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Nuevas Tecnologías para el Diagnóstico Genético de las Enfermedades Infecciosas

Roberto Alonso FernándezBilbao, 24 de octubre de 2018

Congreso Nacional Laboratorio Clínico

2018

Roberto Alonso Fernández:• Servicio de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas,

Hospital General Universitario Gregorio Marañón. Madrid (Spain)• Departamento de Medicina (Sección Microbiología Clínica),

Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid (Spain)

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Travel grants

With:Siemens, Abbott, Roche, DiaSorin, BioRad, Vircell,

Copan, Gilead &ViiV Laboratories

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CONFLICTOS DE INTERÉS


2018

200 AÑOS DE MICROBIOLOGÍA TRADICIONAL

LOUIS PASTEUR, 1822-1895

• Cultivo de microorganismos

• Pruebas fenotípicas

• Tinciones

• Serología

• Técnicas fiables, grandes limitacionesCongreso Nacional Laboratorio Clínico

2018

MICROBIOLOGÍA MODERNA

KARY MULLIS

• 1983 Descubrimiento de la PCR (Nobel 86)

• 1985 alianza Cetus / Perkin Elmer

• 1991 Cetus vende patente PCR a Hoffman-La Roche

• 1995 primeros usos PCR en Microbiología Clínica

• 2000s. Otros hitos:• Automatización

• Espectrometría de masas (MALDI-TOFF)Congreso Nacional Laboratorio Clínico

2018

VENTAJAS DEL DIAGNÓSTICO GENÉTICO

• Altas sensibilidades y especificidades

• Rapidez

• Seguridad en el laboratorio

• Detección de microorganismos no cultivables(virus, bacterias “fastidiosas”)

• Versatilidad: permite detectar, cuantificar y caracterizar


2018

Infección por HCV

• Primera aplicación en el Laboratorio de Microbiología Clínica:• PCR + detección geles de agarosa

• AMPLICOR: PCR + Hibridación en MWP

• COBAS AMPLICOR: Sistema automatizado PCR + Hibridación con partículas magnéticas


2018

Infección por HCV

• Actualmente alta automatización, PCR tiempo real o TMA

• Genotipado: PCR tiempo real o PCR + hibridación


2018

Antivirales de Acción Directa


2018

Infección por HIV

• Carga Viral plasmática (1995): copias/ml• Medida por: PCR tiempo real, bDNA, TMA, NASBA

• Indica pronóstico y eficacia de tratamientos


2018

Infección por HIV

0

100

200

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400

500

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800

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1 2 3 4 5 6

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2018

Infección por HIV

• Genotipado de resistencias a antirretrovirales (2002)• Medida por secuenciación (Sanger, UDS)

• Orientación terapeutica


2018

Infección por HIV

Estudio VIRADAPT, 2002

Estudio GART, 2002


2018

Otras “Grandes” Cargas Virales


2018

SISTEMAS TRADICIONALES

• Extracción + Amplificación / Detección

• Preparación de “master mixes”

• Horas de procesamiento

• Necesidad de acumular: “Batches”

• De técnicas manuales a semi-automatizadas

• Normalmente “Single-plex”


2018

HACIENDO MÁS SENCILLO EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO: MONO-TEST

• Desarrollo de la Biología molecular y de la Ingeniería (equipos y microfluídica)

• Cartuchos mono-test

• Procesamiento sencillo

• Incluyen proceso completo

• Rápidos

• Automatizables

• POC???Congreso Nacio

nal Laboratorio Clínico 2018

Sistema GeneXpert (Cepheid)


2018


2018

• Desarrollo y lanzamiento 2004-2008

• 2010 OMS: promoción y subvención GeneXpertpara Dx de TB en 88 países endémicos de baja renta (10$ vs. 50$).

• 2015 CDC: “GeneXpert ha revolucionado el Dx de TB”

Sistema GeneXpert (Cepheid)


2018


2018

Sistema GeneDrive HCV


2018

• Detección simultanea de varias dianas

• Sistemas: PCRrt con multiples primers y sondas, curvas de melting, microarrays, luminex.

De sistemas “singleplex” a sistemas “multiplex”


2018


2018

• Máxima capacidad “multiplex”

• No buscamos un microorganismo concreto

• Buscamos conjuntos de microorganismos (heterogéneos) causantes de un síndrome común (baja especificidad de la clínica).• Infección SNC

• Infección respiratoria

• GEA

• ETS

• Sepsis

• Infección osteoarticular / prótesis

• Unfecciones transmitidas por artrópodos

CAMBIO DE PARADIGMA:DIAGNÓSTICO SINDRÓMICO


2018

Sistemas básicos: Seeplex SNC (Seegene)


2018

Un paso más: Direct Flow Chip / Fast Track


2018

La nueva generación: cartuchos mono-test FilmArray (BioMerieux)

• “Sample to result”

• Incluye:• Extracción

• PCR I: PCRs nested genéricas degeneradas

• PCR II: Conjunto de 102 PCRs singleplex específicas

• Detección por curvas de melting


2018

FILMARRAY (BioMerieux)Panel Respiratorio

20 dianas: virus y bacterias


2018

FILMARRAY (BioMerieux)Panel Gastrointestinal

22 dianas: virus, bacterias y protozoosCongreso Nacio


FILMARRAY (BioMerieux)Panel Sepsis

27 dianas: bacterias, levaduras y genes de resistencia


2018

FILMARRAY (BioMerieux)Panel SNC

14 dianas: bacterias, virus y levadurasCongreso Nacional Laboratorio Clínico

2018

GenMark“Electrowetting”


2018

QIA stat-Dx

• Extracción/purificación en columna

• 8 canales de PCRrt, 6-plex c/u


2018

Verigene (Nanosphere)

Au Au

Au Au

c-Ag


2018

Curetis (Unyvero)


2018

Curetis (Unyvero)

50 dianas


2018

Curetis (Unyvero)

46 dianasCongreso Nacional Laboratorio Clínico

2018

T2MR (Magnetic Resonance)


2018

Una nueva forma de cuantificar:PCR digital


2018

AdvanDX QuickFISH

AdvanDX - QuickFISH®• 30 minutos, 4 ensayos, diana RNA 16S

• Más barato que técnicas de PCR a tiempo real


2018

Accelerate Pheno (BC)

• Identifica microorganismo en 1.5h vía filtración en gel, FISH

• Genera un fenotipo de sensibilidad cuantitativo 5.5h después por análisis celular morfocinético.

• Adelanta tiempo de diagnóstico con S 88,7-100%, E 97-100%

Marschal et al. JCM 2017


2018

Utilidad de las secuencias 16S rRNA

• Presente en todas las bacterias (18S rRNA en hongos)

• Muy conservado / muy variable

• “Gold standard” para ID

• Estudios de filogenia

• Descubrimiento de nuevos microorganismos: Tropherymawhipplei (1907-2001)


2018

Caracterización de microorganismos

• Tipación microbiana: género especie tipo

• Genes de resistencia: mec, van, oxa

• Factores de virulencia, toxinas (Panton Valentine en S. aureus, Toxina Binaria en C. difficile etc.) Congreso Nacio


Microbiota, Microbioma y Metagenómica

• Flora microbiana, conjunto de sus genes, estudio de esos genes

• Microbiota equilibrio salud/enfermedad


2018

EVOLUCIÓN TECNOLÓGICA Y SUPERVIVENCIA


2018

EVOLUCIÓN TECNOLÓGICA Y SUPERVIVENCIA

• Reducción en morbilidad• Menor nº de complicaciones• Control de la infección y

epidemiológico• Ahorro:

• Reducción de nº ingresos• Reducción en días de estancia

hospitalaria (y UCIs)• Tratamientos más dirigidos,

menor tratamiento empírico


2018

• Detectan DNA, no microorganismos vivos: M. tuberculosis

• Muy alta sensibilidad. No distinguen entre contaminación, colonización e infección: P. jirovecii

• De momento no aportan perfiles complejos de sensibilidad a antimicrobianos

• Falta de “gold standard” adecuados

• Interpretación de nuevos hallazgos

• Oferta comercial (p. ej. baja para micosis y parasitosis). Dificultades con ensayos “home brew”

Limitaciones del Dx genético


2018

Panther (Hologic) TMA (RNA)

TRANSCRIPTOMICA

PROTEÓMICA (MALDI-TOF) / Cultivos rápidos (turbidimetria)

Algunas soluciones

Establecimiento de PUNTOS DE CORTE


2018

¡El futuro es impredecible!

Sensores moleculares: “Cantilevers”


2018


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