OGM : organismi geneticamente modificati

Organismi ottenuti tramite manipolazione genica. Caratterizzati dalla presenza di modifiche nel genoma introdotte in maniera artificiale. Le tecniche di manipolazione genica consentono di trasformare singole cellule. Per ottenere organismi geneticamente modificati è necessario ricorrere a tecniche che consentono la riproduzione di un intero organismo a partire da una singola cellula. Tecniche diverse per ottenere OGM animali e vegetali

Diversi sistemi di espressione

Batteri Lievito Baculovirus Cellule di mammifero Piante Animali transeginici

Caracteristica E. coli Lievito Cell. Insetto Cell. Mammifero

Crescita 30 min 90 min 18-24 h 24 h

Terreno Semplice Semplice Complesso Complesso

Costo coltura Basso Basso Alto Alto

Expr. level Alto Basso-Alto Basso-Alto Basso-Medio

Expr. extracell Periplasma Terreno Terreno Terreno

Modifiche Postraduzionali

Folding Corretto Non sempre Non sempre Si Si

N-glicosilazione NO High lev Mannosio Semplice Complessa

O-glicosilazione NO SI SI SI

Fosforilazione NO SI SI SI

Acetilazione NO SI SI SI

Acilazione NO SI SI SI

γ-Carbossilazione NO NO NO NO

Piante geneticamente modificate

La rigenerazione nelle piante

Coltura dei protoplasti su cellule nutrici

Coltura di callo

Rigenerazione Coltura di cellule in sospensione

Centrifugazione e recupero dei protoplasti

Coltura di protoplasti Si sterilizza una foglia e si “pela” uno strato di

epidermide

Si pone lo strato di epidermide su un terreno contenente cellulasi e

pectinasi

Coltura di Calli

Induzione di radici su terreno ad alto rapporto

auxina/citochinina

Induzione di germogli su terreno a basso rapporto

auxina/citochinina

8

Agrobacterium Tumefaciens

La tecnologia ricombinante nelle piante

Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium tumefaciens è l’agente del tumore del colletto o della galla, malattia che si manifesta con la formazione di neoplasie sulla pianta infettata. L’instaurarsi della malattia richiede che nel genoma della pianta si inserisca il T-DNA, che corrisponde ad una parte del plasmide batterico (Ti-plasmid) detto induttore di tumore (Tumor inducing).

Il plasmide Ti contiene diverse informazioni

• Geni vir: codificano per proteine Vir, che permettono l’inserzione del T-DNA nella cellula ospite

• Geni per Opine (sintesi e catabolismo): codificano per enzimi in grado di trasformare aminoacidi e zuccheri della cellula in composti che solo il batterio è in grado di metabolizzare grazie a specifici enzimi sempre codificati dal plasmide Ti.

• Geni induttori del tumore: codificano per enzimi necessari alla sintesi degli ormoni vegetali che provocano la crescita incontrollata della cellula infettata

• T-DNA:

porzione di DNA delimitata da specifiche sequenze (bordo destro e sinistro) che corrisponde al DNA trasferito alla cellula ospite. Codifica per gli enzimi necessari alla sintesi degli ormoni vegetali e quella delle opine

11

o Contatto con bersaglio (geni chv)

o Adesione superficiale (vitronectina) o Trasferimento T-DNA (geni vir)

12

13

La conseguenza diretta dell’inserzione del plasmide Ti nella cellula è la crescita di un’escrescenza tumorale di tipo “Crown Gall” (tumore del colletto)

Un processo del tutto analogo si ha con un’altra specie di batterio. L’ Agrobacterium Rhizogenes, infatti, mediante meccanismi molecolari analoghi a quelli utilizzati da A. Tumefaciens, genera dei tumori identificabili come formazioni piliformi in soprannumero, soprattutto a livello radicale. Si parla infatti di formazioni di tipo “Hairy Roots”.

L’A. Rhizogenes, si serve per l’infezione, come A. Tumefaciens di un plasmide particolare (Ri) contenente geni deputati ai meccanismi di virulenza e di trasporto e integrazione, nel genoma della cellula ospite, della sequenza da trasferire.

Metaboliti indotti dal plasmide Ti

Auxine e citochinine: ormoni vegetali che regolano la crescita Opine: prodotti di condensazione tra aminoacidi, chetoacidi e zuccheri

Il metabolismo delle opine

Reazione di biosintesi della octopina

Octopina: piruvato + arginina Nopalina: α-chetoglutarato + arginina Mannopine: mannosio + aminoacido

Sintesi di Auxina e citochinine

I plasmidi Ti possono essere ingegnerizzati in E.coli attraverso l’inserzione del gene d’interesse all’interno della zona T. Questi plasmidi vengono usati per veicolare nuovi geni all’interno dell’ospite vegetale

Agrobacterium tumefaciens

DNA contenente il gene prescelto

Plasmide Ti

1

Inserimento del gene nel plasmide mediante l’enzima di restrizione e la DNA-ligasi

Plasmide Ti ricombinante

2

Infezione di cellule vegetali in coltura

3

Crescita della pianta

Pianta con caratteristiche nuove

Il T-DNA inserito porta il nuovo gene

Cellula vegetale

T-DNA

Sito di restrizione

I SISTEMI VETTORI DERIVATI DAL PLASMIDE Ti

Sistema vettore binario Sistema vettore cointegrato

Confine destro

Confine sinistro

A. tumefaciens ori

Gene bersaglio Gene marcatore selezionabile vegetale

E. coli ori

Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens

Vettore binario

Gene marcatore selezionabile

vegetale

Confine destro

Gene bersaglio

E. coli ori

Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens

Confine sinistro

A. tumefaciens ori

Geni vir

Vettore cointegrato

Plasmide Ti disarmato

Sequenza DNA omologa RICOMBINAZIONE

La piastra per l’inoculazione è provvista di cellule nutrici (protoplastiche) ed è selettiva per plasmidi resistenti ad un antibiotico (Canamicina).

excisione di dischi fogliari di circa 2 mm

Breve incubazione dei dischi fogliari con una coltura di Agrobatteri (5-10 x 106/ml) contenenti il gene d’interesse clonato in un vettore binario

Co-coltivazione in terreno a basso rapporto auxina/ citochinina, in presenza di carbellicina o kanamicina

Dopo la germinazione i trasformanti si trasferiscono in terreno di radicazione

La piastra per l’inoculazione è provvista di cellule nutrici (protoplastiche) ed è selettiva per plasmidi resistenti ad un antibiotico (Carbellicina o Kanamicina)

Questa tecnica è ormai di routine nella trasformazione di un gran numero di dicotiledoni.

L’utilizzo di questa tecnica nelle monocotiledoni è possibile solo se l’Agrobacterium è trattato con un essudato di ferite di piante normalmente suscettibili al batterio (dicotiledoni come i tuberi della patata).

La trasformazione tramite agrobatterio tuttavia ha un’efficienza molto bassa nelle monocotidedoni. Per queste piante, di grande interesse agronomico, sono stati sviluppati sistemi di trasformazione alternativi.

• Trattamento di protoplasti con metodiche analoghe a quelle utilizzate per le cellule in coltura

- fosfato di calcio (bassa efficienza) - elettroporazione (alta efficienza)

• Bombardamento con microparticelle

BOMBARDAMENTO CON MICROPROIETTILI

Tessuto vegetale bersaglio

Promotore per cellule vegetali gene d’interesse

Ap ori

Microparticelle (1µm) di tungsteno

Precipitazione del DNA sulle microparticelle

Caricamento del cannoncino balistico

Piastra di trattenimento

Percussore

Carica a salve

microproiettile

microparticelle rivestite di DNA

Metodi alternativi di trasferimento genico vegetale: cannoncino balistico

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Le particelle di tungsteno (oro, plastica) su cui è adsorbito il DNA estraneo, non interferiscono con la crescita della pianta.

Il rivestimento delle particelle sferiche (0,4 - 1,2 m) con DNA si ottiene mediante precipitazione con CaCl2, spermidina o PEG (polietileneglicol).

Le particelle rivestite vengono accelerate ad alta velocità (da 300 a 600 m/s) con il cannone da particelle, che impiega la polvere da sparo, l’aria compressa o l’elio per fornire la forza propulsiva.

Le cellule situate nella traiettoria diretta del tiro vengono uccise, ma c’è una zona in cui il proiettile penetra le cellule senza ucciderle.

Il proiettile è in grado di penetrare almeno uno strato di tessuto (ad es: fogliare) e può quindi raggiungere il mesofilo.

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Parametri importanti per il processo biolistico sembrano essere:

o Dimensioni dei microproiettili: in funzione della parete della cell target

o Massa dei microproiettili: deve poter raggiungere una energia cinetica adeguata all’attraversamento delle pareti cellulari.

Oro e tungsteno sembrano i più adatti anche perché chimicamente inerti e quindi non reagiscono con le componenti cellulari.

o Energia cinetica dei microproiettili: in funzione dello spessore della parete e dello strato di cellule che costituisce il bersaglio. Viene regolata calibrando l’accelerazione dei microproiettili.

o Numero di bombardamenti: variabili in base al bersaglio. Maggiore è il numero di bombardamenti maggiori sono i danni al tessuto.

Questo metodo di trasformazione, come tutti, presenta:

Vantaggi

Svantaggi

o Metodo genotipo indipendente

o Può essere applicato a tutti i tessuti modificando i parametri di sparo

o Frammentazione del DNA

o Profilo di integrazione del DNA complesso

o Integrazione di un gran numero di copie del transgene

Elettroporazione

L’ elettroporazione a partire da protoplasti risulta essere il metodo più efficace qualora non sia possibile utilizzare la trasformazione mediata da A. Tumefaciens.

Efficienza di trasformazione tra lo 0,1 e l’1% in protoplasti di riso e mais.

Un’ alta concentrazione di DNA plasmidico contenente il gene di interesse viene mescolata a una sospensione di protoplasti e sottoposti per pochi secondi ad un intenso campo elettrico dell’ordine di 250-500 V/cm.

In realtà l’intensità del campo elettrico varia in base al tipo cellulare, alla specie di provenienza, alla fase del ciclo cellulare in cui si trova e quindi a tutta una serie di parametri che rendono indispensabile una valutazione del voltaggio caso per caso.

Inoltre è necessaria anche una valutazione circa i sali impiegati. Molto spesso, infatti, erronee valutazioni dei parametri di reazione portano alla morte di un gran numero di cellule.

L’elettroporazione è per lo più impiegata in processi di trasformazione su “larga scala”, come la creazione di libraries genomiche. Per trasformazioni di un singolo plasmide vengono impiegate altre tecniche, come lo shock termico, a efficienza minore, ma più semplice e meno costoso.

Il trattamento provoca la formazione di pori transienti sulla membrana delle cellule e quindi la possibilità di entrata del DNA.

Trasformazione mediata da Liposomi

Il DNA viene incapsulato in un liposoma artificiale. La membrana dei liposomi si fonde con quella dei protoplasti ed il DNA può entrare nel nucleo.

Permeabilizzazione mediata da PEG

Microiniezione

Laser microbeam

Viene utilizzato per il trasferimento genico in situ. Il DNA viene introdotto negli organi riproduttivi.

Presenta come svantaggi la necessità di apparecchiature complesse e implica la trasformazione di una cellula alla volta.

Il polietileneglicole permette di permeabilizzare la membrana cellulare ed è quindi utilizzabile per la trasformazione diretta di protoplasti mediante semplice uptake di DNA estraneo.

Anche in questo caso si ha necessità di apparecchiature complesse e si può trasformare una cellula alla volta.

APPLICAZIONI

PIANTE TOLLERANTI A STRESS E SENESCENZA

La maturazione dei frutti

Alcuni dei geni indotti nel corso della maturazione dei frutti codificano gli enzimi cellulasi e poligalatturonasi.

Si è quindi supposto di poter ritardare la maturazione interferendo con l’espressione di uno o più di questi geni, creando piante transgeniche produttrici di RNA antisenso per i suddetti geni.

Pomodori Flavr Savr

Pomodori GM attraverso l’inserimento del gene codificante per Rna antisenso in grado di silenziare il gene della Poligalatturonidasi

enzima responsabile della maturazione del pomodoro wild type

Risultato: il processo di degradazione del frutto viene notevolmente rallentato.

ACC deaminasi

NH4+ + α- Chetobutirrato

Il regolatore della crescita della pianta è l’ETILENE che inducel’espressione di una serie di geni che partecipano alla maturazione e alla senescenza dei frutti.

Gene esogeno

PIANTE TOLLERANTI STRESS E SENESCENZA

Stress ossidativo

Piante di tabacco trasformate con un gene della superossido dismutasi (SOD) controllato dal promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore hanno espresso l’enzima acquistando la tolleranza al danno da radicali ossigenati.

PIANTE RESISTENTI A PARASSITI E VIRUS

LE PIANTE RESISTENTI AGLI INSETTI

Per conferire resistenza agli insetti predatori sono state poste in opera parecchie strategie, e una di esse si basa sul gene di una protossina insetticida prodotta da un a tra le parecchie sottospecie del batterio Bacillus thuringiensis:

Spcr

tNOS

p35S

gene della tossina B.t.

Confine destro

Plasmide Ti

Sequenza di DNA omologa

Ori di E.Coli

tNOS

pNOS

Gene marcatore sel. Vegetale (neomicina fosfo-transferasi NPT)

VETTORE DI CLONAZIONE COINTEGRATO

IL GENE DELLA PROTOSSINA E’ STATO INTRODOTTO IN MOLTE SPECIE DI PIANTE

PATATA RISO MAIS MELO MELANZANA RAVIZZONE NOCE PIOPPO ABETE MIRTILLO COTONE

Bacillus thuringiensis La tossina Bt

• Gli insetti ingeriscono i cristalli parasporali

• L’ambiente alcalino dell’intestino (pH7.5-8.0) solubilizza il cristallo a formare la protossina • Specifiche proteasi digestive presenti nell’intestino dell’insetto tagliano la protossina generando la tossina attiva • Nell’uomo e negli animali non sono presenti le proteasi specifiche • La tossina si inserisce nella membrana delle cellule epiteliali dell’intestino creando un canale ionico • Ciò determina un’alterazione dei flussi ionici e quindi la lisi delle cellule epiteliali • L’insetto smette di mangiare, si disidrata e muore

Modo di azione delle tossine di B.thuringiensis

Modo di azione delle tossine di B.thuringiensis

Applicazioni delle tossine di B.thuringiensis

Mais Bt

Bacillus Thuringiensis è un batterio che produce diversi tipi di endotossine tossiche per diversi parassiti delle piante ma non per l’uomo, gli animali o altri insetti benefici.

Vantaggi: - L'agricoltore non ha più bisogno di ricorrere agli insetticidi, quindi l'ambiente circostante non è più esposto a dosi massicce di insetticida nocivo. Svantaggi: - Gli insetti sono avvelenati per un periodo di tempo superiore rispetto a ciò che avviene quando un agricoltore irrora una o due volte i campi. In questo modo gli insetti possono sviluppare una resistenza al veleno. - Una moltitudine di insetti rischia di essere uccisa, compresi gli insetti predatori che si nutrono di insetti dannosi per le colture.(Negli Stati Uniti, dove si fa gran uso di Bt-mais, si è acceso il dibattito sugli effetti nocivi del Bt-mais sulla splendida farfalla monarca.) -Il cotone e le patate sono altri esempi di piante geneticamente modificate che producono insetticida.

ALTRE TECNICHE PER CONFERIRE

RESISTENZA AGLI INSETTI

Gli inibitori delle proteasi

L’inibitore dell’α-amilasi

Il gene batterico della colesterolo ossidasi

tNOS

p35S

Gene inibitore della tripsina di V. sinensis

Confine destro

Plasmide Ti Gene NPT

Ori

tNOS

pNOS

Kan r

Confine sinistro

PIANTE RESISTENTI AI FUNGHI E AI BATTERI

Le piante rispondono spesso all’invasione di un patogeno o ad altre sollecitazioni ambientali sintetizzando un gruppo di proteine dette proteine correlate con la patogenesi (PR). Le proteine PR comprendono le chitinasi, le β-1,3-glucanasi, le proteine traumatina-simili e gli inibitori delle proteasi. Per realizzare piante resistenti ai funghi patogeni sono state attuate manipolazioni tali da consentire alle piante di esprimere costitutivamente una o più proteine PR.

Cassetta del gene di resistenza all’igromicina

Cassetta del gene della chitinasi

La realizzazione di piante di patata transgeniche in grado di esprimere attivamente il lisozima del batteriofago T4 ha dato luogo a specie resistenti al batterio patogeno del suolo Erwinia carotovora e altri microrganismi

p35S

Pep. Segnale della α-amilasi di orzo

Lisozima T4 tCaMV

PIANTE RESISTENTI AI VIRUS

I virus delle piante causano spesso danni considerevoli alle coltivazioni e ne riducono significativamente le rese.

Per tale motivo si è fatto recentemente ricorso alle tecniche di ingegneria genetica per realizzare piante transgeniche resistenti ai virus.

E` stato osservato che piante transgeniche, che esprimono un gene che codifica una proteina di rivestimento di un virus, risultano resistenti all'infezione da parte di quel virus

Il meccanismo di resistenza si basa su una sorta di silenziamento, per cui la presenza di tale gene nel genoma delle cellule vegetali interferisce con la formazione di particelle virali quando queste infettano la cellula , interrompendo così il ciclo di replicazione del virus.

Le proteine di rivestimento espresse sono quelle del virus del mosaico del tabacco (TMV), virus del mosaico del cavolfiore (CaMV), virus del mosaico giallo della zucchina ecc.

RESISTENZA AI VIRUS

Geni delle proteine di rivestimento virali

Sequenze antisenso di geni virali

Per rendere le piante transgeniche resistenti a più di un virus, si è fatto uso di vettori binari basati sul plasmide Ti che esprimevano uno o più geni delle proteine di rivestimento:

Costrutti T-DNA con gene della neomicina fosfotrasferasi (NTP II) come marcatore selezionabile e gene della β glucuronidasi come gene reporter.

WMV2: Gene della proteina di rivestimento del virus 2 del mosaico dell’anguria.

CMV: Gene della proteina di rivestimento del virus del mosaico del cetriolo.

ZYMV: Gene della proteina di rivestimento del virus del mosaico giallo delle zucchine.

PIANTE RESISTENTI A ERBICIDI

STRATEGIE:

Inibire l’assunzione dell’erbicida

Sovraprodurre la proteina bersaglio sensibile all’erbicida così da farne rimanere abbastanza per le funzioni cellulari, nonostante la presenza dell’erbicida.

Attenuare l’attitudine della proteina bersaglio sensibile all’erbicida a fissare l’erbicida stesso.

Conferire alle piante la capacità di inattivare metabolicamente l’erbicida.

PIANTE RESISTENTI AL GLIFOSATO PIANTE RESISTENTI AL BROMOSSINILE

NITRILASI

• Il glifosato è un erbicida sistemico ad ampio spettro,non selettivo

• E’ letale per tutti i tipi di piante • L’erbicida è assorbito attraverso le foglie e i tessuti giovani del fusto e trasportato in tutta la pianta • Le piante trattate muoiono in giorni o settimane • Il Glifosato agisce inibendo l’azione dell’enzima vegetale EPSP(5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintasi) implicato nella sintesi degli aminoacidi aromatici

L’ebicida glifosato

Aminoacidiaromatici

resistente all’erbicida glifosato

La Soia Runpdup è stata ottenuta attraverso l’inserimento del gene per l’ESPS batterico, un enzima con bassa affinità per il glifosato, che permette alle piante transgeniche di sopravvivere in presenza del glifosato.

Soia Rundup

Vantaggi: - Si può estendere la piantagione perché è più semplice combattere le erbacee insetti infestanti. - Si possono usare tali erbicidi per eliminare numerose specie di infestanti nella coltura senza distruggere le piante-GM,riducendo il numero di trattamenti spray con erbicidi che distruggono solo una o poche specie di infestanti. Svantaggi: -La soia può impollinare e trasmettere i geni alle erbacce che crescono nello stesso campo, rendendo così resistenti anche le erbe infestanti.

Vantaggi: - Si può estendere la piantagione perché è più semplice combattere le erbacee insetti infestanti. - Si possono usare tali erbicidi per eliminare numerose specie di infestanti nella coltura senza distruggere le piante-GM,riducendo il numero di trattamenti spray con erbicidi che distruggono solo una o poche specie di infestanti. Svantaggi: -La soia può impollinare e trasmettere i geni alle erbacce che crescono nello stesso campo, rendendo così resistenti anche le erbe infestanti.

MIGLIORAMENTO DELLE QUALITA’ NUTRIZIONALI

La SOIA TRANSGENICA è arrichita di acidi grassi insaturi per risolvere molte patologie cardiovascolari (trombosi,arteriosclerosi…) che affliggono una larga fetta della popolazione adulta dei paesi sviluppati.

Il GOLDEN RICE. Nel 1991, gruppi di ricerca di Zurigo (una squadra guidata dal Dr. Ingo Potrykus dell'Istituto Federale Svizzero di Tecnologia) di Friburgo e della Germania (Beier et al.) hanno sviluppato l'idea di introdurre il beta-carotene nell'endosperma del riso, per poter tentare di convertire questa coltivazione primaria in una fonte di Vitamina A nelle zone afflitte da VAD (vitamin A deficency). I ricercatori hanno manipolato geneticamente una varietà da laboratorio di riso giapponese (Taipei 309, adatto al clima temperato dellíEuropa piuttosto che a quello delle aree tropicali) introducendo una via metabolica per convertire in Beta-carotene una parte di un precursore ormonale (geranyl geranyl difosfato) presente nel riso. Nel gennaio 2000 il gruppo di scienziati ha pubblicato i suoi risultati su "Science“. Il principale finanziatore del progetto per il riso GM negli ultimi sei anni è stata la Fondazione Rockefeller.

Golden Rice La carenza di vitamina A causa la cecità parziale o totale a 500.000 bambini ogni anno, ma i metodi tradizionali di miglioramento sono stati

inefficaci nel produrre colture ad elevato livello in vitamina A.

Al contrario del riso wild type che produce beta-carotene solo nei compartimenti fogliari, il riso GM presenta un aumento nella produzione di beta- carotene a livello dell’endosperma (la parte commestibile del riso).

Il Golden Rice è stato ottenuto attraverso la trasformazione con 2 geni:

- psy (phytoene synthase) dal narciso (Narcissus pseudonarcissus)

- crt1 dal batterio della soia Erwinia uredovora

I geni psy e crt1 esogeni trasformati nel genoma nucleare del riso sotto il controllo di un promotore specifico per l’endosperma.

Via biosinteica del beta-carotene:

Gene lyc endogeno codificante per una ciclasi che permette trasformazione del licopene(rosso) in beta carotene (giallo).

desaturasi

I geni psy e crt1 esogeni trasformati nel genoma nucleare del riso sotto il controllo di un promotore specifico per l’endosperma.

Via biosinteica del beta-carotene:

Gene lyc endogeno codificante per una ciclasi che permette trasformazione del licopene(rosso) in beta carotene (giallo).

MODIFICA DEL CONTENUTO NUTRIZIONALE contenuto e tipo di lipidi

MODIFICA DEL SAPORE E DELL’ASPETTO DELLE PIANTE DA FRUTTO

Inibizione degli enzimi coinvolti nelle fasi iniziali dello scolorimento dei frutti e delle verdure (es. polifenolo ossidasi, che catalizzano l’ossidazione dei monofenoli e degli o-bifenoli ad o-chinoni).

PIANTE COME BIOREATTORI produzione di proteine ricombinanti polimeri per uso industriale (poli-idrossialcanoati)

OGM ANIMALI

Animali nei quali, grazie a procedimenti di ingegneria genetica, è stata

modificata,aggiunta o eliminata, una porzione di patrimonio genetico allo scopo di ottenere nuove caratteristiche, non presenti in natura e non ottenibili tramite incroci

VANTAGGI

Superamento barriere naturali di incompatibilità sessuale tra specie

Specificità di mutazione

Velocità di comparsa della mutazione

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Per produrre animali geneticamente modificati si possono utilizzare:

Oociti fecondati inserendo il DNA estraneo nel pronucleo maschile.

Cellule staminali embrionali (in particolare ricavate dalla cavità della blastocisti).

Trasformazione Animale

• Negli ovociti prelevati da topine gravide si inietta il gene d’interesse, nel pronucleo maschile (è quello di dimensioni maggiori) • quando l’embrione arriva allo stato di blastula , viene impiantato in una topina pseudo-gravida (ottenuta tramite preparazione ormonale)

Microiniezione dell’uovo fecondato

La transgenesi avviene mediante microiniezione di un costrutto contenente il gene che codifica per la proteina di interesse in cellule uovo appena fecondate in vitro o in vivo (in questo caso le uova vengono recuperate mediante lavaggio uterino.

Generalmente vengono iniettati con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA contenenti circa 100-200 copie del gene di interesse.

Il costrutto viene posto sotto un promotore specifico per il tessuto in cui si vuole ottenere l’espressione, ad esempio sotto il promotore per le caseine nel caso in cui si vuole espressione nella ghiandola mammaria e conseguente purificazione del prodotto di interesse nel latte.

Gli oociti così ingegnerizzati vengono poi trapiantati in femmine riceventi.

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insieme al gene d’interesse si inserisce un gene per il colore del pelo, così riconosco subito tra la progenie il topo transgenico

Prelievo di un campione di tessuto per fare un’analisi Southern Blotting (per vedere in quante copie si è inserito il gene)

Si definisce fondatore (founder) l’individuo che porta il transgene anche nella linea germinale

Riconoscimento di una progenie transgenica

Sviluppo dello zigote fino allo stadio di blastocisti

Preparazione di cellule staminali embrionali (ES)

Si prendono delle cellule staminali embrionali dalla blastocisti e si mettono su piastra con un feeder layer

Le cellule staminali vengono manipolate geneticamente e poi reinserite in altre blastocisti accettrici prese da altre topine gravide.

Se le blastocisti attecchiscono e la gravidanza prosegue, nasceranno topi chimerici: avranno sia cellule normali che cellule transgeniche

Ogni cellula della blastocisti è il precursore di un tessuto del topo

Se l’inserzione è avvenuta nelle cellule della linea germinale, la progenie successiva porterà il transgene.

Questo metodo permette o un knock-out specifico di un gene, oppure una sostituzione di un gene con ricombinazione omologa.

La blastula si riorganizza bene dopo la colonizzazione delle blastocisti transgeniche e il topo non presenterà squilibri.

Trasferimento nucleare Clonaggio

Oocita privato del pronucleo femminile

Prelievo di un nucleo diploide da una cellula adulta

Inserimento del nucleo nell’oocita enucelato e stimolazione

L’oocita inizia lo sviluppo embrionale protando alla formazione di un individuo identico al donatore del nucleo

Non tutte le cellule somatiche sono in grado di originare individui clonati (le migliori sono: cellule epiteliali, cellule staminali, cellule germinali, cellule embrio-staminali o ES)

Trasferimento nucleare Clonaggio

Trasferimento nucleare - OGM

Cloning terapeutico

Terapia genica

TOPI KNOCK-OUT

Formazione di cellule staminali embrionali portatrici di una mutazione (knock-out)

Nel costrutto si utilizzano un gene di resistenza alla neomicina ed un gene di sensibilizzazione al ganciclovir.

Questo garantisce una doppia possibilità di selezione, positiva e negativa, che assicuri l’avvenuta ricombinazione omologa.

Questo sistema detto a “doppia selezione” consiste in:

o selezione positiva: sopravvivono solo le cellule che posseggono il gene di resistenza.

o selezione negativa: sopravvivono solo le cellule che non posseggono il gene di sensibilizzazione.

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Procedura generale per produrre topi knock-out gene specifici

I topi chimerici ottenuti vengono analizzati per individuare quali tra essi posseggono il transgene nella linea germinale.

L’analisi viene condotta mediante screening della progenie.

Qualora il chimerico ha il transgene nella linea germinale la progenie sarà costituita interamente da topi transgenici.

Molecular Farming

La produzione di proteine ricombinanti è effettuata in molte specie animali, tra cui: mucche, capre, conigli, pecore e polli.

L’uso di promotori tessuto-specifici garantisce l’espressione della proteina transgenica nei fluidi corporei (latte,uova,sangue, urina e fluidi seminali) dai quali è possibile purificarla

Le ghiandole mammarie sono attualmente i bioreattori più efficienti sia per la grande quantità di latte prodotto, che l’elevata espressione della proteina transgenica (1g/L)

Più di 20 proteine sono state prodotte fino ad ora. Ad es.: anticorpi umani monoclonali, attivatore del plasminogeno tissutale, ecc.

Produzione di proteine ricombinanti nel latte Inserire il gene di interesse sotto il promotore del gene della beta-lattoglobulina

Prelevare cellule uovo fecondate dalla capra

Inserire il costrutto nel pronucleo di una cellula uovo

Impiantare in una madre psudogravida e selezione della progenie GM

Estrazione della proteina direttamente dal latte

Proteine terapeutiche prodotte in latte di animali transgenici

Proteine espresse Origine del transgene

Promotore Livello di esp (g/L)

Mucca

Lattoferrina

cDNA

Alpha-S1 caseina bovina

/

Capra

Anticorpi monoclonali

tPA

Genomico

cDNA

beta-caseina caprina

beta-caseina caprina

10

6

Maiale

Fattore VIII

Proteina C

cDNA

cDNA

Proteina acida di siero di latte murina (WAP)

3

1

Pecora

Alpha-1 antitripsina

Fattore IX

Fibrinogeno

Minigene

cDNA

genomico

beta-lattoglobulina ovina

beta-lattoglobulina ovina

beta-lattoglobulina ovina

35

0,005

5

Coniglio

Calcitonina

SOD

Eritropoietina

Ormone della crescita

IL-2

Proteina di fusione

cDNA

cDNA

Genomico

genomico

beta-lattoglobulina ovina

WAP murina

WAP di coniglio

WAP murina

beta-caseina di coniglio

2,1

2,9

0,05

0,05

0,0005

L’uovo fecondato nel magmun rappresenta un potenziale stadio d’intervento per il trasferimento genico. Sfortunatamente i pronuclei non possono essere subito visualizzati parché il tuorlo e l’opacità della membrana vitellina interferiscono con l’illuminazione

Produzione di proteine ricombinanti nell’uovo

La manipolazione viene effettuata sull’uovo appena deposto. Aprendo una fenditura sulla superficie del guscio si ha accesso alla blastocisti che può così essere manipolata (trasferimento di DNA o inserimento di cellule ES precedentemente manipolate). L’apertura sul guscio viene sigillata e l’uovo è incubato per permettere lo sviluppo dell’embrione, generando così individui chimerici.