Micotossineaspetti introduttivi

A. A. RicelliRicelli, A.A. Fabbri, , A.A. Fabbri, M. Reverberi, S. M. Reverberi, S. ZjalicZjalic, C. Fanelli, C. Fanelli

• La crescita di microfunghi (muffe) provoca diverse alterazioni del

substrato

Nelle derrate alimentari:odori sgradevoli causati da diversi enzimi quali lipasi, proteasi ecc., alterazione del

colore, produzione di tossine

• Una delle più importanti alterazioni èla formazione di MICOTOSSINE

• Alcune specie fungine contaminano le derrate in campo, altre durante lo stoccaggio

Funghi di campo

Fusarium culmorumF. graminearumF. avenaceum

Alternaria alternataA.infectoria

Cladosporium herbarumClaviceps purpurea

Funghi di stoccaggio

P. cyclopiumP.freii

P. hordeiiP. polonicum

P. verrucosumP. aurantiogriseum

P. viridicatumAspergillus flavus,

A.parasiticusEurotium sp.

A. parasiticusA. parasiticus A. carbonariusA. carbonariusPenicilliumPenicilliumverrucosumverrucosum

A. ochraceusA. ochraceusP. expansumP. expansum

MicotossineMicotossine

• Metaboliti secondari prodotti da alcuni generi fungini (Aspergillus, Penicillium,

Fusarium per es.) tossici in basse concentrazioni per i vertebrati

(Samson, 1996)

• Il ruolo ecologico di molte di esse èancora poco chiaro

• Le micotossine possono avere un effetto dannoso a breve e/o a lungo termine sulle strutture cellulari e quindi sugli organi e

sugli apparati

• Tra gli effetti tossici più importanti figurano: l’induzione di alcuni tipi di tumore, l’indebolimento del sistema

immunitario

• Si calcola che il 40% dei decessi nei paesi in via di sviluppo può essere collegato al

consumo di derrate contaminate da micotossine

• Una derrata può essere contaminata da più specie fungine con presenza simultanea di diverse micotossine

• L’effetto cumulativo può essere diverso da quello osservato per ciascuna tossina singolarmente

Alcune micotossine possono essere prodotte da specie diverse appartenenti allo stesso genere:

AFLATOSSINE Aspergillus flavus, A. parasiticus

OCRATOSSINA A Aspergillus ochraceus, A. carbonariusPenicillium verrucosum

P. griseofulvum

PATULINA

GRISEOFULVINAACIDO CICLOPIAZONICO

ROQUEFORTINA C

Una singola specie fungina può produrre diverse micotossine

Altre vengono prodotte da funghi appartenenti a diversi generi

• Le micotossine sintetizzate dai funghi tossigeni vengono normalmente

rilasciate all’esterno del micelio fungino e si ritrovano nell’alimento contaminato

• A causa della loro persistenza queste possono diffondersi

indipendentemente dall’organismo fungino che le ha sintetizzate

Persistenza

Dopo essere state sintetizzate, le micotossine normalmente rimangono

nella derrata anche durante l’immagazzinamento e il processing

Piante o loro prodotti (semi)

Ci sono diversi punti critici per l’ingresso di infezioni fungine e quindi per una possibile contaminazione da

micotossine in una catena alimentare tipo:

Infezione funginaSintesi di micotossine

Consumo da parte dell’uomo e degli

animali

Micotossicosiprimarie

Consumo da parte di animali allevati

Presenza nei tessuti

Prodotti carnei

Consumo da parte dell’uomo

Secrezione con il latte

Formaggi

Micotossicosisecondarie

• Nelle matrici liquide la diffusione di micotossine è veloce e non lascia

nessuna parte della derrata incontaminata

• Nelle matrici solide la diffusione è piùlenta e non omogenea: “contaminazione a spot”

Contaminazione non omogenea

• Il campionamento offre particolari difficoltà

Distribuzione non omogenea Distribuzione omogenea

Principali micotossine presenti negli alimentiPrincipali micotossine presenti negli alimenti

OO

CH3

CH3

CH2

O

O

O

H

HO H

DONDON

OO

CH3

CH3

CH2

O

O OCO

CH3CO

CH3

OCO

H

TT--22

O

CH3O

O

O

O

H

H

ZEAZEA

O

OHO O

CH3

H

HH

NC

COO H

HCH2

ClOTAOTAO O

O

O

O

OCH3

AFB1AFB1

OO

O

OO OCH3

OH

AFM1AFM1

CH3CH3

O

O

O

O

O

OO O

O

O

O

OH OH

OH

OH

OH

OHH

NH2

FB1FB1

Inquinamento da aflatossineInquinamento da aflatossine

• Problema mondiale, contaminazione in campo e/o nel post raccolta

• Presente in molte derrate alimentari (semi oleosi, mais, frutta secca, caffè)

e mangimi

• Negli ultimi 40 anni sono stati effettuati numerosi studi sulla

sintesi di aflatossine

• Oggi si conosce l’intero clustergenico che presiede la loro sintesi, anche se la regolazione della sua

espressione non è stata completamente compresa

• Dopo l’ingestione, viene attivata dal citocromo P450 formando un epossido in

grado di legarsi alle basi puriniche, inducendo in questo modo genotossicità e

citotossicità

• Cancerogeno per gli animali e l’uomo, organo target: fegato

O O

O

O

O

OCH3

AFB1AFB1

OcratossinaOcratossina AA

• Prodotta da alcune specie di Aspergillus e Penicillium

• Rilevata in semi di mais, orzo, grano, in diversi paesi Europei e in USA

• Rilevata anche nella birra e nel vino• La crescita di Aspergillus tossigeni sembra

legata alle condizioni di alta umidità e temperatura

• Alcune specie di Penicillium si sviluppano però anche a basse temperature (5 °C)

Inibitore competitivo della sintesi proteica attraverso la soppressione

della fenilalanina RNA sintetasi

Incrementa la perossidazione lipidica.Nefrotossico, incluso nella lista di

composti potenzialmente cancerogeni

ZearalenoneZearalenone

• Metabolita secondario prodotto da diverse specie di Fusarium

• Contaminante di vari cereali in particolare mais

Zearalenone

• Micoestrogenocapace di legare i

recettori cellulari in luogo dell’estrogeno provocando così una sintomatologia tipica

negli animali da allevamento

(sterilità e ridotta produzione di latte)

FumonisineFumonisine

• Prodotte da diverse specie di Fusarium

• La Fumonisina B1 è la più frequente e la più tossica

• Possono causare la leukoencephalomalacia (gravi danni

cerebrali) nei cavalli

Queste molecole inibiscono la sintesi degli sfingolipidi attraverso l’inibizione dell’enzima

ceramide sintetasi. Questa attività porta all’accumulo di alcuni precursori tossici degli

sfingolipidi: le sfinganine. Le Fumonisinepossono inoltre indurre perossidazione lipidica

e alterazioni nel DNA

TricoteceniTricoteceni

• Gruppo di composti chimici correlato, prodotto da alcuni Fusarium spp,

Cephalosporium spp e Trichoderma spp

• Inibitori della sintesi proteica

• La più diffusa, e meno tossica, è la vomitossina (DON)

• La tossina T-2 considerata responsabile di Aleukiaalimentare che in Russia tra il 1942 e 1947 provocò la morte di 100.000 persone

• Malattia caratterizzata da macchie sulla pelle, emorragie interne multiple, consumo di midollo osseo

PatulinaPatulina

• Prodotta da alcune specie di Aspergillus e Penicillium che crescono sui frutti e si ritrovano nei succhi di frutta (in particolare succo di mela)

• Ha proprietà antibiotiche

PatulinaPatulina

• Causa emorragie cerebrali, gastriche

e polmonari

• Sospetto cancerogeno

Produzione di aflatossine da parte di

A. parasiticus su sementi

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

afla

toss

ine

(g/k

g)

15 30 45giorni

granomaisarachidigirasole

Incubazione a 28Incubazione a 28°°CC

Limiti di legge per la presenza di alcune micotossine negli alimenti

AFLATOSSINE(Commission regulation n° 2174 12 Dec. 2003)

Cereali e loro prodotti destinati al consumo umano: 2 µg/Kg (Solo B1); 4 µg/Kg (B1+B2+G1+G2).

Arachidi: 2 µg/Kg (Solo B1); 4 µg/Kg (B1+B2+G1+G2) se destinate al consumo umano diretto.

Mais da sottoporsi a cernita o altro trattamento fisico prima del consumo umano diretto o del suo utilizzo come ingrediente: 5 µg/Kg (Solo B1); 10 µg/Kg (B1+B2+G1+G2).

Spezie (peperoncino, pepe, paprika) 5 µg/Kg (B1);10 µg/Kg (B1+B2+G1+G2).

OCRATOSSINA ACommission regulation n° 123 26 Jan 2005

Cereali grezzi: 5 µg/Kg.Vino, prodotti derivati e succo d’uva: 2µg/KgCaffè: 5 µg/Kg; Caffè solubile: 10 µg/Kg; Prodotti per l’infanzia: 0.5 µg/Kg

PATULINACommission regulation n° 1425 11 Aug. 2003

Succo di frutta 50µg/Kg;Prodotti per l’infanzia a base di mele: 10µg/Kg

DEOSSINIVALENOLO

Commission regulation n° 856 6 June 2005

Grano duro e avena non trasformati: 1750 µg/Kg;Pasta secca: 750 µg/Kg; Pane e paste secche o biscotti: 500 µg/Kg.

ZEARALENONE

Cereali grezzi diversi dal mais: 100 µg/Kg;Pane, biscotti e cereali da colazione: 50 µg/Kg;Prodotti per l’infanzia a base di cereali: 20 µg/Kg.

Rilevamento della contaminazione

Profilo dei metaboliti secondariProfilo degli

IsoenzimiDNA fingerprinting

Morfologia

funginafungina da da micotossinemicotossine

A

B

C

fronte del solvente

TLC

HPLC

ELISA

TLCTLC

A

B

C

fronte del solvente

Corsa cromatografica con opportuna fase mobile

La freccia indica la direzione di flusso della fase mobile

Cromatografia su strato sottile (TLC)

Cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC)

Schema del sistema HPLC

Pompa

Sistema di iniezione

Colonna

Detector (rivelatore)

Data system

costituito da:

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Principio dell’ ELISA competitiva (CD-ELISA)

1

2

3

1. Anticorpi (monoclonali o policlonali) adsorbiti sulla superficie del pozzetto

2. Aggiunta del coniugato antigene-enzima e competizione con l’antigene in soluzione (campione reale)

3. Risultato della reazione di competizione

• Particolare tecnologia (electronic nose) che utilizza i composti odorosi e volatili prodotti dai funghi come indicatori del

biodeterioramento dei materiali

La tecnologia dei sensori

• Il naso elettronico è stato giàmesso a punto per l’analisi della qualità dei cereali stoccati e di processi industriali in campo

alimentare (vino, latte)

• sviluppo di un sistema di rilevamento della crescita di funghi tale da

individuare le infezioni molto prima che l’olfatto umano percepisca il

caratteristico odore di muffa

Scopo:Scopo:

Smart Glass

150 µm

1 mm

1 mm

1 µm

Gel di silice

VETRO

VETROTCO

a-Si:H fotodiodoMetallo

campione

RADIAZIONE UV

Deposizione: 2 µl di solvente contenente il campione

Array di sensori in silicio amorfo idrogenato (a:Si-H)

integrato con una lastrina cromatografica

Camera cromatografica

• Costruita in TEFLON• Sviluppo orizzontale

Array di sensori con contatti elettrici

Connessioni

Controllo della produzione di Controllo della produzione di micotossinemicotossine

Prevenzione

•Tecniche di breeding•Uso di composti di sintesi•Buone pratiche

agronomiche

Detossificazione

• Metodi fisici• Metodi chimici• Uso di sostanze

adsorbenti

Principali linee di ricerca

• Aflatossine -Aspergillus parasiticus, A. flavus

• Ruolo dello stress ossidativo (ROS) nel differenziamento e nella sintesi di aflatossine

• Controllo della produzione di aflatossine da parte di antiossidanti di diverso tipo e attraverso alcuni metaboliti prodotti da basidiomiceti eduli con proprietà medicinali

Lo stress ossidativo stimola la produzione di aflatossine nei funghi tossigeni

• La biosintesi delle aflatossine è indotta da epossidi, aldeidi, chetoni, ergosterolo perossidato, tetracloruro

di carbonio e altri alogenometani

• I lipoperossidi prodotti da mais in risposta all’infezione con A. flavus e A. parasiticus stimolano

la produzione di aflatossine

• Diversi antiossidanti ne bloccano la sintesi in vitro e in vivo

Basidiomiceti e farmacologia

• In oriente la medicina tradizionale utilizza sia funghi basidiomiceti che piante medicinali

• Quasi ad ogni specie è stato attribuito qualche potere curativo

• Dal 1960 anche la scienza ufficiale effettua ricerche in questo settore

• Individuati molti composti con azione farmacologica, spesso antiossidante

• Tra i composti maggiormente studiati polisaccaridi polisaccaridi e glicoproteineglicoproteine

• Documentate proprietà antivirali e anticancerogene, stimolazione del sistema

immunitario in animali e uomo

• Proteggono le cellule del sangue dalle conseguenze dello stress ossidativo

• Possono prevenire i danni da aflatossicosi

Trametes versicolor Lentinula edodes

Composti attivi:

Lentinano–β1-4 glucomannano

Ep3–piccola molecola di lignina

(stimola il sistema immunitario)

Tioprolina–aminoacido (antiossidante)

Composti attivi:

PSK – glicoproteina (antiossidante, stimola il sistema immunitario, antivirale)

PSP – glicoproteina (antitumorale, stimola il sistema immunitario)

Effetto dei filtrati colturali (2%) di L. edodes e T. versicolor sulla produzione di aflatossine

da parte di A.parasiticus

Lentinula edodes

020406080

100120

cont CF 21 CF 23 CF 42 CF 43

% a

flato

ssin

e

3 g6 g9 g

Trametes versicolor

020406080

100120

cont CF 74 SMR117

CF 227 CF 261

% a

flato

ssin

e

Ocratossina A (OTA)Aspergillus ochraceus, A. carbonarius,

Penicillium verrucosum

• Correlazione tra la produzione di questi metaboliti e lo status perossidativocellulare.

• Studio della possibilità di utilizzo di un sensore al silicio amorfo per l’analisi di OTA in diverse matrici complesse di tipo alimentare

Composto fenolico “food grade”dotato di proprietà antiossidanti e

antimicrobiche. Contrasta le reazionia catena che portano alla

propagazione della cascata radicalicae quindi alla diffusione dei fenomeni

perossidativi.

Butil idrossianisolo (BHA)

Composto polifenolico con attività antiossidante sintetizzato da diverse specie di piante (Vitis vinifera,

Polygonum cuspidatum)Fitoalessina

Inibitore della lipossigenasi e della cicloossigenasiAgente chelante degli ioni Cu++

Scavenger di radicali liberiUtilizzato in campo medico per le sue proprietà di

antiaggregante piastrinico, antiossidante e antinfiammatoria

Resveratrolo

BHA e resveratrolo inibiscono la produzione di OTA in cereali

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0,95 0,85 0,95 0,85 0,95 0,85 0,95 0,85 0,95 0,85

Ctr BHA 0.02% Resv 230 Resv 23 ppm Lf 4%

Erg

ppm

0

5

10

15

20

25

30

35

OTA

ppb

ErgOTA

Patulina-Penicillium expansum

• Isolamento di microorganismi capaci di crescere in presenza di questa micotossina

• Ricerca di microorganismi capaci di controllare la contaminazione fungina e da patulina

Discosphaerina fagi99,5CBS 171.93AY016359593L5

Candida sake99,5CBS 5740AY536216581L4

Rhodotorulaglutinis100,0ATCC 32765

AF335985591L3

Debaryomyceshansenii100,0CBS 9683

AJ716108587L2

Pichia nakasei99,8NRRL Y-7686U75728586L1

NomeSimilarità(%)b

Ceppo piùsimilea

Lunghezza della

sequenza (bp)

Ceppo

aATCC: American Type Culture Collection, USA; NRRL: Agricultural Research Service Culture Collection, USA; CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Netherlands. Cifra sottolineata: numero di accesso a GenBank per il ceppo indicato.bPercentuale di nucleotidi simili delle sequenze nel dominio D1/D2 tra gli isolati e un ceppo in GeneBank.

Identificazione dei lieviti isolati da melaPCR dominio D1/D2 del 26S rDNA - Kurtzman e Robnett (1998)

Trasformazione e degradazione della patulina da parte di C. sake isolato da mele con sintomi di marciume.Prova effettuata in succo di mela commerciale.

0

5

10

15

C. sake (L4) Bianco

mg/

L

PatAscl

Controllo

Una alimentazione sana Una alimentazione sana èèindispensabile per il indispensabile per il

mantenimento della salute. mantenimento della salute. LL’’informazione e la informazione e la

consapevolezza aiutano a consapevolezza aiutano a realizzarlarealizzarla