IFOM per la ScuolaLo Studente Ricercatore 2010

Luca De CristofaroLiceo Scientifico “Gian Battista Vico” -

Corsico (MI)

Gruppo di lavoro: DNA Sequencing UnitTutor: Sara Volorio

Sequenziare il DNA: come leggere i geni

Il primo metodo di sequenziamento efficiente fu elaborato da Frederick Sanger nel 1975.

Sequenziare il DNA significa “scoprire” la successione delle basi azotate di uno specifico tratto di DNA.

Il sequenziamento

Tratta da: The Molecular Biology Of The Cell di Alberts et al.

Scheletro desossiribosio - fosfato

Basi azotate legate con legami a idrogeno

Gli “ingredienti” del metodo Sanger• DNA da sequenziare (stampo)• DNA polimerasi: enzima che catalizza la sintesi di un

filamento di DNA a partire dallo stampo• Desossiribonucleotidi (dNTPs)• Didesossiribonucleotidi (ddNTPs) o terminatori • Primer: sequenza oligonucleotidica che si appaia con

il DNA stampo necessaria per promuovere la sintesi di un nuovo filamento complementare

Modificata da: The Molecular Biology Of The Cell di Alberts et al.

Come funziona?• La reazione avviene in 4

contenitori.• La DNA polimerasi crea

filamenti complementari al DNA stampo utilizzando i dNTPs e incorparando talvolta i ddNTPs.

• I prodotti delle 4 reazioni corrono su 4 corsie di un gel tramite elettroforesi, per poter essere “letti”.

Modificata da: The Molecular Biology Of The Cell” di Alberts et al.

A cosa serve il sequenziamento?

• Genomica per lo studio dei genomi di alcune specie di viventi tra cui l’uomo volto a comprendere meglio le funzioni del materiale genetico

• Diagnostica• Medicina legale per poter identificare una persona

con le tecniche di DNA fingerprinting• Ingegneria genetica nell’agricoltura OGM

Cosa fa la DNA Sequencing Unit?

• Esegue il sequenziamento di campioni di DNA a scopo di diagnosi o di servizio per la ricerca.

• Il servizio di diagnosi consiste nell’individuazione di mutazioni geniche germinali che possono determinare una predisposizione allo sviluppo di un tumore.

• Durante la mia esperienza ho seguito dall’inizio alla fine il processo di analisi e ricerca delle mutazioni, in particolare nei geni BRCA1 e BRCA2, responsabili del cancro alla mammella e all’ovaia.

Le tipologie di mutazioni

Dati dall’introduzione alla tesi di laurea specialistica in Genetica Medica dal titolo “Caratterizzazione degli spettri mutazionali dei geni BRCA1 e BRCA2 in famiglie italiane con suscettibilità genetica ai carcinomi della mammella e dell’ovaia”.

• Cromosomiche: interessano cromosomi o loro parti• Geniche: interessano parti di geni alterando la

sequenza di basi• Somatiche: avvengono nelle cellule adulte e perciò

verranno trasmesse solo dalle copie delle cellule mutate Tumore sporadico

• Germinali: avvengono durante la gametogenesi o l’embriogenesi e quindi saranno presenti in tutto l’individuo Tumore ereditario

Sono due geni oncosoppressori coinvolti in molti meccanismi della cellula:sistemi di controllo del ciclo cellulare sistemi di riparazione del DNA differenziazione delle cellule staminali dell’epitelio mammario

I geni analizzati: BRCA1 e BRCA2

Collocazione dei geni BRCA1 e BRCA2 (BReast CAncer, cancro alla mammella) sui cromosomi.

Si è osservato che mutazioni congenite in BRCA1 e BRCA2 innalzano sensibilmente la probabilità di contrarre tumore alla/e mammella/e e/o all’ovaia.Ottenere una preventiva informazione sulla presenza di queste variazioni nucleotidiche in famiglie a rischio permette un tempestivo intervento,

Le mutazioni in BRCA1 e BRCA2

se necessario, o una più accurata sorveglianza dell’individuo nel tempo, limitando il rischio dello sviluppo del tumore.

Dall’introduzione alla tesi di laurea specialistica in Genetica medica dal titolo “Caratterizzazione degli spettri mutazionali dei geni BRCA1 e BRCA2 in famiglie italiane con suscettibilità genetica ai carcinomi della mammella e dell’ovaia”.

Il flusso di lavoro

Purificazione delle sequenze

Elettroforesi nel sequenziatore

Analisi delle sequenze tramite

software

Refertazione

Purificazione della PCR

Allestimento delle reazioni di sequenza

Allestimento delle reazioni di PCR

Estrazione del DNA dal sangue e archiviazione

Arrivo del campione di sangue

Controllo delle PCR su gel

Compilazione della request

Counseling genetico

In azzurro i passaggi svolti dai centri che richiedono le analisi e in giallo i passaggi svolti nel laboratorio di sequenziamento del DNA.

• Arriva un campione di sangue dall’ospedale che ha richiesto le analisi.

• Il DNA viene estratto con uno strumento automatico che causa la lisi delle membrane cellulari mediante sbalzi termici ed isola l’acido nucleico tramite centrifugazioni e diluizioni.

Fase 1: l’estrazione del DNA

Strumento automatico per l’estrazione del DNA

• Il campione di DNA estratto e quantificato viene poi archiviato in un database.

Fase 2: la PCR• Il DNA viene amplificato con la tecnica della PCR

(Polymerase Chain Reaction, reazione a catena della polimerasi) in modo da ottenere i frammenti di DNA che voglio analizzare (ampliconi) in quantità maggiori.

• La PCR è una reazione che imita la replicazione

Regione di DNA da amplificare

Denaturazione e associazione con i primers

Oligonucleotidi (PRIMERS)

Sintesi DNA

Denaturazione e associazione con i primers

Sintesi DNA

Sintesi DNA

Denaturazione e associazione con i primers

PRIMO CICLOSintetizzate 2 molecole di

DNA a doppia elica

SECONDO CICLOSintetizzate 4 molecole di DNA a doppia elica

TERZO CICLOSintetizzate 8 molecole di DNA a doppia elicaModificato da: The Molecular Biology of the Cell di Alberts et al.

naturale del DNA ripetendo numerose volte i passaggi.

• Si controlla la bontà della PCR tramite elettroforesi su gel di agarosio di piccole aliquote di ampliconi.

Fase 3: la reazione di sequenziamento

adesso presentano una molecola (Big Dye) che emette luminescenza ad una certa lunghezza d’onda, un segnale diverso per ogni base azotata.

• La reazione avviene in un unico ambiente.

• Ottenuti gli ampliconi in grande quantità, questi seguono la reazione di sequenziamento ideata da Sanger, leggermente modificata.

• Laddove i ddNTPs terminatori usati da Sanger presentano semplicemente un H, quelli utilizzati

Fase 4: il sequenziatore• Gli ampliconi marcati

vengono sottoposti a elettroforesi in un capillare di un sequenziatore automatico.

• Alla fine della corsa elettroforetica è posto un lettore che riconosce la lunghezza d’onda emessa.

Elaborando i dati si ottiene un grafico: l’elettroferogramma

Lettore ottico

Capillari del sequenziatore

Fase 5: l’analisi dei dati

I dati vengono poi elaborati grazie a un software che mette a confronto la sequenza analizzata con una wild-typeottenuta da undatabase online (come Ensembl) o da una precedente analisi, segnalando le mutazioni. Il software è in grado di evidenziare le mutazioni e di stabilire le sequenze aminoacidiche codificate dalle due sequenze nucleotidiche.

• Le mutazioni rilevate dal software di analisi vengono cercate in un elenco precedentemente stilato (e continuamente aggiornato) dai ricercatori per sapere il tipo di dannosità della mutazione (alcune di esse non sono patologiche).

• Si compila quindi il referto medico indicando: - le mutazioni patogenetiche (quelle di cui è

accertata la dannosità) - le mutazioni a significato incerto (quelle di

cui non si conoscono ancora le conseguenze sulla sintesi proteica).

Alla fine del lavoro