NEI SOLI USA CI SONO DA 6 A 80 MILIONI DI PERSONE OGNI ANNO COLPITI DA MALATTIE DI ORIGINE...

NEI SOLI USA CI SONO DA 6 A 80

MILIONI DI PERSONE OGNI ANNO COLPITI

DA MALATTIE DI ORIGINE ALIMENTARE CON 9.000 DECESSI ED UN COSTO SOCIALE DI CIRCA 5 MILIARDI DI

DOLLARI

LO STUDIO DELLA MICROBIOLOGIA ALIMENTARE LO STUDIO DELLA MICROBIOLOGIA ALIMENTARE

Provenienza e significato delle varie specie microbiche presenti

Comportamento microbico durante i processi tecnologici

Influenza durante la conservazione

Particolari gruppi microbici che determinano l’insorgenza di malattie

INFORMAZIONI RICAVATE DALLAINFORMAZIONI RICAVATE DALLA

MICROBIOLOGIA ALIMENTAREMICROBIOLOGIA ALIMENTARE

Stabilire le fonti di contaminazione

Valutare il rispetto delle norme igieniche

Valutare le condizioni di conservazione

Seguire l’esatto susseguirsi di certi processi industriali

Eliminare del commercio i prodotti contaminati

ESAME BATTERIOLOGICO DEGLI ALIMENTIObiettivo primario: assicurare la tutela della salute del

consumatore cioè dimostrare l’assenza di germi patogeni

Limiti

distribuzione non omogenea dei batteri patogeni nel prodotto

presenza di germi patogeni in basse concentrazioni

presenza di agenti patogeni non battericiQuesti limiti si possono in parte risolvere con:

La ricerca di germi indice di contaminazione.

Requisiti di un germe indice di contaminazione:

avere la stessa nicchia ecologica del patogeno;

avere la stessa modalità di trasmissione del patogeno;

essere presente in numero elevato;

essere facilmente rilevabile.

Germi indice di contaminazione fecale

1) Coliformi

2) Enterococchi

3) Clostridi solfito-riduttori

Il “nostro” laboratorio Il “nostro” laboratorio batteriologico…batteriologico…

LE PROCEDURE LE PROCEDURE BUROCRATICHE PER APRIRE BUROCRATICHE PER APRIRE UN NUOVO LABORATORIO DI UN NUOVO LABORATORIO DI

ANALISI CHIMICHEANALISI CHIMICHE

I principali “permessi” da I principali “permessi” da richiedere alle autorità richiedere alle autorità

competenti:competenti:

A.A. Idoneità dei locali di competenza Idoneità dei locali di competenza del Comune (destinazione per del Comune (destinazione per

esercizio commerciale)esercizio commerciale)

B. Adempimenti dei Vigili del Fuoco in riferimento alla presenza di

solventi (D.P.R. 27 aprile 1955 n° 547)



C.C. Adempimenti per gli impianti Adempimenti per gli impianti elettrici di competenza del elettrici di competenza del servizio Igiene e Ambiente della servizio Igiene e Ambiente della ASLASL (ex ENPI L. 46/90)(ex ENPI L. 46/90)

D. Adempimenti per le sostanze radioattive di competenza delle Regioni ( L. 1860 del 31.12.1962)


competenti:competenti:E.E. Stoccaggio e preparazione di Stoccaggio e preparazione di

prodotti chimici di prodotti chimici di competenza delle ASLcompetenza delle ASL

F.F. Stoccaggio e preparazione di Stoccaggio e preparazione di additivi chimici per prodotti additivi chimici per prodotti alimentari di competenza alimentari di competenza delle Regioni (DPR 327 del delle Regioni (DPR 327 del 26.03.198026.03.1980



G.G. Autorizzazione allo scarico di Autorizzazione allo scarico di competenza comunalecompetenza comunale

H.H. Smaltimento dei rifiuti Smaltimento dei rifiuti (D.L.vo n° 22/97)(D.L.vo n° 22/97)

I.I. Richiesta di emissione di Richiesta di emissione di fatture con IVAfatture con IVA

Fattori che possono incidere sui risultati delle analisi microbiologiche:

la preparazione specifica, l’esperienza e l’interesse dell’analista

l’idoneità delle apparecchiature ed il loro stato di manutenzione

l’accuratezza di preparazione dei terreni di coltura e la qualità dei loro componenti

Qualsiasi schema di analisi, anche se completo, dettagliato e ben eseguito, ha

bisogno di un razionale criterio di campionamento. Questo perché i risultati ottenuti, dall’esame di una sua aliquota, dovranno essere estrapolati ad un intero

lotto o partita di alimento.

CAMPIONAMENTO

a) Unità campionarie (o di campionamento = u.c.): singola aliquota o confezione di alimento, scelta casualmente e sulla quale si eseguiranno le opportune analisi;

b) Lotto (o partita): con questo termine si intende, per convenzione, una quantità di alimento prodotta e confezionata in condizioni uniformi entro un limitato periodo di tempo (per esempio: giornata lavorativa, turno di lavoro, ecc.). Risulta evidente che quanto meno uniformi sono le condizioni di produzione, tanto minore deve essere, ai fini di una maggiore omogeneità, il suddetto lasso di tempo preso in considerazione ai fini del campionamento;

c) Campione rappresentativo: quello le cui condizioni di produzione si avvicinino, sotto il profilo quali-quantitativo quanto più possibile a quelle di tutto il lotto dal quale è stato prelevato;

d) Campione casuale: insieme di unità campionarie selezionate da un lotto precedentemente definito, seguendo un procedimento che assicuri ad ogni unità la medesima probabilità di essere prelevato.

Piano di campionamento elaborato da I.C.M.F.S.

(International Committee Microbiological Foods Standardization)

I valori guida sono espressi dai seguenti simboli:

m = indica il limite prefissato per una determinata caratteristica microbiologica dell’alimento in esame. (es.: i valori di carica microbica saprofitaria)

M = indica valori superiori a quello sopra indicato, non eccedenti tuttavia un determinato livello.

c = indica il numero di aliquote componenti il campione in esame nei quali è consentito il raggiungimento dei valori indicati da M.

n = indica le aliquote di prodotto componenti il campione in esame.

Classificazione dei campioni in esame

1. ACCETTABILI: con valori inferiori ad “m”.

2. PARZIALMENTE ACCETTABILI: con valori compresi tra “m” e “M”.

3. INACCETTABILI: con valori superiori ad “M”.

La severità di un piano di campionamento dipende direttamente dai valori che si attribuiscono ad

“n” e “c”

Valori sogliaValori soglia [[oltre il quale possono insorgere tossinfezioni alimentari e malattie infettiveoltre il quale possono insorgere tossinfezioni alimentari e malattie infettive]]

AGENTEAGENTE Livello soglia per popolaz. sanaLivello soglia per popolaz. sana

SalmonellaSalmonella <10<1055

Tossina stafilococcicaTossina stafilococcica <1 mcg<1 mcg

Clostridium perfrigensClostridium perfrigens 101066

CampylobacterCampylobacter 101066

Vibrio choleraVibrio cholera 101066

ShigellaShigella 101011 – 10 – 1022

H.A.V.H.A.V. 101033

YersiniaYersinia 101099

Norwalk virusNorwalk virus 1010

Terreno di coltura

AGAR: Estratto di alga rossa Solidifica a 42°C Non è digeribile

Acqua Elementi nutrizionali Sostanze inibenti

Schema di controllo delle operazioni per la Schema di controllo delle operazioni per la preparazione dei terreni di colturapreparazione dei terreni di coltura

L’impiego di metodi analitici non idonei può comportare il

conseguimento di falsi risultati sia negativi che positivi. I primi

costituiscono un problema di salute pubblica; i secondi producono ingiustificati danni di natura

economica e giuridica.

Tecnica delle membrane filtranti

Membrane filtranti

ENUMERAZIONE BATTERICA

SVANTAGGISVANTAGGI

• Eccessiva selettività dei terreni ( e temperature)

• Interferenza da materiale in sospensione

ostruzione dei pori

può provocare un film di crescita

• Più batteri formanti una colonia (U.F.C.)

• Errori di laboratorio

bolle d’aria

terreno scarso

dischetti sommersi

Membrane filtranti

VANTAGGIVANTAGGI

• rapidità dei risultati (24/48 h)

• maggiore accuratezza e precisione

• riduzione dello spazio occupato

• < laboriosità di esecuzione

• esami di volume maggiori di acqua

• possibilità di rilevare la presenza di batteri diversi da quelli ricercati


Tecnica per inclusioneTecnica per inclusione

1 2 3

4 5 6


Formula di Poisson:

ZiNi

CiX

X = numero di germi stimato per ml

Ci = totali germi contati per ogni diluizione

Ni = piastre per diluizione

Zi = diluizione

C1= conte batteriche con maggior numero di CFUC2= conte batteriche con minor numero di CFU

VALUTAZIONE DELL’ATTENDIBILITA’ DELLA CONTA SECONDO LE MEDIE DI POISSON

Pro

va p

resu

nti

vaP

rova

con

clu

siva

con

ferm

a

+-

Indice MPNIndice MPN


Formula di Thomas per MPN

NT

PX

P = numero di tubi positivi

N = volume del campione nei tubi negativi

T = volume totale del campione inoculato in tutti i tubi

X = numero di germi per 100 ml

Tecnica MPN


SVANTAGGI Metodica lenta (48-96 h) e laboriosa

Procedimento costoso

Manca di precisione nei risultati

I risultati possono essere inficiati da fenomeni di interferenza dovuti alla presenza nel campione di:

Flora microbica concorrente

Elevata concentrazione di nitrati che inibisce l’attacco fermentativo dei coliformi agli zuccheri (EFFETTO ANAEROGENICO)

D. lgs. n° 31 del 2 febbraio 2001D. lgs. n° 31 del 2 febbraio 2001Attuazione della direttiva 98/83 CE relativa alle acque destinate al consumo umanoAttuazione della direttiva 98/83 CE relativa alle acque destinate al consumo umano

ISO(International Standardisation Organisation – Ente Mondiale di Normazione)

CEN (Comitato Europeo di Normazione – Ente Europeo di Normazione)

UNI(Ente Italiano di Normazione)

UNI EN ISO 9000

ha emesso fin dal 1987 una famiglia di standard (NORME) che definiscono le prescrizioni da adottare in azienda per

realizzare un SISTEMA di QUALITA’: si tratta della famiglia di standard

(ISO 9000)

ha recepito le norme ISO come EN ISO 9000. In ITALIA

le ha recepite come

Definizione del campo

di applicazioneConfronto con un metodo

di riferimento

produttività

selettività

riproducibilità

Allestimento colture batteriche mistecon germi interferenti

Diluizione della coltura di partenzafino a concentrazioni leggibili

Analisi con il metodo di riferimento

lettura

Conferma biochimica

Calcolo della sensibilità e della specificità

Analisi con il metodo di prova

lettura

Conferma biochimica

Calcolo della sensibilità e della specificità

Verifica delle differenze di recupero mediante analisi

della regressione lineare

Confronto della specificità e sensibilità mediante il test 2

Il nuovo protocollo viene applicato a Il nuovo protocollo viene applicato a campioni sottoposti ad analisi routinarie campioni sottoposti ad analisi routinarie accanto al metodo tradizionale, con accanto al metodo tradizionale, con conseguente verifica dei risultati.conseguente verifica dei risultati.

Il metodo di riferimento viene sostituito con quello alternativo qualora i risultati ne comprovino la superiorità o l’equivalenza.

Tutta la documentazione viene archiviata.

Controllo microbiologico dell’aria e delle superfici degli ambienti di lavorazione

Campionatore d’aria

Piastre da contatto

I microrganismi gram + (cocchi e bastoncelli) più interessanti per la microbiologia degli alimenti fanno parte delle seguenti famiglie e generi:

Cocchi: fam. Micrococcaceae

Gen. MicrococcusGen. Staphylococcus

Bastoncelli Gram + sporigeni

Bastoncelli Gram + regolari non sporigeni

Gen. Streptococcus Gen. PediococcusGen. Leuconostoc

Gen. Bacillus Gen. Clostridium

Gen. Lactobacillus Gen. ListeriaGen. ErysipelotrixGen. Brochotrix

Bastoncelli Gram + irregolari non sporigeniGen. Corynebacterium Gen. ArthrobacterGen. BrevibacteriumGen. MicrobacteriumGen. PropionibacteriumGen. Bifidobacterium

Bastoncelli Gram + irregolari non sporigeniFam. Micobacteriaceae Gen. Mycobacterium

I microrganismi gram – di maggior interesse alimentare sono inclusi nelle seguenti famiglie:

Fam. Pseudomodaceae Gen. PseudomonasGen. XantomonasGen. AcetobacterGen. Gluconobacter

Gen. Flavobacterium Gen. AlteromonasGen. Alcaligenes

Gen. Brucella Gen. Chromobacterium

Gen. Moraxella Gen. Acinetobacter

Fam. Neisseriaceae

Fam. Vibrionaceae Gen. AeromonasGen. Vibrio

Fam. Spirillaceae Gen. Campylobacter

Fam. Enterobacteriaceae Gen. EscherichiaGen. EnterobacterGen. HafniaGen. CitrobacterGen. KlebsiellaGen. ErwiniaGen. SerratiaGen. Edwarsiella

Poiché fermentano il lattosio vengono chiamati coliformi

Gen. Salmonella Gen. ShigellaGen. ProteusGen. ProvidenciaGen. Yersinia

Non fermentano il lattosio

Lamponi del Guatemala Cyclospora cayetanensis

Uova – latte – gelati Salmonella tiphimurium

Uova di pollo Salmonella enteritidis

Uova cotte all’ostrica Salmonella enteritidis

Hamburgers Escherichia coli 0157:H7

Pollame – latte – acqua Campylobacter jejuni

Fragole Epatite A

Latte di cocco della Thailandia Vibrio colerae

Coliformi totali

Gruppo eterogeneo di cui fanno parte diversi gewneri quali:

Arizona, citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella; in grado di fermentare il lattosio a 35 – 37°C.

Non tutti i generi hanno habitat intestinale

Coliformi termotolleranti

Vi appartengono quei coliformi (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter) in grado di fermentare il lattosio a 44°C. Non tutti i generi hanno habitat intestinale

Escherichia coli

Specie in grado di fermentare il lattosio a 44°C e di produrre indolo in acqua peptonata. Habita intestinale.

Enterococchi

Hanno habitat fondamentalmente intestinale ma possono moltiplicarsi al di fuori di questo ambiente, sono più resistenti ai trattamenti di bonifica degli alimenti. Importanti nel controllo delle acque particolarmente quelle destinate alla molluschicoltura.

Clostridi solfito-riduttori

Germi sporigeni le cui spore possono ritrovarsi anche nell’ambiente esterno e sono resistenti ai trattamenti in grado di distruggere la maggior parte dei patogeni.

Escherichia coli

Bacillo Gram (-) asporigeno appartenente alle Enterobacteriacee. Fa parte della normale fora intestinale. Alcune specie possono essere patogene per la produzione di tossine. È considerato indicatore di contaminazione fecale.

PARAMETRI MICROBIOLOGICI

Streptococchi fecali

Cocchi Gram (+) con tendenza a disporsi a catena; aerobi anaerobi facoltativi del genere Enterococcus. Si trovano nel tratto gastrointestinale di animali a sangue caldo. Sono considerati indicatori di contaminazione.


Conta totale a 37°CConta totale a 37°C

Tutti i batteri in grado di svilupparsi a 37°C. Sono importanti in quanto appartengono per lo più a germi della flora fecale umana o animale.


bastoncelli Gram (-) aerobi oanaerobi facoltativi, appartengono alla famiglia delle Enterobacteriacee. Batteri lattosio fermentanti con produzione di gas. Presenti nel materiale fecale di origine umana (108 UFC/g). Sono considerati indicatori di contaminazione in atto. Devono risultare assenti in 100 ml di acqua

bastoncelli Gram (-) aerobi o anaerobi facoltativi, appartengono alla famiglia delle Enterobacteriacee. Batteri lattosio fermentanti con produzione di gas. Presenti nel materiale fecale di origine umana (109 UFC/g), colonizzano il suolo,aria acqua, vegetazione. Sono considerati indicatori di contaminazione in atto. Devono risultare assenti in 100 ml di acqua

cocchi Gram (+) con tendenza a disporsi a catena aerobi anaerobi facoltativi del genere Enterococcus. Si trovano nel tratto gastrointestinale di animali a sangue caldo. Devono risultare assenti in 100 ml di acqua

Gli streptococchi fecali si moltiplicano raramente nelle acque inquinate e sono più persistenti di E. coli e dei batteri coliformi. Il loro valore primario per l’esame della qualità dell’acqua è perciò quello di indicatori aggiuntivi. Inoltre gli streptococchi sono altamente resistenti all’essiccamento e possono essere utili per il rilevare la contaminazione di acque sotterranee o superficiali causata dal dilavamento del suolo.

Sono organismi anaerobi e sporigeni, il più caratteristico dei quali C. perfrigens è normalmemte presente nelle feci, sebbene in numeri molto minori di E. coli. Tuttavia i clostridi non hanno esclusivamente una origine fecale e possono derivare da altre fonti ambientali. Le spore dei clostridi possono sopravvivere in acqua molto più a lungo degli organismi del gruppo dei coliformi e inoltre resistono alla disinfezione. a causa della loro longevità, trovano il loro impiego migliore come indicatori di contaminazione intermittente o remota. Poiché tendo a sopravvivere e ad accumularsi, possono essere rilevabili per lungo tempo dopo la contaminazione e in punti distanti dalla fonte contaminante.

E’ un’ospite normale dell’organismo umano di cui rappresenta la specie predominante nella popolazione batterica residente nell’intestino.

Si ritrova nelle acque di scarico, negli effluenti trattati e nei suoli sottoposti a contaminazioni fecali recenti, dovuti all’uomo, agli animali da allevamento e selvatici, agli uccelli. La sua presenza nell’acqua può essere considerata indizio sicuro di contaminazione fecale. E’ l’agente eziologico più frequente ed importante di infezioni delle vie urinarie e alcuni stipiti sono agenti eziologici di enteriti

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