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PEPTIDE SYNTHESISPEPTIDE SYNTHESIS
Molecole di peso molecolare inferiore ai 5000 dalton, costituiti da una catena di pochi amminoacidi (fino a 100
circa), uniti tra di loro attraverso un legame peptidico (amidico).
PEPTIDIPEPTIDI
NH
OH
O
RO
H2N
R'
PEPTIDIPEPTIDI
Costituenti delle proteine
Ormoni
Neurotrasmettitori
Antibiotici/Antibatterici
Veleni
Partecipano alla risposta immunitaria
Sviluppo di patologie
Farmaci
Nanotecnologie
PEPTIDIPEPTIDIOrmoniOrmoni
Insulina Glucagone
PEPTIDIPEPTIDINeurotrasmettitoriNeurotrasmettitori
Sintetizzati come pre-proteine del reticolo endoplasmatico rugoso dove viene rimossa la sequenza segnale. La pre-proteina risultante attraversa l’apparato di Golgi e viene immagazzinata in vescicole. All’interno delle vescicole si completa la formazione del peptide: scissione proteolitica, modificazione delle estremità del peptide, glicosilazione, fosforilazione, formazione dei ponti disolfuro.
PEPTIDIPEPTIDI
AntibattericiAntibatterici
Proline-rich proteins
Istatine
Cistatine
PEPTIDIPEPTIDIVeleniVeleni
Conopeptidi
PEPTIDIPEPTIDI
Risposta immunitariaRisposta immunitaria
Patologie legate ai peptidi: AlzheimerPatologie legate ai peptidi: Alzheimer
PEPTIDIPEPTIDIFarmaciFarmaci
PEPTIDIPEPTIDIFarmaciFarmaci
bassa stabilità metabolica
scarso assorbimento dopo somministrazione orale
scarso passaggio della barriera ematoencefalica
PeptidePeptide PeptidomimeticoPeptidomimetico
PEPTIDIPEPTIDINanotecnologieNanotecnologie
1881 & 1902Prima attivazione del gruppo carbossilico
&Sintesi di un tripeptide
Theodor Curtius (1857-1928)
1901
Prima sintesi chimica di un peptide “NH2 free”
Emil Fischer (1852–1919)
H2N COOEtHN
NHO
OH2N
HN
O
COOH
Dichetopiperazina
1902Nobel Prize
“…la quantità di lavoro che c’è da fare è
talmente enorme che in confronto le scoperte
sui carboidrati sembrano un gioco da
ragazzi.”
1932
Introduzione del gruppo benzilossicarbonilico (Cbz o Z)
Max Bergmann (1886-1944) & Leonidas Zervas (1902-
1980)
O NHR
OH2, [Pd]
H2NRCH3
CO2
1953
Sintesi dell’Ossitocina
Vincent du Vigneaud (1901-1978)
1955 Nobel Prize
Cbz - Cys - Tyr - lle - Gln - Asn - Cys - Pro - Leu - Gly - NH2
S SBzl Bzl
1) Na, NH32) Air oxidation
H - Cys - Tyr - lle - Gln - Asn - Cys - Pro - Leu - Gly - NH2
S S
1957 Introduzione del gruppo t-butossicarbonilico (Boc)
George W. Anderson & Anne McGregor
O NHR
OH2NR CH2
H3C
H3CCO2
H+
J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 6180-6183
19631963
J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149 - 2154
L-A-G-VL-A-G-V
BRUCE MERRIFIELDBRUCE MERRIFIELD(1921-2006)
1984Nobel Prize
BRUCE MERRIFIELDBRUCE MERRIFIELD
“la mia resa complessiva è stata del 7% e mi ci sono voluti 11 mesi. Sicuramente un chimico dei peptidi con più esperienza avrebbe fatto meglio, ma non senza uno sforzo considerevole”
VANTAGGIVANTAGGIWork-up per semplice filtrazione
Possibiltà di utilizzare i reattivi in grande eccessoRiduzione dei tempi di sintesi
Automatizzazione del processo
Legare covalentemente un aa ad un supporto
insolubile e far “crescere” il peptide.
LE TRE GRANDI SFIDELE TRE GRANDI SFIDE
Bruce contro i chimici!!!Bruce contro i chimici!!!
Passare dalla teoria alla pratica.
Abbattere la resistenza dei chimici
sintetici verso questo nuovo metodo (“…
non è assolutamente chimica, è un
approccio che verrà soppresso dalla
comunità”).
Far capire che anche un biochimico può
avere le credenziali per proporre un
cambiamento rivoluzionario nella sintesi
chimica (“Questo non è il modo di
sintetizzare i peptidi”).
Cl
Polystyrene
O
PolystyreneO2N
O
NH
Cbz
R
O2N
HBr/AcOH
O
PolystyreneO2N
O
H2N
R
O
PolystyreneO2N
O
NH
ROHN
Cbz
R'
OH
O
NH
RO
H2N
R'
NaOH
L-A-G-V
Attacco –COOH.
Allungamento facendo reagire il carbossile attivato con gruppo NH2
dell’aa o del peptide ancorato alla resina.
SPPS: sequenza di coupling/deprotezione.
Distacco del peptide dalla resina
1972Introduzione del gruppo
9-Fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) Louis A. Carpino
CH2
O
O
NH RCH2 N
NH2 RCO2
NH
CH C O
R1 O
LinkerHN
CH C O
R1 O
LinkerH2N
HN CH
R2
C
O
CH C O
R1 O
LinkerHN
HN CH
R2
C
O
O activating group
couplen. times deprotection and
coulping
H2N CH
Rx+1
C
O
CH C
R1 O
CH
Rx
HN C
O
HN OH
n-1
Side chain PG
N-α PG
Polymer Support
SPPSSPPS
SPPSSPPS SCELTA DELLA RESINA
ALLUNGAMENTO DELLA CATENA (COUPLING/DEPROTEZIONE)
DISTACCO DEL PEPTIDE DALLA RESINA
PURIFICAZIONE
GIOCO DI PROTEZIONI
Boc/Bzl SPPSBoc/Bzl SPPS
Fmoc/tBu SPPSFmoc/tBu SPPS
C
O
NH2
H2N COOH
R
R-OH -COOH
-SH
-N-
HN C NH2
NH
GRUPPO GRUPPO PROTETTOREPROTETTORE
chimicamente stabile nelle condizioni della sintesi peptidica
effetto stabilizzante sulla molecola
rimovibile in condizioni blande, in modo selettivo e con alte rese
PROTEZIONE ORTOGONALEPROTEZIONE ORTOGONALE
NH
HN
O
Stabile nelle condizioni di coupling e deprotezione
Non stabile durante il distacco dalla resina (ci sono eccezioni) Stabile durante
coupling Non stabile durante
la deprotezione
Gruppi N protettoriGruppi N protettori
O
O
Boc
Stabile in ambiente basico e riducente
Eliminazione in ambiente acido (TFA)
O O Ot-But-Bu
O O
R NH2
R NH
O
O t-Bu
CO2t-BuOH
O
OFmoc
Stabile in ambiente acido Eliminazione con piperidina
R NH2
H2C O C
O
NH R
H2C O C
O
R
R= Cl; N
O
O
Gruppi protettori delle catene laterali
Boc Fmoc
Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ala, Met non hanno bisogno di protezione
stabili in TFA Stabili in piperidina
Possono essere o non essere stabili nelle
condizioni di cleavage della resina
RacemizzazioneRacemizzazione
R' NH
O
X
O
R-HX
O
N
O
R'
R-H+
O
N
O-
R'
R
H+
O
N
O
R'
R
H2N Peptide
R' NH
OHN
O
R
Peptide
OssazoloneOssazolone
O
OBr
O
O
H2N COOH
HO
H2N COOH
HO
H2N COOH
HO
Bzl
2-Br-Bzl
tBu
Trt
H2N COOH H2N COOH H2N COOH
NH2
NHN
HN
OHN
O
NO2
NO2
N
N H
O NH
O
O
NH
BocCbz
DnpFor
Trt
H2N COOH H2N COOH
COOH
HOOC
O
O
O
O
Bzl
OcHx
tBu
Ada
NH
O
N
O
NH
O
N
O
NH
O
N
O
NH
O
N
O
NH
O
HN
X
O
N
O
O
NH
NH
H2N COOH H2N COOH
CONH2
H2NOC
H2N COOH
NC
O
NH
NH
OCH3
OCH3H3CO
NH
Xan
Trt
Tmob
H2N COOH
NHH2N
NH
N
O
NHR
NH
NH
H2N COOH
NH2
SO2
CH3H3C
CH3 SO2
HN
O
SO2
HN
O
Mts PbfPmc
H2N COOH
HS
NH
O
S S
Acm Trt
Scelta della ResinaScelta della Resina
Non deve essere solubile nei solventi utilizzati durante la sintesiDeve contenere siti reattivi (linkers) per permettere l’attacco del primo aa tramite la funzione carbossilicaDeve essere stabile nelle condizioni di coupling-deprotezione
La resina deve subire un rigonfiamento (swelling) per favorire la penetrazione dei reagenti nei granuliLoading: mmol di gruppo funzionale per g di resina
Scelta della ResinaScelta della ResinaStruttura polimerica
PolistirenePEG
Resine Boc-SPPSResine Boc-SPPS
Stabili in TFAResina di Merrifield
BocHN
R
O-
O
Cs+DMF, KI
50°C, overnight
Cl O
O
BocHN
R
BocHN
R
OH
O
Cs2CO3
Resine Boc-SPPSResine Boc-SPPS
Resine Boc-SPPSResine Boc-SPPS
CleavageCleavage
HF → Peptide acido
NH3/MeOH → Peptide carbossammide
NH2NH2 → Peptide idrazide
MeOH/TEA → Peptide metilestere
Resine Fmoc-SPPSResine Fmoc-SPPS
O
HO
Resina di Wang
Anidridi simmetriche Anidridi miste Metodo MSNT/MeIm
HO
FmocHN
R
OH
O
2DIC, DMF
FmocHN
R
O
O O
NHFmoc
R
DMAP, DMF
O
O
FmocHN
R
CN NDIC=
N
N
DMAP=
Resa >70%
Racemizzazione
Anidridi simmetricheAnidridi simmetriche
Anidridi misteAnidridi miste
HO
FmocHN
R
OH
OFmocHN
R
O
O O
O
O
FmocHN
R
Cl
OCl
Cl
N
DCM
Cl
Cl
Resa >70%
Racemizzazione
Metodo MSNT/MeImMetodo MSNT/MeIm
HOFmocHN
R
OH
O
O
O
FmocHN
R
MSNT, MeIm, DCM
S
N
OO
NN
NO2
MSNT= MeIm=N
N Evita racemizzazione
Sensibile all’umidità
Resina ClorotritilicaResina Clorotritilica
Cl
Cl
FmocHN
R
OH
O
O
ClDIEA, DCM
Cl
ClO
FmocHN
R
Peptidi acidi
No racemizzazione
Resa quantitativa
Peptidi protetti
Rink Amide ResinRink Amide Resin
O
NHFmocOMe
MeO
Sieber Amide ResinSieber Amide Resin
O
NHFmoc
O
Peptidi carbossiammidati
Peptidi protetti (Sieber)
Resine Fmoc-SPPSResine Fmoc-SPPS
CleavageCleavage
TFA 80-95% + Scavengers per 1-3 h
ScavengersScavengersNucleofili che reagiscono con specie cationiche altamente reattive
che si formano dai gruppi protettori e dalla resina
Acqua
1,2 Etanditiolo (EDT)
Tioanisolo
Fenolo
Triisopropilsilano (TIS)
TFA/tioanisolo/H2O/Fenolo/EDT82.5 5 5 5 2.5
Reagent K
CouplingCoupling
R C
O
OH R C
O
XR'NH2
R C
O
NHR' + HX
R C
O
N
X
H
R'
H
Gruppo attivatore
CarbodiimmidiCarbodiimmidi
C NN C NNC NN
N
XNHY
RHN C N R
R N C N R
O
OX
NHY
O
O
XNHY
O
NH
R'H
RNH2
NH
NH
O
RR
DCC DIC EDC
Base
Base: DIEA, TEA, NMM, DMAPO-acilisourea
Migrazione acilica O → N Racemizzazione C N
HN
O
RR
XO
CHNN
O
RR
XO
Carbodiimmidi + HOBtCarbodiimmidi + HOBt
XNHY
RHN C N R
R N C N R
O
OX
NHY
O
O
XNHY
O
NH
R'H
RNH2
NN
N
OH
XNHY
O
ONN
N
NN
N
OH
N NN
N
OH
N
O
O
OH
NN
NOH
O
HOAtHOAt HOSuHOSu HOOBtHOOBt
MiscellaneaMiscellanea
YHN
R
OH
O
YHN
R
O
O O
NHY
R
DIC
YHN
R
Cl
OYHN
R
O
O
X
NO2
F
F
F
F
F
N NO
NN
CDI
YHN
R
N
O
N
Coupling ReagentsCoupling Reagents
NN
NOH
P(NMe2)3, CCl4
THF, -30°C NN
NOP+(NMe2)3
Cl-KPF6, H2O
NN
NOP+(NMe2)3
PF6-
HOBt incorporato direttamente nella struttura dell’attivatore
BOPBOP
Sali di fosfonioSali di fosfonio
Sali di uronioSali di uronio
NN
NOH
CO(NMe2)2, COCl2
THF NN
N+O-
(H3C)2NN(CH3)2+
Cl-KPF6, H2O
NN
N+O-
(H3C)2NN(CH3)2+
PF6-
HBTUHBTU
Sali di FosfonioSali di Fosfonio
YHN
R
O-
O
NN
N O P+NMe2
NMe2
NMe2
YHN
R
O
O
P+(NMe2)3
-OBt
YHN
R
OBt
O
XNH2
YHN
R
NHX
O
NN
NO P+
N
NN
PF6-
PyBOPPyBOP
Sali di UronioSali di Uronio
YHN
R
O
O-N
NN+O-
(H3C)2NN(CH3)2+
YHN
R
O
O
N
N+-OBt
YHN
R
O
OBt
N
NO
N
NN
N+O-
(H3C)2NN(CH3)2+
PF6-
NN
N+O-
(H3C)2NN(CH3)2+
BF4-
HATUHATU TBTUTBTU
NN
N+O-
(H3C)2NN(CH3)2
ClPF6
-
+
HCTUHCTU
Siamo pronti!Siamo pronti!
YHN
R
O
OH + H2N
R'
O
OX YHN
HN
R
O R'
O
O
X H2N
HN
R
O R'
O
O
X
H2N
HN
R
O R'
OH
O
Fase Fase liquidaliquida
Fase Fase SolidaSolida
1.1 eq. aa1.1 eq. attivatore1.1 eq. HOBt 2 eq. ammina
5 eq. aa5 eq. attivatore5 eq. HOBt10 eq. ammina
Gruppo COOH terminale protetto come estere
Gruppo COOH terminale attaccato a resina
Work-up: estrazione, purificazione
Work-up:filtrazione
Problemi
Sintesi in fase liquida: Solubilità del peptide
Sintesi in fase solida: Capacità del gruppo
amminico di affacciarsi al solvente
RisoluzioneRisoluzione
Evitare la formazione di legami idrogeno intermolecolari
(Hmb)-amminoacidi
Pseudoproline
Isoacil dipeptidi
Microonde
(Hmb)-amminoacidi(Hmb)-amminoacidi2-Hydroxy-4-methoxybenzyl2-Hydroxy-4-methoxybenzyl
H2N
R
O
O
N
R'
OPfp
O
Fmoc
MeO OFmoc
N
R'HN
O
Fmoc
MeO OFmoc
R'
O
O
HN
R'HN
O R'
O
O
OH
MeO
FmocNH-CHR''-CO-ActHN
R'HN
O R'
O
O
O
MeO
FmocNH-CHR''-CO
N
R'HN
O
MeO OFmoc
R'
O
OO
FmocNH-CHR''
N → O acyl transfer
PseudoprolinePseudoprolineFmocHN
R
N
O
OX
O OH
X= H, CH3 H2N
R
N
O
OX
O OH
TFA
H2N
RHN
OOHX
OH
O
PseudoprolinePseudoproline
Isoacil DipeptidiIsoacil DipeptidiFmocHN
O
O
R'
BocHNOH
O
FmocHNO
O
R'
BocHN
HN
O R''
peptide
O
1) Fmoc SPPS2) TFA
HpeptideNHO
O
R'
+H3N
HN
O R''
peptide
O
OH
Disaggregato
Solubile
1) HPLC2) pH 7.4
HpeptideNHO
O
R'
H2N
HN
O R''
peptide
O
OH
HN
O R''
peptide
O
OHNH
OHO
HpeptideNH
R'
Aggregato
Poco solubile
MicroondeMicroonde
Ponti S-SPonti S-S
Contribuiscono alla formazione della
struttura tridimensionale di peptidi e
proteine
Importanti per l’attività
Ossidazione di due residui di cisteina
HN CHC
CH2
O
S
FmocHN CHC
CH2
O
S
H3COCHN Ph Ph
Ph
HN CHC
CH2
O
S
H3COCHN
HN CHC
CH2
O
S
Ph Ph
Ph
C
O
TFA
HN CHC
CH2
O
S
HHN CHC
CH2
O
SH
H3COCHN
HN CHC
CH2
O
S
H3COCHN
HN CHC
CH2
O
SH
C
O
X
1
HN CHC
CH2
O
S
HHN CHC
CH2
O
S
H3COCHN
HN CHC
CH2
O
S
H3COCHN
HN CHC
CH2
O
S
C
O
X
2
HN CHC
CH2
O
S
HHN CHC
CH2
O
S
HN CHC
CH2
O
S
HN CHC
CH2
O
S
C
O
X
1
H2O (40 μM)
NaOH, TRIS
H2O2
2
AcOH/H2O
I2, MeOH
Ac. Ascorbico
Distacco del gruppo Boc
Si aggiunge alla resina una soluzione di TFA in DCM (50%, 10 mL/g resina) e si lascia sotto agitazione per 5 min.Dopo la fitrazione si aggiunge ancora TFA/DCM e si agita per ulteriori 20 min.La resina viene poi lavata con DCM (2x) e IPA (2x).
R NH
O
O CCH3
CH3CH3
HXR N
H
OH+ X
O CCH3
CH2CH3
R NH
OH
O +
RNH3+ X- + CO2
H2CCH3
CH3
+ HX
H
Distacco del gruppo Boc
(Fase liquida)
L’ammina N-Boc-protetta viene posta in un pallone ad un collo e raffreddata a 0°C con un bagno di ghiaccio. Successivamente viene aggiunta una soluzione di HCl in diossano (4M, 1mL per 100 mg) e la miscela di reazione viene lasciata sotto agitazione, a t.a. fino a quando la TLC non ha evidenziato la scomparsa del prodotto di partenza. Il solvente viene fatto evaporare ( HCl!) e il residuo ottenuto
lavato con Et2O (x3).
Distacco del gruppo Fmoc
Si aggiunge alla resina una soluzione di piperidina in DMF (40%, 10 mL/g
resina) e si lascia sotto agitazione per 5 min.
Dopo la fitrazione si aggiunge ancora piperidina/DMF e si agita per
ulteriori 15 min.
La resina viene poi lavata con DMF (6x)
H CH2
O
O
NH RN
H
-O
O
NH RN
H H
CH2
CH2 N
NH2 RCO2
Introduzione del gruppo Boc
L’ammina libera viene dissolta in un solvente opportuno (10 mL/mmol) e
alla soluzione viene aggiunta TEA (1 o 2 eq.) fino a pH basico ed infine
Boc2O (2 eq.). La miscela di reazione viene lasciata sotto agitazione
overnight. Al termine della reazione (controllo mediante TLC) si lava la fase
organica con H20 e una soluzione satura di NaCl. La fase organica viene
seccata con Na2SO4 anidro e fatta evaporare. Il grezzo ottenuto viene
purificato mediante colonna cromatografica.
Introduzione del gruppo Fmoc
L’ammina cloridrata viene dissolta in una soluzione di Na2CO3 (0.6M, 7
mL/mmol) e alla soluzione viene aggiunto FmocOSu (2 eq.) sciolto in acetone
(5 mL/mmol). La miscela di reazione è lasciata sotto agitazione per 24 h.
Al termine della reazione (controllo mediante TLC) la miscela viene diluita con
H2O e la fase acquosa estratta con AcOEt (3x). Le fasi organiche riunite
vengono lavate con H2O e una soluzione satura di NaCl, seccate con Na2SO4
e fatte evaporare.
Il residuo ottenuto viene purificato mediante colonna cromatografica.
