NRL - AO: METODI ANALITICI PER

LA DETERMINAZIONE DEI RESIDUI

DI FITOFARMACI NEI PRODDOTTI

DI ORIGINE ANIMALE

VIII Convegno Attività dell’Amministrazione Pubblica in

materia di controllo dei Residui di Fitofarmaci negli alimenti

-17 novembre 2010-

GRAZIELLA AMENDOLAISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’

graziella.amendola@iss.it

NRL-AO: Laboratorio Nazionale di Riferimento per gli alimenti di origine

animale e alimenti ad elevato contenuto di grasso

Indice

Introduzione:

- Come arrivano i residui negli alimenti

- Scopo dell’analisi

- Cenni normativa sui pesticidi / piani di controllo

Metodi di analisi per alimenti di origine animale:

- Reg. 882/2004 Metodi ufficiali e/o metodi validati

- Metodo EN/ EURL-AO

- Metodi NLR-AO:

•Uovo

•Carne

•Olio

•Burro

•Miele

Determinazione della sostanza grassa

Metodo QuEChERS

- Applicazione a matrice a basso contenuto di grassi

-Applicazione a matrici ad alto contenuto di grassi

Metodo per il latte, carne e fegato

Conclusioni

agricoltura

Farmaci

Veterinari

Contaminazione

ambientale

Residui di fitofarmaci in prodotti di origine animale

Scopo dell’analisi

SICUREZZA DEGLI

ALIMENTI

RISPETTO DEI

LIMITI MASSIMI

RESIDUI

Reg.

396/2005

Normativa pesticidi

Reg.

882/2004

SANCO 1067/2010 rev3

piano di controllo dell’Unione Europea per il 2011- 2013

Quali matrici e quali principi attivi ?

2011

•33 residui di pesticidi

•Carne di pollame

•Fegato (suini, pollame,bovini e altri ruminanti)

Numero di campioni per Stato Membro

Italia:

65 campioni combinazioni prodotto/residuo di pesticida

Reg. 882/2004

Articolo 11 Metodi di campionamento e di analisi.

1. I metodi di campionamento e di analisi utilizzati nel contesto dei

controlli ufficiali sono conformi alle pertinenti norme comunitarie

oppure:

a) se tali norme non esistono, a norme o protocolli riconosciuti

internazionalmente, ad esempio quelli accettati dal Comitato Europeo

di Normalizzazione (CEN) o quelli accettati dalla legislazione

nazionale; oppure

b) in assenza, ad altri metodi utili al raggiungimento degli obiettivi o

sviluppati conformemente a protocolli scientifici.

2. Allorquando il paragrafo 1 non è d'applicazione, i metodi di analisi

possono essere convalidati in un unico laboratorio conformemente

ad un protocollo riconosciuto internazionalmente.

3. I metodi di analisi devono essere caratterizzati, quando possibile,

dai criteri opportuni elencati nell'allegato III

Allegato III

Caratterizzazione dei metodi di analisi

1. I metodi di analisi devono essere caratterizzati dai

seguenti criteri:

a) esattezza;

b) applicabilità (matrice e gamma di concentrazione);

c) limite di rilevazione;

d) limite di determinazione;

e) precisione;

f) ripetibilita;

g) riproducibilita;

h) recupero;

i) selettivita;

j) sensibilita;

k) linearita;

l) incertezza delle misurazioni

Reg. 882/2004

METODO CEN 1528

WG 3 "Pesticides in fatty foods“

- EN 1528-1:1996 Fatty food - Determination of pesticides and

polychlorinated biphenyls (PCBs) - Part 1: General

- EN 1528-2:1996 Fatty food - Determination of pesticides and

polychlorinated biphenyls (PCBs) - Part 2: Extraction of fat,

pesticides and PCBs, and determination of fat content

- EN 1528-3:1996 Fatty food - Determination of pesticides and

polychlorinated biphenyls (PCBs) - Part 3: Clean-up methods

- EN 1528-4:1996 Fatty food - Determination of pesticides and

polychlorinated biphenyls (PCBs) – Part 4: Determination,

confirmatory tests, miscellaneous-

LIQUIDI

Latte

POLVERI

Latte in polvere

e derivati

SOLIDI

Formaggi,

Carne,

Pesce, Uova

Centrifugazione

Separazione crema

ESTRAZIONE

con etere di petrolio

Omogeneizzazione

ESTRAZIONE

con Soxtherm

esano-acetone 1:1 v,v

Ricostituzione

ESTRAZIONE

imbuto separatore

metanolo,

dietiletere

etere di petrolio.

Residuo grasso

Metodo di analisi dei residui di pesticidi in prodotti di

origine animale usato dal EURL basato su EN 1528

Residuo grasso

GPC

(Gel Permeation Chromatography)

Cicloesano-etile acetato

1:1 v,v

Colonna

di Gel di silice

toluene

toluene-acetone 95:5 v,v

toluene acetone 80:20 v,v

GC-ECD (2 colonne)

GC-MSD

SPE C18 (5g)

60 mL acetonitrile

GC-MSD

GC-FPD

10 g uova

Omogeneizzazione

100 mL acetonitrile

Filtrazione

Sottovuoto

MgSO4 anidro

evaporazione

evaporazione

UOVANRL-AO ITALIA

UOVANRL-AO ITALIA

Estrazione:

acetonitrile (solvente apolare)

Ridotta estrazione di grasso

Ampio range di principi attivi estratti,

inclusi i composti lipofili (es HCB)

UOVA contenuto di grasso = 10%

Grasso residuo:

dopo estrazione = 115 22 mg (n=31)

dopo purificazione = 2 0.7 mg (n=31)

Rimozione del grasso finale è del 98%

UOVANRL-AO ITALIA

16 ORGANOFOSFORATI

LOQ = 0.005mg/Kg

Spiking level: 0.005 mg/Kg

REC% = 76-100%, CV=5-13 %

Spiking level: 0.01-0.05 mg/Kg

REC% = 72-96%, CV = 4-17 %

Azinphos Metile non recuperato

Pirimifos metile Rec = 35%

29 ORGANOCLORURATI

LOQ = 0.002-0.025 mg/Kg

Spiking level: 0.002-0.025 mg/Kg

REC% = 80-98%, CV = 5-21 %

Spiking level: 0.005-0.5 mg/Kg

REC% = 79-99%, CV = 3-22 %

CV = 22%

Metossicloro

Resmetrina

7 PIRETROIDI

LOQ = 0.005-0.01 mg/Kg

Spiking level: 0.005-0.01 mg/Kg REC% =89-100%, CV = 6-15 %

Spiking level: 0.01-0.05 mg/Kg REC% = 92-99%, CV = 3-10 %

CARNE DI SUINONRL-AO ITALIA

Estrazione

con100 mL

acetonitrile

Filtrazione

Sottovuoto

MgSO4 anidro

evaporazione

evapoarzione

SPE

C18(2g)+Florisil(2g)

30 mL acetonitrile

GC-FPD

GC-MSD

10 g carne

Omogeneizzata

CARNE DI SUINONRL-AO ITALIA

Estrazione:

acetonitrile (solvente apolare)

Ridotta estrazione di grasso

Ampio intervallo di principi attivi estratti

(scarso recupero dei composti lipofili es. HCB)

Carne suino analizzata = 15% di grasso

Grasso residuo:

dopo estrazione = 125 ± 28 mg (n=7)

dopo purificazione = 1.6 ± 0.5 mg (n=8)

Rimozione del grasso finale è del 99.9%

CARNE DI SUINONRL-AO ITALIA

16 ORGANOFOSFORATI

LOQ = 0.007-0.02 mg/Kg

Spiking level: 0.007-0.02 mg/Kg

REC% = 70-99%, CV = 3-22 %

Spiking level: 0.06-0.6 mg/Kg

REC% = 84-128%, CV = 1-16 %

Azinphos Metile non recuperato

Metacrifos Rec = 65-67%

23 ORGANOCLORURATI

LOQ = 0.006-0.035 mg/Kg

Spiking level: 0.006-0.035 mg/Kg

REC% = 70-120%, CV = 2-26 %

Spiking level: 0.2-0.7 mg/Kg

REC% = 74-120%, CV = 3-13 %

Quintozene Rec = 69-62 %

23 ORGANOCLORURATI

LOQ = 0.002-0.025 mg/Kg

Spiking level: 0.002-0.025 mg/Kg

REC% = 68-99%, CV = 2-11 %

Spiking level: 0.05-0.2 mg/Kg

REC% = 67-92%, CV = 2-10 %

Aldrin Rec = 57 %

Chlorobenzilato Rec = 60 %

HCB Rec =42%

8 PIRETROIDI

LOQ = 0.016-0.035 mg/Kg

Spiking level: 0.016-0.035 mg/Kg REC% =71-114%, CV = 5-15 %

Spiking level: 0.05-0.9 mg/Kg REC% = 94-120%, CV = 1-12 %

10 g Burro

fuso

Estrazione

con acetonitrile

70 mL

SPE

C18(5g)

100 mL acetonitrile

evaporazione

evaporazione

Organoclorurati

Piretroidi

GC-MSD

BURRONRL-AO ITALIA

Purificazione

congelamento

15 mLacetonitrile

Organofosforati

GC-FPD Florisil (2 g)Esano:toluene

80:20 v,v

50:50 v,v

Estrazione:

acetonitrile (solvente apolare)

Ridotta estrazione di grasso

Ampio intervallo di principi attivi estratti

(scarso recupero dei composti lipofili es. HCB)

Burro = 80-84 % di grasso

Dopo estrazione = 800 mg di grasso

Dopo congelamento = 72 mg di grasso

Dopo C18/Florisil= 2 mg di grasso

BURRONRL-AO ITALIA

17 ORGANOFOSFORATI

LOQ = 0.005mg/Kg

Spiking level: 0.01 mg/Kg

REC% = 81-103%, CV = 2-9 %

Spiking level: 0.05-0.2 mg/Kg

REC% = 78-100%, CV = 2-8 %

Azinphos Metile non recuperato

Profenofos Rec = 58 %

Pirimifos Metile Rec = 45 %

BURRONRL-AO ITALIA

24 ORGANOCLORURATI

LOQ = 0.002-0.025 mg/Kg

Spiking level: 0.002-0.025 mg/Kg

REC% = 68-99%, CV = 2-11 %

Spiking level: 0.05-0.2 mg/Kg

REC% = 67-92%, CV = 2-10 %

Aldrin Rec = 57 %

Chlorobenzilato Rec = 60 %

HCB Rec =42%

7 PIRETROIDI

LOQ = 0.01-0.025 mg/Kg

Spiking level: 0.01-0.025 mg/Kg REC% =75-99%, CV = 3-14 %

Spiking level: 0.023-0.25 mg/Kg REC% = 97-117%, CV = 5-12 %

Resmetrina Rec=57% a livello del LOD

5 g olio di oliva

in 16 mL esano

SPE

Extrelut 20

(rimozione dell’esano)

SepPakSilice

C18(2g)

100 mL

acetonitrile

GC-FPD

GC-MSD

evaporazione

OLIO NRL-AO ITALIA

Contenuto di grasso

nell’olio di oliva:

80%

Residuo di grasso nell’estratto

Finale = 20-30 mg

1) Atti del Convegno “ XII Symposium Pesticide

Chemistry” – Università Cattolica di Piacenza

3-6 set. 2007

2) Rivista Italiana Sostanze Grasse

“Validation of a method for the determination

of pesticide residues in olive oil by GC-MS”

30 Pesticidi: organoclorurati, organofosforati,

piretroidi e erbicidi

LOQ = 0.01- 0.15mg/Kg

Spiking level: 0.01- 0.15 mg/Kg

REC% = 83-111 %, CV= 2-12 %

Spiking level: 0.1- 0.5mg/Kg

REC% = 94-112 %, CV=1- 6%

Testato anche il buprofezin con scarso successo

OLIO

NRL-AO ITALIA

10 g Miele

disciolto in

Acetone + acqua

1:1 v,v

SPE

Extrelut 20

Diclorometano (DCM)

100 mL

evapoarzione

GC-FPD

GC-MSD

LC/DD/Fl

MIELENRL-AO ITALIA

Miele:

99.6% carboidrati, 0.3% proteine,

zero grassi.

Estrazione in acetone:acqua 1:1 v,v

•Consente di solubilizzare il miele

•Estrae un ampio range di composti

SPE con Exrtelut 20/DCM

•Rimozione dei coestrattivi idrofili

•Recupero ottimo dei composti

•Residuo finale = 6 mg (n=120)

52 composti:15 organofosforati, 17organoclorurati,

8 piretroidi e 12 N-metilcarbammati

Per tutti i composti testati i Rec =70-103 %

Con eccezione di:Aldrin, Cipermetrina e fenvalerate

Rec= 61-69 % a livello del LOD

Recuperi Anomali: Aldicarb degrada in Aldicarb sulfoxide

MIELENRL-AO ITALIA

Journal of Environmental Science and Health, Part B - Vol. 45, issue 8, 789

G.Amendola, P. Pelosi and R. Dommaro

“Solid-phase extraction for multi-residue analysis of pesticides in honey”

Espressione del LMR

(EC) Reg. 396/2005

Annex I

Note 5, 6, 7

Pesticida e/o metabolita

lipofili (log Pow ≥ 3)

il LMR è espresso come

mg/kg di grasso o di prodotto,

in funzione del contenuto di

grasso nel prodotto

Pesticida e/o il metabolita

solubile in acqua

(log Pow < 3)

il LMR è espresso come

mg/kg di prodotto.

DETERMINAZIONE DELLA SOSTANZA GRASSA

Weibull-Stoldt ESTRAZIONE

A FREDDO

SOXHLET

ASE

ESTRATTORI

AUTOMATIZZATI

(Soxtherm,

Soxtec..)

SOXHLET ESTRATTORE AUTOMATIZZATO

Campione + sabbia

Essiccare a 130°C 1h

Estrazione: 70°C, etere di petrolio

Evaporazione fase organica

Determinazione gravimetrica

Estrattore

SER 148

VELP scientifica

Il metodo è stato confrontato con

con il Soxhlet:

risultati comparabili

Riproducibile

Consumo di solvente

Tempi lunghi

Weibull-Stoldt

•Digestione del campione

con HCL diluito

•Filtrazione del grasso

•Essiccamento del filtro

•Estrazione del grasso

con Soxhlet e Etere di petrolio

•Evaporazione fase organica

•Determinazione gravimetrica

Riproducibile

Rapido

ESTRAZIONE A FREDDO

Secondo EN 1528 Cold extraction

Campione + Na2SO4

Estrazione a freddo con esano (2 min. agitazione

con vortex, poi 10 min. in bagno ad ultrasuoni)

•Evaporazione fase organica

• Determinazione gravimetrica

Più rapido del Soxhlet

Consumo di solventi

Meno riproducibile

ASE

Accelerated Solvent Extraction

Ridotto consumo di solventi

Riproducibile

Alti costi

Estrazione con solvente

a temperatura e pressioni

elevate, in presenza

di gel di silice

QuEChERS

Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe

15 g campione

(grasso tra 2-20%)

Uova, carne,

pesce, latte ecc.

GC/MS

LC/MS/MS

Estrazione

15 mL di acetonitrile

1% acido acetico

6 g MgSO4

1.5 g acetato di sodio

Purificazione

d-SPE

(dispersive solid-phase extraction)

+50 mg C18

+50 mg PSA

(primary secondary

amine sorbents)

+ 150 mg MgSO4

centrifugazione

QuEChERS

Estrazione: acetonitrile + acido acetico

migliora il recupero di composti ph dipendenti

come folpet, captan, diclofuanid e clortalonil

Purificazione:

la d-SPE è facile, economica, rapida,

usa minori quantità di materiali rispetto alla SPE

in colonna, ma un po’meno efficace in termini di

purificazione. Tuttavia poiché migliora i recuperi

di composti a carattere acido/basico come acefate,

carbendazim, imazalil, metamidofos, pimetrozine

e tiabendazolo è stata scelta nel QuEChERS

Pesticidi: 32 composti con ampio range di

proprietà chimico-fisiche.

Composti polari e semipolari: Rec%= 70-120%

Composti apolari: Rec%<70% (diminuisce con

l’aumentare del tenore di grasso)

Esempio:

HCB nel latte Rec. 62% (grasso 3.5%)

HCB nell’uovo Rec. 45% (grasso 10%)

HCB nell’avocado Rec. 27% (grasso 15%)

QuEChERS

QuEChERS

10 g olive

grasso >20%

Estrazione

10 mL di acetonitrile

4 g MgSO

1 g NaCl

Centrifugare

Purificazione

d-SPE

50 mg C18

50 mg PSA

50 mg GCB

(graphitized carbon black)

+ 150 mg MgSO4

GC/MS

LC/MS/MS

2 g olio

+ 7 g di acqua

grasso >20%

QuEChERS

Estrazione: Acetonitrile, non idoneo per l’estrazione dei

composti lipofili. Non considerati

Purificazione: migliore con GCB, ma questo sorbente

ritiene alcuni pesticidi planari (HCB, tiabendazolo

e clortalonil). Non considerati

TESTATI 19 PESTICIDI

Recuperi: 70-120% con CV= 1-17%

eccezione p,p’ DDE, pyriproxifen e deltametrina

METODO PER ORGANOFOSFORATI E CARBAMMATI

NEL LATTE, FEGATO E CARNE

5 g campione

(+ 1mL di acqua

per carne/fegato)

in tubo da centrifuga

Estrazione

15 mL acetonitrile/

1% acido formico

Agitare e centrifugare

LC/MS/MS

Investigati 50 composti

nel latte, nella carne e nel fegato.

Rec= 70-120% CV< 20%

Ecetto per:

Amitraz, fention, cyromazine

paraoxon metile in tutte le matrici,

diclorvos solo nella carne.

LC/MS/MS non è una tecnica

idonea per alcuni OP.

RIKILT – Institute of food Safety

CONCLUSIONI

Si possono utilizzare metodi diversi purché

adeguati allo scopo e validati.

Ideale lo sviluppo di metodi che siano anche:

economici, rapidi, sicuri (ridotto uso di solventi),

riproducibili, multi-residui e con un ampio

campo di applicazione.

LA SFIDA CONTINUA …..