

H HO

PBAPPBAP

N

S

COOH

CH3

CH3

NH

O

H H

NH

O

OPAAMPAAM

N

S

COOH

CH3

CH3

NH

O

H H

NH

O

O

( )3

PBAMPBAM

N

S

COOH

CH3

CH3

NH

OH

O

H H

NH

O

OPAAXPAAX

DERIVADOS DEL DANSILODERIVADOS DEL DANSILO

G. Orellana et al. Patente ES 2197811

DAPDAP

N

S

COOH

CH3

CH3O

H HNH

SO O

N

DAMDAM

N

S

COOH

CH3

CH3

NH

O

H H

NH

O

SOO

N

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Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007

ABC

DE

H

FG

ABC

DE

H

FG

ABC

DE

H

FG

portadorportador

ABC

DE

H

FG

desorbentedesorbente

anticuerpo anticuerpo ((AbAb))

antantíígeno marcado geno marcado ((AgAg*)*)

desechodesecho

aireaire

bomba de jeringabomba de jeringa++

vváálvula de distribucilvula de distribucióónn

vváálvula de lvula de distribucidistribucióónn

mue

stra

s

immunoreactorimmunoreactor

anticuerpos inmovilizadosanticuerpos inmovilizadosen parten partíículas de culas de

inmunoadsorbenteinmunoadsorbente

ABC

DE

H

FG

ABC

DE

H

FG

ABC

DE

H

FG

portadorportador

ABC

DE

H

FG

desorbentedesorbente

anticuerpo anticuerpo ((AbAb))

antantíígeno marcado geno marcado ((AgAg*)*)

desechodesecho

aireaire

bomba de jeringabomba de jeringa++

vváálvula de distribucilvula de distribucióónn

vváálvula de lvula de distribucidistribucióónn

mue

stra

s

immunoreactorimmunoreactor

anticuerpos inmovilizadosanticuerpos inmovilizadosen parten partíículas de culas de

inmunoadsorbenteinmunoadsorbente

E. Benito Pena et al. Anal Chem. 2006, 78, 2019-2027 ; J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 6635-6642

UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry

Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007MIPsMIPs

MIPs Antibodies

Binding sites Binding sites homogeneityhomogeneity

PolyclonalityMost non-covalently imprinted MIPs have

heterogeneous binding sites

The use of monoclonal antibodies yields very high

selective assays

PreparationPreparation Simple and easy to prepare Complicated manufacture and handling

AffinityAffinitySynthesis conditions may compromise final affinity

103 a 109 L mol-1High affinity to the target(s)

5·104 a 1012 L mol-1

CostCost Inexpensive ◄◄►►

Expensive biosynthesis but cost effective

StabilityStabilityRobust, resistant to a wide range of pH, humidity and

temperature

Non usable in harsh environments:limited lifetime

SelectivitySelectivity ◄◄►► High-medium High

Aqueous Aqueous mediamedia

◄◄►► Limited water compatibility Optimal performance in

aqueous solutions

Organic Organic mediamedia Excellence performance Poor performance. Antibody

denaturalization

SolventSolvent

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Analytical characteristics

IC50 19.7 µg mL-1

LD 100 µg mL-1

DR (1120 – 3330x102) µg L-1

r 0.990 (n = 9)

log [PENG]-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

Seña

l nor

mal

izad

a (S

N)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0

log [PENG]-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

Seña

l nor

mal

izad

a (S

N)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

00

CalibrationCalibration plotplot MIAMIA

Analytical characteristics

IC50 30 ng mL-1

LD 2.4 ng mL-1

DR (6.0 – 191) ng mL-1

r 0.998 (n = 5)

CalibrationCalibration plotplot immunoassayimmunoassay

[PENG], μg mL-1

0.000001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100

Seña

l nor

mal

izad

a (S

N)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.0

[PENG], μg mL-1

0.000001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100

Seña

l nor

mal

izad

a (S

N)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0.0

UCM Chemical Optosensors Group –Laboratory of Applied Photochemistry

Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007

AA BBDD

CC

OptodeOptode responseresponse

log [PENG]-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

Seña

l nor

mal

izad

a (S

N)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0

log [PENG]-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2

Seña

l nor

mal

izad

a (S

N)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

00

MIAOptode

●●

CC

DDAA

BB

Optical fiber

Sensitive tip

MIP

longitud de onda, nm380 400 420 440

Seña

l de

fluor

esce

ncia

, cps

10000

20000

30000

40000

50000

[PENG]

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Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007

Características analíticas

IC50 1.81x10-6 M

LD 1.97x10-7 M

ID 6.80x10-7-7.21x10-6 M

a

b

Análisis de Penicilina G en orina

Concentration (M)

1e-8 1e-7 1e-6 1e-5 1e-4 1e-3

B / B

o

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Nor

mal

ized

sign

al,S

N

a

b

J. L. Urraca et al., Angew. Chem. 2006, 45, 5158-5161; Anal Chem. 2007, 79, 695-701

Curvas de calibrado (n = 3) para PENG en acetonitrilo:buffer HEPES (0.1 M, pH 7) (60/40, v/v)`: NIP ( ), MIP( ) en muestras de orina; trazador (PAAP) 25 nM.

N N

H H

CF3

CF3

Urea-δO

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Red de Biosensores, Madrid 13 febrero 2007

O

O

O

OH

HO

ZON

OOH

HO

O

CDHB

J. L. Urraca et al., Anal. Bioanal. Chem. 2006, 385, 1155-1161; J. Chrom. A 2006, 1116, 127-134

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Monómeros funcionales

N4-vinilpiridina

(4-VPY)

NO

O2-(dietilamino)etil

metacrilato(2-DAEM)

1-alilpiperazina (1-ALPP)

NH

N HOO

OMetacrilato de 2-hidroxietilo

(HEMA)

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t / s

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

LU260

280

300

320

340

360

380

5 10-4 M 3 10-4 M 2 10-4 M 10-4 M 5 10-5 M 2.5 10-5 M 1.7 10-5 M

HN

O

OOH

HOO

Signal

[Analyte]

Ensayodesplazamiento

Analito

Análogo fluorescente

AnálogoFluorescente (PA-RA)

Navarro et al. Sens.& Act. B (in press)

λexc/em = 345/400 nm

IC50 MIP (ZON)= 0.60 mML.D. MIP (ZON)= 30 µM

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Características analíticas

Valor (ng mL-1)

RSD %

LD 0.007 2.3 IC50 0.124 4.1

Intervalo dinámico 0.021-0.833

Concentration (ng mL-1)

0.001 0.01 0.1 1 10 100

resp

uest

a no

rmal

izad

a

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Concentration (ng mL-1)

0.001 0.01 0.1 1 10 100

resp

uest

a no

rmal

izad

a

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Calibrados de ZON en PB y en MatrizPBExtractoPB + 2%

(MeOH/AcN)

J. L. Urraca et al., j. Agric. Food Chem. 2005, 53, 3338-3344

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MatrizCantidad

adicionada(ng g-1)

Inmunoensayong g-1 (RSD)

HPLC-FLDng g-1 (RSD)

Maíz* 133 130 (6) 138 (6)

Trigo 126 132 (6) 119 (5)

Pienso cerdos 126 132 (8) 133 (7)

* Material de referencia certificado

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J. Golden et al. Methods 2005, 37, 65–72; Moreno-Bondi et al. Biosens. Bioelect. 2006, 21, 1880-1886

BufferBuffer1:200 Patient 21:200 Patient 21:50 Patient 21:50 Patient 21:200 Patient 11:200 Patient 11:50 Patient 11:50 Patient 1BufferBuffer

HBsAg HBsAgControl B adw ayw TNF Control

10 10 5 10 5 1 10 (µg mL-1)

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Funding sourcesFunding sources

• Spanish Ministry of Education & Science(AMB92-0092-C03, AMB95-0689-C02, AMB98-1043-C02, BQU2002-04515-CO2,

PROFIT, CTQ2006-15610-C02)

• Madrid Community Regional Government(07M/0082/2000, GR/MAT/00512004, S-0505/AMB/0374)

• Spanish Ministry of Education and Science(Doctoral grants)

• European Union (IV, V, VI FP)• Universidad Complutense de Madrid

• Spanish Ministry of Education & Science(AMB92-0092-C03, AMB95-0689-C02, AMB98-1043-C02, BQU2002-04515-CO2,

PROFIT, CTQ2006-15610-C02)

• Madrid Community Regional Government(07M/0082/2000, GR/MAT/00512004, S-0505/AMB/0374)

• Spanish Ministry of Education and Science(Doctoral grants)

• European Union (IV, V, VI FP)• Universidad Complutense de Madrid