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Modello classico ad onda sinusoidale La radiazione elettromagnetica è composta da onde elettromagnetiche, consistenti, cioè, nell'oscillazione concertata di un campo elettrico e di un campo magnetico. Queste onde si propagano in direzione ortogonale a quella di oscillazione Radiazione Elettromagnetica

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Modello classico ad onda sinusoidale

La radiazione elettromagnetica è composta da onde elettromagnetiche,

consistenti, cioè, nell'oscillazione concertata di

un campo elettrico e di un campo magnetico. Queste

onde si propagano in direzione ortogonale a quella di

oscillazione

Radiazione Elettromagnetica

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Luce emessa da una lampadina

Luce monocromatica

Laser

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PolarizzazionePolarizzazione

Rispetto a un'onda acustica o a un'onda marina, l'onda elettromagnetica presenta un'ulteriore caratteristica:

la polarizzazione.

Il vettore campo elettrico (così come il vettore campo magnetico) di un'onda oscilla sempre nella stessa

direzione.

Il piano individuato dalla direzione di oscillazione del campo elettrico e dalla direzione di propagazione dell’onda è il suo piano di polarizzazione.

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PolarizzazionePolarizzazione

•Il vettore campo elettrico E mantiene costante la sua direzione(perpendicolare alla direzione di propagazione).

•L’ampiezza del vettore E varia in modo sinusoidale (nel tempoe lungo la direzione di propagazione).

Convenzionalmente la direzione del vettore E è rappresentata con un segmento con doppia freccia

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Le sorgenti più comuni (sole, lampadine) emettono onde in cui il piano di polarizzazione è orientato in modo casuale attorno alla direzione di propagazione: la radiazione è non polarizzata.

Radiazione non polarizzataRadiazione non polarizzata

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Se tutte le onde che costituiscono la radiazione hanno la stessa direzione di oscillazione del campo elettrico (stesso piano di polarizzazione), la radiazione è polarizzata linearmente.

Polarizzazione LinearePolarizzazione Lineare

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Polarizzazione LinearePolarizzazione Lineare

Polarizzazione lineare lungo l’asse y

In queste e nelle successive animazioni viene mostrato il solo campo elettrico; il campo magnetico è perpendicolare a quello elettrico e alla direzione di propagazione dell’onda

Polarizzazione lineare lungo l’asse x

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La radiazione non polarizzata può essere resa polarizzata facendola passare attraverso un polarizzatore che lascia passare solo le componenti del campo elettrico che sono parallele all’asse del polarizzatore

PolarizzatorePolarizzatore

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PolarizzatorePolarizzatore

Se la luce è polarizzata perpendicolarmente alla direzione della molecola,

essa viene totalmente trasmessa

Per qualsiasi altra direzione di polarizzazione

la luce è trasmessa, ma con intensità minore

rispetto alla luce incidente.

Se la luce è polarizzata parallelamente alla

direzione della molecola, essa viene totalmente

assorbita dalla molecola.

I filtri Polaroid sono materiali plastici

costituiti da molecole allungate, allineate

mediante stiramento

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PolarizzatorePolarizzatore

Sovrapponendo due filtri polarizzatori e facendoli

ruotare l'uno rispetto all'altro si osserva un

graduale oscuramento.

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una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA se è in grado di ruotare il piano della luce

polarizzata

affinché la sostanza sia otticamente attiva, le sue molecole devono presentare una asimmetria nella loro struttura, tale da ruotare il piano di polarizzazione della luce.

In particolare le sostanze otticamente attive sono connesse ad una determinata proprietà delle molecole: la chiralità

es. aminoacidi

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una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA se è in grado di ruotare il piano della luce

polarizzata

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Quando un fascio di luce monocromatica linearmente polarizzata attraversa un campione di sostanza chirale, il piano di polarizzazione della luce uscente dal campione forma un angolo con quello della radiazione incidente. Tale angolo, misurato in gradi, (positivo o negativo a seconda che la rotazione sia avvenuta in senso orario, a destra, o in senso antiorario, a sinistra, rispetto ad un osservatore verso cui si propaga l'onda) viene detto ROTAZIONE OTTICA. Esso dipende dallo spessore attraversato e dalla quantità di materia ivi contenuta.

polarimetro

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polarimetro

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polarimetro

La luce ordinaria (di solito una radiazione monocromatica del sodio) entra in un prisma polarizzante di Nicol (polarizzatore) e viene convertita in luce polarizzata, che passa attraverso un tubo contenente il campione per poi arrivare a un altro prisma di Nicol, detto analizzatore.

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polarimetro

All'interno del tubo portacampioni viene inserita una sostanza che può fare ruotare il piano della luce polarizzata ed essere quindi otticamente attiva(es. soluzione di acqua e zucchero, trementina, soluzioni di carboidrati, proteine e steroidi). Se la sostanza invece è otticamente inattiva (es. acqua, alcol), il piano della luce polarizzata resta invariato.

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polarimetro

Il prisma analizzatore può ruotare e quando è orientato a 90° rispetto al piano della luce polarizzata, la luce non passa e il campo visivo dell'osservatore risulterà nero. Con rotazioni intermedie tra 0° e 90° una certa frazione della luce sarà trasmessa sino all'occhio dell'osservatore e cioè quella frazione che corrisponde alla componente del vettore luminoso nel piano dell'analizzatore. Se il prisma analizzatore è orientato a 0° rispetto al piano della luce polarizzata si ha il massimo valore della luce trasmessa.

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λ= lunghezza d’onda (riga D del sodio, 598 nm)T = temperatura in °Cα= angolo di rotazione osservatac = concentrazione del campione in g/mL l= lunghezza della cella (dm)

Potere Rotatorio SpecificoPotere Rotatorio Specifico

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Potere Rotatorio SpecificoPotere Rotatorio Specifico

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Polarizzazione CircolarePolarizzazione Circolare

l’estremo del vettore E , in un dato punto, descrive nel tempo una

circonferenza.

Si distingue tra polarizzazione circolare destrorsa o sinistrorsa

a seconda che l’estremo del vettore E, visto da un

osservatore verso cui si propaga l’onda, descriva nel tempo unacirconferenza in senso orario o

antiorario

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Polarizzazione CircolarePolarizzazione Circolare

La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale intensità.

La combinazione delle due componenti circolarmente polarizzate in direzione opposta, quindi risulta in luce linearmente polarizzata che oscilla in un piano perpendicolare alla direzione di propagazione.

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Polarizzazione CircolarePolarizzazione Circolare

La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale intensità.

La combinazione delle due componenti circolarmente polarizzate in direzione opposta, quindi risulta in luce linearmente polarizzata che oscilla in un piano perpendicolare alla direzione di propagazione.

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Polarizzazione CircolarePolarizzazione Circolare

La luce linearmente polarizzata può essere considerata essere composta da luce circolarmente polarizzata a destra sovrapposta a luce circolarmente polarizzata a sinistra, entrambe con uguale intensità

Il vettore campo elettrico non cambia in modulo durante un periodo, ma varia in direzionevaria in direzione, sempre restando perpendicolare alla direzione di propagazione.

La sua proiezione su un piano perpendicolare alla direzione di propagazione è una circonferenza.

Nel tempo il vettore descrive perciò un'elica destrogira o levogira.

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La ROTAZIONE OTTICA deriva da una velocità diversa, e quindi da un indice di rifrazione diverso, per la propagazione di luce polarizzata circolarmente a sinistra e a destra (birifrangenza circolare).

nL≠ nR

una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA se interagisce in modo diverso con luce polarizzata

circolarmente a destra e a sinistra.

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La POLARIZZAZIONE CIRCOLAREderiva da un asssorbimento diverso, e quindi due coefficienti di assorbimento diversi per le due componenti di luce circolarmente polarizzata (a destra o a sinistra):

l'intensità di una delle due componeneti viene ridotta maggiormente rispetto all'altra.

una sostanza risulta OTTICAMENTE ATTIVA se interagisce in modo diverso con luce polarizzata

circolarmente a destra e a sinistra.

L ≠R

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Polarizzazione CircolarePolarizzazione Circolare

L ≠R

l’estremo del vettore E, in un dato punto, descrive nel tempo una ellisse

anche in questo caso si distingue tra polarizzazione ellittica destrorsa o sinistrorsa a seconda che l’estremo del vettore

E, visto da un osservatore verso cui si propaga l’onda, descriva nel tempo una circonferenza in senso orario o

antiorario

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Polarizzazione CircolarePolarizzazione Circolare

All’ingresso del mezzo

All’uscita del mezzo

L’animazione che segue mostra cosa accade ad un’onda polarizzata linearmente (celeste) quando attraversa un mezzo (ipotetico) che non assorbe affatto la componente circolare sinistra (in rosso), ma assorbe molto la componente destra (in verde)

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PolarizzazionePolarizzazione

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La radiazione monocromatica viene polarizzata linearmente e passa poi attraverso un modulatore fotoelastico che genera alternativamente luce polarizzata circolarmente a sinistra e a destra con una certa frequenza di modulazione.

La radiazione così modulata passa attraverso il campione e rivelata dal fotomoltiplicatore. Il segnale risultante, anch’esso modulato alla stessa frequenza, fornisce la differenza di assorbanza delle due componenti polarizzate differenza di assorbanza delle due componenti polarizzate circolarmente, a quella lunghezza d’ondacircolarmente, a quella lunghezza d’onda. Variando la lunghezza d’onda si ottiene lo spettro CD.

Spettropolarimetro CDSpettropolarimetro CD

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Il dicroismo circolare ha luogo solo nelle regioni dello spettro in cui il campione assorbe

La birifrangenza circolare ha luogo in tutte le regioni di lunghezze d’onda di una sostanza otticamente attiva.

Le regioni di frequenze esplorate per CD possono essere diverse, tuttavia il caso più comune è quello dell’UV–visibile (transizioni elettroniche).

Uno spettro CD, come quello di assorbimento isotropo, risulta costituito quindi da bande. Una banda CD, ben separata dalle altre, assomiglia strettamente alla corrispondente banda isotropa, ma, diversamente da questa, poiché si tratta di una differenza di assorbimento, può essere sia positiva sia negativa (a seconda che L sia maggiore o minore di R).

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• Folding/unfolding di proteine• Ligand binding (costanti di legame)• Variazioni strutturali indotte per es da pH,

solvente, temperatura• Aspetti strutturali di acidi nucleici,polisaccaridi,

ormoni, peptidi• Termodinamica degli acidi nucleici

Applicazioni CD in biologiaApplicazioni CD in biologia

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I cromofori responsabili dell’assorbimento nel vicino UV

sono le basi puriniche e pirimidiniche.

Le basi stesse sono intrinsecamente simmetriche,

e quindi otticamente inattive.

Nei nucleotidi, tuttavia, esse acquisiscono una assimmetria configurazionale indotta dagli zuccheri chirali ribosio e desossiribosio, a cui sono legate, che rende le bande dicroiche.

CD di acidi nucleiciCD di acidi nucleici

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DNA: una banda positiva a circa 275 nm e una negativa a 240 nm. Le bande sono molto più intense di quelle della miscela di monomeri alla stessa composizione.

RNA: una banda positiva a circa 260 nm ed una banda negativa a 210 nm.

Si può osservare nettamente che il contributo fondamentale, in entrambi i polimeri, è dovuto principalmente dalla struttura secondaria,

che determina interazioni particolari tra i cromofori.

Gli spettri CD sono quindi un metodo molto sensibile alla struttura secondaria di queste macromolecole, e alle sue variazioni con solvente, temperatura, forza ionica, …

CD di acidi nucleiciCD di acidi nucleici

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Lo scheletro lineare del DNA si avvolge su se stesso per formare una struttura elicoidale destrorsa o sinistrorsa.

Si distinguono, essenzialmente, due forme di DNA destrorso, denominate forma

A e forma B, e una forma sinistrorsa, detta Z

Le maggiori differenze consistono nella geometria dei legami, nel numero di basi necessarie per un giro d’elica, per l’angolo di inclinazione di zuccheri e basi rispetto all’asse.

CD di acidi nucleiciCD di acidi nucleici

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La forma Z del DNA invece, ha avvolgimento sinistrorso dovuto a una diversa disposizione relativa di zucchero e basi azotate nello spazio: la struttura che la caratterizza ha un aspetto esteriore ben diverso dalle eliche destrorse poichè l’ossatura fosforo-zucchero si snoda a zig-zag lungo l’asse principale e proprio per tale motivo viene denominata Z.

La forma B `e quella maggiormente favorita in condizioni di alta umidità relativa (maggiore del 75%), e quindi la forma predominante in soluzioni acquose.

La forma A invece si presenta come un filamento corto e spesso con diametro di 25.5 ˚A, in cui le basi sono inclinate di circa 19o rispetto all’asse principale e giacciono su un piano ruotato di circa 30o rispetto al piano ortogonale all’asse stesso.

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forma A (- - -) : una banda positiva a 270 nm, più intensa delle forme precedenti, accoppiata ad una banda negativa a 210 nm e a quella positiva, estremamente intensa, a 185 nm.

A

forma Z (-) (elica sinistrorsa): una banda negativa a 290 e una positiva a 260 (cioè un doppietto di segno opposto a quello della forma B), una banda negativa a 195 nm ed una ancora più intensa positiva a 180 nm. La proposta originaria è stata poi dimostrata dall’analisi strutturale ai raggi i X.

Z

forma B (…) : un doppietto positivo – negativo a circa 280 e 240 nm e una intensa banda positiva a 190 nm.

B

CD di acidi nucleiciCD di acidi nucleici

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CD di acidi nucleici:CD di acidi nucleici:interazione con piccole molecoleinterazione con piccole molecole

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CD di ProteineCD di Proteine

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CD di ProteineCD di Proteine(ca 200-250 nm)(ca 200-250 nm)

Gli aminoacidi sono asimmetrici e sono sempre otticamente attivi

Questa regione è dominata

dall’assorbimento del legame

petidico

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CD di ProteineCD di Proteine(ca 200-250 nm)(ca 200-250 nm)

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CD di ProteineCD di Proteine(ca 200-250 nm)(ca 200-250 nm)

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Lo spettro CD nel lontano UV è anche sensibile a piccole modificazioni della struttura terziaria dovute ed interazioni proteina-proteina.

CD di ProteineCD di Proteine(UV lontano)(UV lontano)

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CD di Proteine: CD di Proteine:

determinazione della struttura secondaria di una proteina

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CD di Proteine: CD di Proteine: Studio della denaturazioneStudio della denaturazione

determinazione della struttura secondaria di una proteina

processi dinamici es folding

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CD di Proteine: CD di Proteine: Studio della denaturazioneStudio della denaturazione

determinazione della struttura secondaria di una proteina

processi dinamici es folding

Studiare effetto di ligandi sulla struttura secondaria di una proteina

Analizzare interazioni proteina-proteina o proteina-acidi nucleici

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RiassumendoRiassumendoDa un’analisi CD possiamo ottenere informazioni sulla struttura tridimensionale di macromolecole otticamente attive come DNA e

proteine.

Per farlo si utilizza lo spettropolarimetro, uno strumento in grado di misurare l'ellitticità generata da un campione al variare della lunghezza d'onda del raggio incidente (siamo nel campo degli UV), ottenendo così lo spettro CD di quel campione.

• Ogni struttura secondaria delle proteine ha un suo spettro caratteristico dovuto alla disposizione spaziale dei legami peptidici. Confrontando questi spettri con quello di una proteina qualsiasi è possibile ricavare il tipo di strutture secondarie di quella proteina e in che misura sono presenti.

•Con la spettroscopia di dicroismo circolare non possiamo sapere quali sono, ad esempio, gli aminoacidi coinvolti in tali strutture (per queste informazioni bisogna ricorrere alla più complessa spettroscopia NMR (o EPR) e alla cristallografia con i raggi X) però permette in modo rapido di ottenere informazioni come la stabilità della struttura di una proteina al variare della temperatura o dell'intorno chimico in cui si trova.