Oncologia Sperimentale di laboratorio

METASTASI SPERIMENTALIRIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO

IN VIVO

6° S. Beninati

Modelli sperimentali in vivo

• Permettono di valutare due parametri:

• proliferazione

• Colonizzazione/invasione

IL MODELLO ANIMALE

• SONO UTILIZZATI DIVERSI MODELLI ANIMALI PER RIPRODURRE IL PROCESSO METASTATICO E LA SUCCESSIVA INVASIONE E COLONIZZAZIONE DELL’ORGANO BERSAGLIO

• I MODELLI CHE SI USANO COMUNEMENTE PERMETTONO DI INOCULARE CELLULE TUMORALI DIRETTAMENTE NELL’ANIMALE IN DIVERSE PARTI DEL CORPO:

• INTRAMUSCOLO INTRASPLENICA• INTRAPERITONEALE ENDOVENA• INTRAOCULARE SOTTOCUTANEA

Tumore primario indotto con inoculo intramuscolare di cellule di melanoma murino

Parametri:

Volume,Peso,Aspetto, angiogenesi, necrosi

MODELLI ANIMALE DI MELANOMA

• Due modelli animali sono utilizzati per lo studio del melanoma:

• Il modello polmonare

• Il modello splenico

Animali

• I topi del ceppo C57BL/6 sono utili se si usano linee cellulari di melanoma murino (B16-F10;B16-FLr6)

• Utilizzando topi singenici, cioè dai quali sono state ottenute le linee tumorali, è ridotto drasticamente il fenomeno del rigetto.

• *individui della stessa specie che sono geneticamente identici, per esempio animali dello stesso ceppo consanguineo. Cellule proveniente da individui singenici possono essere usate per modelli di trapianto d'organo e tumorali.

C57BL/6

Modello splenico

• Una sospensione di cellule di melanoma viene iniettata direttamente nella milza dell’animale.

• Le cellule di melanoma passano in circolo e invadono il fegato.

• Le metastasi sono visibili poichè ricche di melanina nera.

Modello Polmonare

• Le cellule di melanoma murino C57BL/6 sospese nel mezzo di coltura vengono iniettate endovena nella vena caudale dell’animale.

• Attraverso il circolo raggiungono un solo organo bersaglio: il polmone

• Anche in questo caso le metastasi sono visibili poiché ricche di melanina.

metastasi

Polmone di topo C57BL/6 invaso da cellule tumorali di melanoma B16-F10

Valutazione del potere metastatico

• E’ possibile valutare il numero di metastasi superficiale per mezzo di una conta visiva. Il metodo risulta empirico e poco preciso in particolare in presenza di un alto numero di metastasi.

• E’ necessario considerare che l’organo bersaglio è invaso anche nel suo stroma interno.

• Quindi la conta superficiale è sicuramente poco significativa

Polmone di topo C57BL/6 invaso da metastasi di cellule B16-F10

Polmone di topo C57BL/6 invaso da metastasi di cellule B16-F10 trattato con antineoplastici

Modello istologico di valutazione del potere metastatico

• Per poter effettuare una conta delle metastasi attendibile è necessario considerare anche le metastasi interne.

• A tal fine l’organo bersaglio viene sezionato in sottili fettine, per mezzo di un microtomo.

• Il microtomo permette di ottenere fettini sottilissime e trasparenti, denominate “sezioni istologiche seriate”

Sezioni istologiche seriate di polmone di topo C57BL/6 inoculato con cellule B16-F10

Analisi di immagine computerizzata

• Ogni singola sezione viene analizzata al computer con un software adatto per la misura di cinque parametri principali:

• 1. area della sezione istologica

• 2. area delle metastasi

• 3. numero di metastasi

• 4. area occupata dalle metastasi

• 5. percentuale di colonizzaione

Elaborazione morfometrica

• Il computer elabora i parametri precedenti e il risultato permette di valutare:

• 1. area totale della sezione istologica (TA)

• 2. area media di una metastasi (AAMF)

• 3. area metastatica totale (TMA)

Invasione e proliferazione

• IL modello di calcolo nasce da due considerazioni:

• La cellula tumorale invade l’organo bersaglio e quindi inizia a proliferare.

• L’invasione può essere valutata considerando il numero di metastasi

• Mentre la proliferazione valutando le dimensioni delle metastasi

Elaborazione dei dati

• L’analizzatore di immagini permette quindi di calcolare:

• L’area totale della sezione istologica TA

• L’area metastatica totale MTA

• L’area media di una metastasi AAMF.

• Attraverso questi parametri si ricavano tre indici.

Indice di invasione

• Il rapporto • TMA/AAMF

• Si definisce Indice di Invasione o “Invasion Index” (II)

• II=TMA/AAMF

• TMA= area metastatica totale• AAMF= area media di una metastasi

Invasione

• Infatti il rapporto TMA/AAMF definisce il numero di metastasi totale, poiché deriva da:

• TMA= area metastatica totale

• AAMF= area media di una metastasi

Indice di proliferazione

• Il rapporto

• AAMF/TA• Si definisce come indice di crescita o “Growth

Index” (GI)

• GI=AAMF/TA

• AAMF= area media di una metastasi• TA= area totale della sezione istologica

Indice di colonizzazione

• Il rapporto

• TMA/TA x 100

• Esprime la percentuale di colonizzazione, indicando quanta area è stata occupata dalle metastasi. Si indica come %CI

• TMA= area metastatica totale• TA= area totale della sezione istologica

Applicazione praticaDue molecole con potenziale attività antineoplastica sono state saggiate e hanno dato i seguenti indici:

Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index)

Controllo 33,6 110 30,6

Teofillina (TH) 7,9 90 7,5

Controllo 33,2 110 150,0

Βeta-teofillina (HET) 5,7 120 24,0

Colonizzazione proliferazione invasione

teofillina

• Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index)

• Controllo 33,6 110 30,6

• Teofillina (TH) 7,9 90 7,5

• -76,5% -18% -75,5%

• % di: colonizzazione proliferazione invasione

• La molecola risulta essere antimetastatica e poco antiproliferativa

Beta-teofillina

• Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index)

• Controllo 33,2 110 150,0

• Βeta-teofillina (HET) 5,7 120 24,0

• % di: -82,8% 0% -84%

• colonizzazione proliferazione invasione

• La molecola risulta essere altamente antimetastatica e non influenza la crescita tumorale

Confronto fra molecole

• E’ possibile comparare gli indici di varie molecole potenzialmente antineoplastiche.

• In tal modo si può utilizzare un farmaco mirato per il tipo di tumore.