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G. Sesana1, P. Dellavedova2, M. Volante2, L. Clerici2, L. Mauri2

ARPA Lombardia ‐ 1Dipartimento di Brescia / 2Settore Laboratori

NUOVE TECNOLOGIE LC‐MS, NUOVE SFIDE AMBIENTALI E NUOVE POLITICHE DEI LABORATORI IN ARPA LOMBARDIA

• L’applicazione di tecniche LC/MS alle analisiambientali e nel campo alimentare comincianonegli anni 90

• Alcuni centri di riferimento per le analisisull’ambiente e sugli alimenti delle ASLcominciano ed esserne dotati

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Esperienze «storiche» dei PMIP(ASL Como – 1999)

• Partita di frutti contaminata da macchia rossa sospetta .

• Estratto analizzato via GC/MS: picco allargato relativo a sostanza antra‐chinonica con ione molecolare (?) a valori di m/z intorno a 400 u.m.a.

• Indagine via LC/MS condotta presso PMIP Parabiago – (Asl MI): evidenza di picco caratterizzato da ione molecolare con m/z pari a 462.

• Color Index: indica due coloranti antrachinonici con massa molecolare 462 assieme a due test qualitativi per il riconoscimento: in presenza di acido solforico si ha colorazione verde per uno, porpora per il secondo.

• In presenza di acido solforico l’estratto si colora di porpora: si tratta quindi del

ALGOL BRILLIANT RED 2B

LC/MS: esperienze di ARPA LombardiaARPA Milano ‐ 2009 (1)

COMPOSTO INCOGNITO IN ACQUE DI FALDA

• Presenza di picco significativo all’analisi GC‐NPD

• L’analisi GC‐MS evidenzia un picco con spettro non presente nelle più comuni librerie.

• Viene effettuata un analisi in LCMSMS (LTQ‐OrbiTrap – Thermo Scientific)ad elevata risoluzione (60.000).

• Si determina lo ione molecolare (196.1067), e degli ioni di transizione.

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COMPOSTO INCOGNITO IN ACQUE DI FALDA

• Effettuando una ricerca su database Chemspider ( http://www.chemspider.com/) per tale formula bruta vengono elencati 44 possibili isomeri strutturali .

• Sulla base di ulteriori considerazioni si ipotizzano le seguenti formule di struttura:


N

N

NH

NHNH

NH

O

CH3

CH3

CH3

RIFIUTO INCOGNITO ABBANDONATO IN CAPANNONE INDUSTRIALE

• Polvere bianca abbandonata in più flaconi, sospetto medicinale….

• Analisi mediante LC/MSMS (ion trap)

• Presenza di ioni significativi : 535 – 540 – 1052 – 1057 – 1569 – 1574: notare tre coppie di ioni (differenti tra loro 5 a.m.u.) che distano le une le altre di 517 a.m.u

• Probabile formazione di dimeri e trimeri di una molecola base di 517 a.m.u.

• Indicazioni di banche dati (www.drugbank.ca): antibiotici struttura beta lattamica con massa molecolare 539: piperacillina sodica e mezlocillina.


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RIFIUTO INCOGNITO ABBANDONATO IN CAPANNONE INDUSTRIALE

• Piperacillina sodica, massa molecolare 540 = 517 + 23

• Addotto piperacillina con acqua, massa molecolare 530 = 517+18

• Massa molecolare 1057: piperacillina sodica addizionata di 1 unità di piperacillina

• Massa molecolare 1574: piperacillina sodica addizionata di 2 unità di piperacillina

• Ulteriori indagini di conferma con tecniche diverse: in questo caso FT‐IR e relative librerie spettrali.

Composto identificato con la più elevata probabilità:

Piperacilllina sale sodico


Una sfida analitica ed un problema emergente, èrappresentato dalle tossine algali nelle acque dolci comein quelle marine….

Ad es. nelle acque dei laghi sono state identificate circa 90 variantidiverse di Microcistine di cui la RR e LR sono le varianti spessoriscontrate, e di cui la LR è la più tossica.

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Oltre alle microcistine sono stati identificati altri tipi di polipeptidi originati dal metabolismo del cianobatteri

tossicità nota o potenziale di queste molecole è attualmente oggetto di studi di approfondimento…..

• Molti i potenziali analiti da determinare, pocheancora le sostanze di riferimento: la sfida analiticaè decisamente impegnativa!

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Estrazione dalle cellule algali : ‐ congelamento/scongelamento a ‐20 °C overnight (lisi cellulare); ‐ estrazione (2 x) con metanolo:acqua (9:1) sotto ultrasuoni;‐ concentrazione e filtrazione 0,45 µm

Estrazione dalla fase acquosa: ‐ attivazione colonne SPE C18 (500 mg) con metanolo e poi acqua; ‐ estrazione campione mediante passaggio su SPE;‐ lavaggio cartuccia con acqua e poi acqua:metanolo 80:20;‐ eluizione analiti con metanolo 0,1% TFA (2x) e poi con acqua:metanolo 75:25 al 0,1% TFA;‐ concentrazione estratto

TFA: acido trifluoroacetico

Il programma di eluizione impiegato nel metodo B ha consentito, per alcuni campioni, la riduzione delle interferenze da matrice nella quantificazione degli analiti, pur aumentando il tempo di analisi.

Solvente A: acqua ultrapura al 0,05% TFA

Solvente B: acetonitrile al 0,05% TFA

Condizioni cromatografiche per l’analisi HPLC DAD/PDA

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Condizioni cromatografiche per l’analisi UPLC MS/MS

Solvente A: acqua ultrapura al 0,1% HFm

Solvente B: acetonitrile al 0,1% HFm

HFm: acido formico

Esempio: UPLC MS/MS previa estrazione con solvente

Biomassa algale su filtri GF/C

Analisi su LC‐MS/MS Waters Acquity UPLC ABSciex 4000 QTRAP

Approcci analitici dedicati:

22 epatotossine: Microcistine LR, YR, RR, LF, LA, LF, LW, e loroforme demetilate e bis‐demetilate, Nodularina R;

11 neurotossine e 2 citotossine: Anatossina‐a (ANA‐a), omoAnatossina‐a e principali analoghi, Cilindrospermopsina(CYN), desossi‐Cilindrospermopsina.

Da N. Salmaso et al. – IASM S.Michele all’Adige (TN)

Estrazione con solvente: tossine in soluzione

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Microcystinsb Molecular weight (Da)

RR* 1038

RRdm 1024

RRddm 1010YR* 1045

YRdm 1031

YRddm 1017LR* 995LRdm 981LRddm 967

LA* 910

LAdm 896

LAddm 882LY* 1002

LYdm 988

LYddm 974

LW* 1025

LWdm 1011

LWddm 997

LF* 986

LFdm 972

LFddm 958

Alkaloids Molecular weight (Da)

ANA‐a* 165

dihydroANA‐a 167

dihydrometoxyANA‐a 197

epoxyANA‐a 181

hydroxyANA‐a 181Anatoxin‐a(S) 252

homoANA‐a 179

dihydro‐homoANA‐a 181

dihydrometoxy‐homoANA‐a 211

epoxy‐homoANA‐a 195

hydroxyl‐homoANA‐a 195CYN* 415desoxyCYN 399

Parametri di massa per l’analisistrumentale MS/MS delle tossinealgali.

Ove non sono reperibili materiali diriferimento puri certificati, si puòandare a cercare lo ionecorrispondente sulla base delle masseattese ed i cammini diframmentazione prevedibili.

“dm” e “ddm” indicano rispettivamente le varianti demetilate ebis‐demetilate. ANA = Anatoxina e CYN = Cylindrospermopsina.

Da Salmaso et al.

Esempio: UPLC MS/MS iniez. diretta campione acquosoZu et al., Analytica Chimica Acta 626 ( 2008 ) 28–36

Effetto di diversi gradienti.

Sopra: acetonitrile/ meta‐nolo /acqua,

Sotto: metanolo/ acqua.

Parametri per l’analisi MS/MS (triplo quadrupolo) dellemicrocistine: ione precursore e ione secondario (m/z) edvalori per le energie di collisione (eV)

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Esempio di un gradiente di eluizione HPLC «multiresiduo» da letteratura (Meriluoto e Spoof, ISOC‐HAB 2005)

Posizione A: le tossine sono estratte dall’acqua su cartuccia SPE

Posizione B: l’eluente desorbe le tossine dalla cartuccia e le portadirettamente in colonna per l’analisi HPLC/UV e/o HPLC/MS

Durante l’analisi il sistema (Pos. A) estrae già in campione successivo

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Nel lago di Como e in alcuni laghi minori della Brianza, inoccasione di fioriture algali, sono state identificate edeterminate sia tossine algali già note sia nuovi polipeptidi direcente attenzione .

Ad un primo screening con metodi immunoenzimatici èseguita una indagine con tecniche HPLC ed HPLC/MS.

I dati sono poi stati elaborati e contestualizzati con l’aiutodella letteratura scientifica disponibile

Un primo evento, sul lago di Pusiano, studiato nel 2007, ha permessodi evidenziare presenza di alcune varianti di Microcistine assieme aaltri oligopeptidi (Anabenopeptine)

UVVisHPLCHPLC

Con l’ausilio estemporaneo di sistemi LC/MS e dati di letteratura, sono stateidentificate delle varianti demetilate delle Microcistine RR, LR e HTyYR (M+H =1024,1025; 1038,1039; 995,996; 1045,1046) e le Anabenopeptine B ed Eoppure F (M+H = 837,838,839; 857,858,859)

RR? LR?

RR? LR?

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Lago Periodo Colonna Tossine ritrovate e concentrazione (µg/l)

Annone Est 8‐2009 2,4 m Anatossina‐a 290

Annone Ovest 8‐2009 2,4 m Anatossina‐a 10

Alserio 2‐2010 3 m RR 0,2 LR 0,6 YR 1,6 LW 0,3

Annone Est 2‐2010 2,4 m probabili Oscillopeptine

Montorfano 2‐2010 4 m RR 18 LR 8 YR 6 Nodularina 0,9 LW 0.5

Pusiano 2‐2010 4 m Dm‐RR 6 YR 4 LA 0,2 LW 0,6 pr. Oscillopeptine

Como (Argegno) 2‐2010 24 m RR 0,1

Como (Como) 2‐2010 24 m Probabili Microcistine, varianti non identificate

Primi dati dai monitoraggi ‐ ARPA Lecco‐ 2009‐2010 ( valori in µg/L)

Monitoraggi Laghi Lecco 2010‐2011 ( valori in µg/L)

Punto di prelievo periodo

LR Dm‐RR RR LF YR NOD

tot

LA

tot

LY

tottot lib tot lib tot lib tot lib tot lib

L. Como ‐ Abbadia L. (*) 9‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

L. Como ‐ Abbadia L. 11‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

L. Como ‐ Abbadia L. 6‐2011 ‐ ‐ 0,2 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

L. Como ‐ Argegno 11‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

L. Como ‐ Argegno 6‐2011 ‐ ‐ 0,3 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

L. Como ‐ Como 11‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

L. Como ‐ Como 6‐2011 ‐ ‐ 0,1 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

L. Como – Dervio (*) 8‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

L. Como – Dervio (*) 9‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

L. Como ‐ Dervio 6‐2011 ‐ ‐ 0,3 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago del Segrino 4‐2010 0,2 ‐ ‐ ‐ 0,5 ‐ 0,4 0,2 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago del Segrino 8‐2010 0,7 ‐ ‐ ‐ 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago del Segrino 11‐2010 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago del Segrino 7‐2011 0,9 0,3 ‐ ‐ 0,2 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Alserio 7‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Alserio 8‐2010 0,3 0,1 ‐ ‐ 0,5 0,2 ‐ ‐ 0,3 ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Alserio 7‐2011 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,2 0,1 0,4 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Annone Est 4‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,1 0,2 0,2 0,2 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Annone Est 8‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,1 ‐ 0,9 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Annone Est 7‐2011 0,1 0,1 ‐ ‐ 0,2 0,2 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Annone Ovest 6‐2011 ‐ ‐ 0,1 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Annone Ovest 7‐2011 0,1 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Montorfano 6‐2010 0,3 ‐ ‐ ‐ 1,3 ‐ 3,5 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,5

Lago di Montorfano 7‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,3 ‐

Lago di Montorfano 8‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,2 0,2 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Montorfano 7‐2011 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Piano 5‐2010 0,2 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Piano 9‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,6 0,6 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Piano 11‐2010 0,2 ‐ ‐ ‐ 1,4 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Piano 2‐2011 0,3 ‐ ‐ ‐ 2,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Piano 4‐2011 0,2 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,2 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Piano 7‐2011 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,2 ‐ ‐

Lago di Pusiano 11‐2010 0,1 ‐ ‐ ‐ 2,0 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 0,1 ‐ ‐

Lago di Pusiano 2‐2011 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,7 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Sartirana 5‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ 0,7 0,7 0,1 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Lago di Sartirana 8‐2010 0,2 ‐ ‐ ‐ 1,1 0,2 0,3 ‐ 0,4 0,4 ‐ ‐ ‐

Lago di Palù (*) 7‐2010 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

Idroscalo Milano 6‐2011 ‐ 0,1 0,1 ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

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Microcistine: prime evidenze alle prese a lago degli impianti di potabilizzazione nel Lecchese( valori in ug/L)

Presa a Lago – punto prelievo Periodo Tossine ritrovate e concentrazione (µg/l)

Parè‐Valmadrera – pot. Br. entrata 11‐2009 Dm‐RR 0,05*

Parè‐Valmadrera ‐ pot. Br. entrata 10‐2010 Dm‐RR 0,05*

Griante – pozzo lago Cadenabbia 11‐2010 Dm‐RR 0,1

Griante – pozzo lago Cadenabbia 12‐2010 Dm‐RR 0,05*

Griante – pozzo lago Cadenabbia 1‐2011 Dm‐RR 0,04*

Pognana Lario – presa lago 11‐2010 LY 0,1

Pognana Lario – presa lago 1‐2011 Dm‐RR 0,04* LY 0,08*

(*) valori indicativi poiché sotto il limite di quantificazione del metodo di 0,1 µg/l

• Il problema delle tossine algali esiste, è degno di attenzione edeve essere tenuto sotto controllo (con particolare riferimentoalla destinazione del corpo idrico)

• I Laghi minori sembrano più vulnerabili al fenomeno; lepotenziali cause sono varie e diversificate

• Le metodiche HPLC / UPLC consentono risposte affidabili intempi anche brevi se necessario, con l’opportuna automazionedella fase preparativa

• Ancora poche le sostanze di riferimento al momento disponibili

• Servono tecniche strumentali in grado di dare risposte semprepiù efficaci (es. HPLC‐MS‐MS; HPLC‐HRMS, alta risoluzione) …ed è comunque sempre necessario inquadrare i dati alla lucedella letteratura scientifica disponibile

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Traccia superiore: spettro estratto dal cromatogram-ma sperimentale della Mi-crocistina LR.

Traccia inferiore: spettroteorico, ottenuto a partiredalla formula bruta delloione molecolare (MH+)della Microcistina LR.

Microcistine: analisi LC/massa ad alta risoluzione su Orbitrap XL,

Nuove sfide ambientali ed analitiche per ARPA Lombardia: i «contaminanti emergenti»

Inquinanti (organici edinorganici) attualmente noninclusi in programmi dimonitoraggio routinari epotenzialmente candidati aregolamentazioni future, inrelazione a ricerche sulla loroecotossicità, potenziali effettisanitari, dati di monitoraggio epresenza a livello ambientale.

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Nuove sfide ambientali ed analitiche per ARPA Lombardia:i «contaminanti emergenti»

Negli anni recenti le informazioni riguardanti la presenza di sostanze pericolosenelle acque sono aumentate. La maggior conoscenza e capacità analitica haportato maggior attenzione a nuove sostanze, che in alcuni casi a concentrazionimolto basse, sono sufficienti a causare danno al biota acquatico epotenzialmente quindi all’uomo.

• 4 gruppi di sostanze attualmente strettamente osservati:

‐ Pesticidi e loro metaboliti / interferenti endocrini

‐ Farmaci ad uso umano e veterinario

‐ Prodotti per la cura della persona

‐ Nanomateriali

Annex I e II: lista di 48 sostanze e relativi standard di qualità delle acque


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Nuove sfide ambientali ed analitiche per ARPA Lombardia:i «contaminanti emergenti

Esempio: i farmaci ed il loro destino ambientale…


FARMACI NELLE ACQUE DI INGRESSO ED USCITA DEL DEPURATORE DI MILANO(estratto da: INTERFERENTI ENDOCRINI NELLE ACQUE – FERRARA 24/09/2010 E. ZUCCATO )

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CARICO DI FARMACI ATTESI E MISURATI AL DEPURATORE DI MILANO(estratto da: INTERFERENTI ENDOCRINI NELLE ACQUE – FERRARA 24/09/2010 E. ZUCCATO )

La previsione è basata su calcoli teorici considerando le prescrizioni ottenute dal database dellaRegione Lombardia e le percentuali di escrezione metabolica dei vari farmaci: ciò permette diottenere stime che corrispondono effettivamente ai carichi misurati analiticamente sulle acquereflue in ingresso al depuratore di Milano

Nuove politiche dei laboratori ARPA Lombardia

VINCOLI PER ADEGUAMENTO TECNOLOGIA SU OGNI SEDE :

1) Aree effettivamente disponibili e loro dimensione e disposizione

2) Costo grossa strumentazione (es.LC/MS, LCMS/MS, HR‐LC/MS)

3) Personale efficacemente formato e dedicato

4) Strumentazione grossa e difficoltosamente spostabile (HR‐GC‐MS)

IPOTESI DELINEATE E STRADE PERCORSE:

‐ 2 Laboratori centralizzati con piattaforme strumentali attrez‐zate ad alto livello ed aree spaziose per analisi di base ed attività preparative dedicate ed attrezzate in maniera completa

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Grazie per l’attenzione

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