MIDOLLO ADULTO dei MAMMIFERI

COMPRENDE

Cellula Staminale Ematopoietica

Cellula Staminale Mesenchimale

IL MIDOLLO OSSEOIL MIDOLLO OSSEO

Ematopoiesi

Ininterotta formazione di elementi giovani del sangue a partire da cellule staminali totipotenti: origine a tutte le linee emopoietiche

Organi emopoietici: forniscono il microambiente necessario per la proliferazione e il differenziamento verso le varie linee cellulari

Organi emopoietici

Organi mieloidi: midollo osseo

Organi linfoidi: timo e midollo osseo

Organi linfoidi secondari o periferici: linfonodi, tonsille palatine, placche di Peyer,tessuto linfoide diffuso, milza

Principi che giustificano l’utilizzo dei saggi funzionali su Cellule Ematopoietiche

•Il Sistema Ematopoietico rappresenta un continuum di cellule che progressivamente manifestano differenti caratteristiche biologiche: … da cellula staminale a … vari tipi cellulari differenziati;

•Variazioni biologiche rilevate nei vari compartimenti “maturanti” non riflettono quelle che si attuano nel compartimento staminale;

•I vari compartimenti ematopoietici sono controllati da differenti fattori che variano indipendentemente l’uno dall’altro.

IDENTIFICATION OF HEMATOPOIETIC STEM/PROGENITOR CELLS: STRENGTH AND DRAWBACKS OF FUNCTIONAL ASSAYS. Oncogene, 2004, 23, 7210-7222

•Standardizzazione dei primi saggi funzionali;

•Rivelazione dei concetti che definiscono la biologia della cellula staminale ematopoietica;

•Possibile estensione degli stessi concetti alla comprensione dei meccanismi biologici che regolano la sopravvivenza e proliferazione della cellula staminale tumorale nonché delle cellule staminali non-ematopoietiche.

Wu et al, 1967; Iscove et al., 1971; Metcalf et al. 1975.

Short-term in vitro Assays

• I prototipi dei saggi funzionali a breve termine sono rappresentati dai saggi a colonie;

• La sospensione cellulare viene quindi piastrata in terreno semisolido rappresentato da metilcellulosa oppure da agar.

COLONIA

… la progenie che deriva da una singola cellula costituisce

• Diversa composizione;

• Diversa grandezza;

• Diverso colore.

Ogni colonia rappresenta un continuum di progenitori “lineage committed”.

SAGGI A COLONIE

…dopo circa 3 Settimane cioè a 5-10 Divisioni

Nell’ambito di un data linea cellulare,

i progenitori con differenti livelli di maturità possono essere riconosciuti

in base a:

• Sensibilità di risposta ai fattori di crescita;

• Tempo necessario per generare una progenie di cellule differenziate;

• La grandezza e la particolare morfologia delle colonie.

… Sensibilità, Tempo e Grandezza …

Questi tre parametri sono stati utilizzati per l’ottenimento di

mature CFU-E Colony-forming Unit Erythroid da

immature Burst-forming Unit Erythroid

Il progenitore T linfoide migra nell’abbozzo del timo, ed in questa sede progressivamente si differenzia nei vari tipi di linfociti attraverso un processo che è caratterizzato da eventi molecolari specifici, e che è sotto controllo del microambiente timico.

Il progenitore mieloide invece differenzia progressivamente nelle diverse linee ematopoietiche caratterizzate , da un punto di vista sperimentale, in base alla capacità di formare colonie (CFU, Colony Forming Units) o “burst” (Burst Forming Unit) in mezzo semisolido sotto lo stimolo di fattori di crescita ematopoietici specifici, denominati “Colony Stimulating Factors” (CFS) e interleuchine, che sono rilasciati fisiologicamente da vari tipi cellulari ( cellule staminali del midollo, monociti-macrofagi, linfociti T e NK).

Cellule progenitrici della serie eritroide (BFU-E e CFU-E) progenitori iniziali e più differenziati rispettivamente

Cellule progenitrici della serie granulo-macrofagica (CFU-GM, CFU-G e CFU-M)

Cellule progenitrici della serie megacariocitaria (BFU-MK, CFU-MK)

L’interleuchina 3 (IL-3) ed il granulocyte/macrophage colony stimulating factor (GM-CSF): inducono la differenziazione dei progenitori iniziali (BFU-E e CFU-GM)

L’eritropoietina, l’interleuchina 5 (IL-5), il GM-CSF ed il macrophage colony stimulating factor (M-CSF): agiscono essenzialmente sulla proliferazione e\o differenziazione dei progenitori più avanzati (CFU-E, CFU-G, CFU-M, rispettivamente) e sull’attivazione delle cellule terminali mature.

1. LA PROLIFERAZIONE CELLULARE

La proliferazione cellulare è misurata attraverso il numero di cellule

prodotte.

2. POTENZIALE DIFFERENZIATIVO.

Il potenziale differenziativo è stimato attraverso il numero di differenti linee cellulari rappresentate nella

progenie prodotta.

Tutti i Saggi Funzionali misurano

2 Parametri:

1. LA PROLIFERAZIONE CELLULARE;

2. POTENZIALE DIFFERENZIATIVO.

Limite dei Saggi a Colonie a Breve Termine

Non risultano adeguati nel rilevamento di

progenitori più immaturi

•Inadeguatezza dei mezzi semisolidi utilizzati;

•L’efficacia di un mezzo semisolido non supera le tre settimane e tutto questo conduce

All’impossibilità di identificare una

Stem Cell molto immatura.

… Una Stem Cell molto immatura necessita di un periodo superiore a 3 - 5 settimane affinchè possa garantire una progenie di cellule differenziate.

Michael Dexter, 1977

Long - Term Culture

Presenza di un feeder layer costituito da cellule che da un lato fungono da substrato e dall’altro provvedono a secernere fattori di crescita nel tentativo di ricostituire

il microambiente ematopoietico

Feeder Layer

•Cellule normali aderenti midollari allogeniche, espanse per 4 settimane e successivamente irradiate;

•Linee cellulari continue murine derivate dallo stroma midollare.

Linee Cellulari Continue Murine

•Le più note sono MS5, S17, AFT024 ed M210B4;

•Esse hanno il pregio di essere più facilmente gestibili rispetto alle cellule stromali fresche allogeniche;

•L’ottenimento del loro numero è ILLIMITATO;

• Supportano egualmente bene sia la differenziazione mieloide che quella linfoide a partire da progenitori lineage-committed.

UNITA’ EMATONE

STROMA+

CELLULE EMATOPOIETICHE+

CELLULE NON-EMATOPOIETICHE (Cellule Mesenchimali)

L’Unità Ematone è quindi una delle strutture funzionali elementari rappresentata da un aspirato midollare che è indispensabile per la comprensione dei meccanismi biologici che regolano in vivo la Cavità della Cellula

Staminale ovvero Stem Cell Niche.

STROMA

Le cellule stromali nel loro insieme sono costituite da adipociti, cellule endoteliali, macrofagi e fibroblasti.

Trends in Biotechnology, 2003

•IL6

•G-CSF

•GM-CSF

•M-CSF

•SCF

•Flk-2

VCAM-1 ICAM-1

E-selectin

P-selectin

CD105 endoglin

VEGF2R

Molecole di Adesione, Fattori di crescita e…

VLA-4

•VEGF2-R = Recettore per Vascular Endothelial Growth Factor 2;

•CD105 = Recettore per il Transforming Growth Factor;

•VCAM-1= Vascular Cell Adhesion Molecule-1;

•ICAM-1= Intercellular Adhesion Molecule-1;

•SCF= Stem Cell Factor;

•VLA-4= Very Late Antigen di tipo IV.

Macrofago

•GM-CSF

•G-CSF

•M-CSF

•IL6

•IL1

•TNF-a

•TGF-

Concetto di Nicchia

•Stabile Microambiente per la cellula staminale;•La nicchia è costituita da cellule e componente extracellulare che può ospitare una o più cellule staminali e controllarne l’autorinnovamento nonchè la produzione di progenie;•La matrice extracellulare insieme alle molecole di adesione definiscono i confini spaziali della nicchia e modulano l’espressione di molecole di adesione nonchè quelle deputate al signalling.

Concetto di Nicchia

La scelta di una cellula staminale se rimanere nel suo stato

di quiescenza o dividersi guidata dal microambiente.

-Angiopoietin-1 (Ang-1): il fattore secreto dagli osteoblasti e il suo recettore (Tie2) hanno grande importanza per il contatto delle HSC alle cellule della nicchia mantenendole in uno stato di quiescenza

-p21: controlla il numero delle cellule staminali, mantenendo la popolazione staminale in uno stato di quiescenza

-p27: controlla la proliferazione dei precursori ematopoietici e il loro pool all’interno dell’organismo

-Growth factor independent 1 (Gfi-1): regola la proliferazione delle cellule T

Stem cells find their niche

ALLAN SPRADLING, DANIELA DRUMMOND-BARBOSA & TOSHIE KAI

Nature, 2001

Figure 1 Niche structure. Niche cells (green) underlying a basement membrane signal to stem cells (red) to block differentiation and regulate division. When a lineage mechanism prevails (lower mitotic cell), the stem cell divides such that one daughter retains its connections to the niche, while the other (yellow) becomes untethered and begins to differentiate. When a population mechanism prevails (upper mitotic cell), stem cell division may be either symmetric (shown) or asymmetric (not shown), as determined by local factors. ECM, extracellular matrix.

Figure 1 Birth control for stem cells. The niche that regulates the birth and differentiation of blood-forming (haematopoietic) stem cells is formed of osteoblasts (a type of bone-marrow cell) that line the inner surface of bone. Zhang et al.7 showed that depleting osteoblasts of a receptor for bone morphogenetic protein (BMP) caused a doubling in both the osteoblast population and the stem-cell population. Calvi et al.8 found a parallel expansion of the stem-cell population when they increased the numbers of osteoblasts by using parathyroid hormone (PTH).

Lemischka et al. Nature 425: 778, 2003

Colture a Lungo TermineIdentificano:

•LTC-IC;•CAFC;

•Extended LTC-IC ovvero ELTC-IC.

LTC-IC

La “Long-Term Culture Initiating Cell” identifica un tipo cellulare che è in grado, quando coltivata su un supporto costituito dallo stroma, di dare origine a cellule figlie

identificabili mediante l’applicazione di saggi a colonie.

La LTC-IC rappresenta, quindi, la primitiva cellula ematopoietica che è in grado di sostenere la produzione di tutte le linee

cellulari ematopoietiche per l’intera vita di un individuo.

CAFC

La “cobblestone area-forming cell” identifica un tipo cellulare che si integra

nello strato aderente stromale.

La colonia cellulare è costituita, pertanto, da cellule appiattite,

otticamente dense e strettamente associate alle cellule aderenti.

Cobblestone Area. La CA è composta da cellule scure, angolari, associate ad una cellula adiposa (F). Si osservano cellule in sospensione (S), brillanti, ed un macrofago (M).

Patricia Denning-Kendall et al, Stem Cells, 2003

Extended LTC-IC ovvero ELTC-IC

L’Extended LTC-IC probabilmente identifica un tipo cellulare la cui

longevità è strettamente associata a quella attesa per una vera e propria

cellula staminale.

ELTC-IC si ottiene estendendo il saggio LTC-IC ad un periodo superiore a 12

settimane.

Identificazione di Precursori Linfoidi B

I precursori ad habitus B sono stati necessariamente assegnati in coltura

liquida su feeder stromale murino utilizzando

“Murine Dexter-type long-term bone marrow cultures”.

Linee cellulari continue stromali murine utilizzate: Sys-1, S17, MS-5 ed AFT024.

… Perché è stato necessario utilizzare questa tecnica?

•La discriminazione morfologica di colonie B da colonie non-B non è accurata;

•La caratterizzazione immunofenotipica su colonie direttamente prelevate da metilcellulosa non è indicata;

•E’ essenziale l’utilizzo di basse concentrazioni di siero;

•Le citochine prodotte da granulociti e macrofagi inibiscono la differenziazione di progenitori B (Interferon- ed IL-6).

Identificazione e Quantizzazione di Precursori Linfoidi T

SISTEMI UTILIZZATI

•Coltura di timo fetale (FTOC, fetal thymus organ culture);

•Coltura di riaggregati e monolayer di cellule stromali timiche;

•Coltura della linea cellulare continua murina stromale, OP9 che esprime il ligando Notch Delta-1.

Da notare che:

•La trasduzione del segnale via Notch-ligand è determinante per il differenziamento T;

•In questi tipi di sistemi è stato ottenuto il differenziamento CD4 a partire da 100 staminali cordonali CD34+.

H. Spits. Development of T cell in the human thymus. Nature Reviews Immunology, 2002.

Immunofenotipo delle HSCs

CD34: HSCs e precursori ematopoieticiCellule in divisione: CD34+ CD38-

Cellule quiescenti: CD34- CD38+

CD201: espresso anche nelle endoteliali, coinvolto nella coagulazione del sangue e nei processi infiammatori

CD133: HSCs e precursori ematopoieticiCD45, CD43, Flt3….

SIMPLIFIED SCHEME OF STEM CELL DIFFERENTIATION

hematopoietic stem cell myeloid blast

CD34

CD90

CD133

CD117

VEGFR

CD105

ALDH

ABCG2

erythroid

CDCP1

ABCB1

CD318

Homing delle Cellule Staminali Ematopoietiche

Con il termine Homing si definisce quel processo biologico che conduce le cellule staminali ematopoietiche trapiantate a raggiungere la loro cavità, ovvero “nicchia” nel midollo osseo.

Le varie fasi di Homing di una cellula staminale ematopoietica prevedono:

1.Rolling sulle cellule endoteliali attraverso il legame con E e P-Selectine;

2.Adesione attraverso VCAM-1 espresso dalle stesse cellule endoteliali;

3.Migrazione trans-endoteliale via VLA-4/VCAM-1 come anche via VLA-4 e VLA-5/Fibronectina.

Fasi di Homing

Perché è importante aumentare l’efficienza di Homing?

•Perché soltanto il circa 5% di progenitori umani CD34+ raggiunge la nicchia midollare dell’ospite!

•La percentuale è leggermente variabile e correla con lo stato del ciclo cellulare delle cellule primitive trapiantate;

Christopherson et al, Science 2004

Modulation of Hematopoietic Stem cells Homing and Engrafment by CD26

Uno dei protagonisti che limita fortemente l’Homing e quindi l’attecchimento dei progenitori primitivi ematopoietici è la molecola CD26.

CD26 è una DPPIV/Dipeptidilpeptidasi IV che ha la funzione di rimuovere dipeptidi dalla estremità aminoterminale delle proteine.

CXCR4

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1SD

F-1

SDF-

1 SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1:-)

Le cellule stromali producono SDF-1 che attrae le cellule positive per CXCR4.

SDF-

1

Sette domini transmembrana

NH2

HOOC

Struttura generale dei recettori per

chemochineCXCR4

1 2 3 4 5 6 7

CD26

CXCR4

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1SD

F-1

SDF-

1 SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1

SDF-

1:-( CD26 cliva SDF-1 bloccando

il meccanismo chemiotattico

SDF-

1

CD26

CXCR4

:-)

AMD3100

Diprotin-A

“Mobilizzatore”

“Esaltatore di Homing”