METODI DI ANALISI DEL COMPORTAMENTO NELLE NEUROSCIENZE

La valutazione delle prestazioni sensomotorie è importante nella valutazione del comportamento animale,

così come la misurazione degli effetti delle manipolazioni sperimentali su tali capacità, hanno larghe

implicazioni nelle neuroscienze. Questo è il motivo per il quale gli esperimenti comportamentali misurano in

primis le risposte motorie alle informazioni sensoriali. Se una lesione o una manipolazione genetica

indebolisce la prestazione su un test di memoria spaziale, come nel labirinto radiale (radial maze), questo

deficit non può essere interpretato come prova di disfunzione cognitiva, a meno che, non sia stato prima

attribuito ad un deficit sensomotorio.

Saranno presentati di seguito, una serie di compiti per testare la performance sensomotoria nei roditori.

Il riflesso da spavento (acoustic starttle) è una risposta automatica ad uno stimolo improvviso ed intenso,

sperimentalmente valutato in una varietà di specie di topi, ratti, gatti, scimmie ed esseri umani. Nei roditori,

l’acoustic startle è tipicamente evocato da stimoli acustici o tattili ed è caratterizzato da contrazioni dei

maggiori muscoli del corpo. Gli studi di mapping hanno dimostrato che il riflesso da spavento acustico è

mediato da uno specifico pathway neurale in cui le informazioni acustiche entrano nel SNC attraverso il

nervo uditivo, inviano input al nucleo cocleare, che proietta al nucleo reticolare pontino attraverso il

lemnisco laterale. Gli output motori sono generati nel nucleo reticolare pontino, che proietta sulla colonna

vertebrale attraverso il tratto di reticolospinale. Sebbene il pathway del riflesso appaia abbastanza semplice,

il riflesso è soggetto alle influenze della modulazione di ulteriori centri del cervello. Per esempio, la

presentazione di un’intensità più bassa di stimoli acustici, subito prima dello stimolo acustico, attenua la

risposta di spavento. Questo fenomeno, chiamato prepulse inhibition (PPI), è influenzato dai centri anteriori

del cervello (corteccia frontale). In particolare, il fenomeno della PPI consiste nell’innata soppressione del

riflesso da spavento quando lo stimolo che scatena lo spavento è preceduto immediatamente prima (30–500

ms) da un debole stimolo acustico. La PPI del riflesso da spavento corrisponde alla capacità di inibire stimoli

esterni (uditivi, visivi, tattili) e interni (pensieri, impulsi). Negli ultimi anni, la PPI è stata oggetto d’interesse

relativamente a un vasto numero di disturbi psichiatrici per i quali sono compromesse le funzioni sensoriali e

cognitive. I deficit nella PPI sono caratterizzati da una perdita della funzione di filtro sensoriale-motorio

attraverso il quale le informazioni irrilevanti sono selezionate o scartate. Deficit nella PPI osservati negli

schizofrenici si pensa riflettano i deficit legati al disturbo nel filtro sensomotorio e la misura di PPI nei

roditori è stata proposta come un modello di questa caratteristica della schizofrenia

Ogni dispositivo è tipicamente incluso in un più grande

scompartimento insonorizzato che isola l'animale dalla presenza di

un rumore di fondo, ma anche per proteggerlo dallo stesso stimolo

acustico. Nella parte superiore di questa camera insonorizzata c’è

un altoparlante (fonte acustica) che produce uno spettro intero di

rumore bianco, regolato da un computer per durata e decibel. Per i

topi, viene montato un tubo chiaro di plastica (5,0 cm nel diametro

da 12,8 cm lungo) su una base rigida di plastica sulla quale è attaccato un dispositivo elettrico che rileva sia

l'accelerazione sia il movimento dell'animale. Il segnale dal dispositivo elettrico, è inviato ad un computer

per la conversione digitale. Per i topi, il dispositivo dovrebbe

essere regolato alla massima sensibilità.

Poiché la risposta da spavento avviene tipicamente entro 100 ms

dalla presentazione dello stimolo, sono inclusi soltanto i

movimenti generati entro 100 ms dello stimolo. Nei topi, già gli

stimoli di 90 dB o più alti, produrranno risposte di spavento,

sebbene esista una variabilità nelle risposte. Le intensità degli

stimoli acustici non dovrebbero essere più alte di 120 dB, per

evitare di produrre danni all'orecchio dell’animale e agli altoparlanti. Si usano generalmente topi maschi CD-

1, ma possono essere usate anche altre razze, che rivelano delle differenze nelle risposte. L’illustrazione

mostra i risultati di tre diversi ceppi DBA-2, C57/BL6 e CD-1.

Fig. Confronto delle risposte allo stimolo acustico di 3 diversi ceppi di topi C57-BL, Cd-1; DBA all’intensità di 120 db. Viene

mostrata un amedia in un’unità assolutamente arbitraria.

Protocolli specifici: Acoustic startle

Prima dell'inizio della sessione, è necessario dare ai topi 5 minuti di tempo per l’adattamento al dispositivo,

nel quale è presente un rumore di fondo (65 dB) che si percepisce durante tutta la durata del test. Per la

valutazione di un semplice acoustic startle, si usano 2 o 3 intensità diverse (90 e 105 dB o 90, 105, e 120

dB). Gli stimoli, della durata di 40 ms, sono presentati in un ordine quasi casuale, tale da avere lo stesso

numero di presentazioni per ogni stimolo senza che la medesima intensità sia presentata più di due volte in

successione. Il tempo medio che intercorre tra gli stimoli è di 15 sec. Un'alternativa alla valutazione

dell’intensità dell’acoustic startle è misurare la soglia dello spavento. In questo protocollo, è usata una

gamma più ampia d’intensità di stimolo, per esempio, da 70 a 120 dB. Gli stimoli sono presentati in ordine

randomizzato e viene presa in considerazione l’intensità minima che produce risposta. Poiché può esserci

assuefazione delle risposte, sia entro una sessione sia tra le sessioni, le prove di ogni intensità dovrebbero

essere sempre distribuite uniformemente entro la sessione.

L'assuefazione allo spavento è una misura che riguarda il gating delle informazioni sensoriali. E’ interessante

nell'area di ricerca della schizofrenia poiché, come già descritto in questa patologia, sembra essere indebolita

tale assuefazione, un deficit che potrebbe essere correlato ad una condizione di ipervigilanza. Per

l'assuefazione allo spavento, viene usata solo un'intensità di stimolo, ripetutamente presentata usando un

intervallo fisso o variabile. Le risposte declinano normalmente (abituazione) su ogni prova. Un esempio è

mostrato nella figura di seguito. In questo caso, i topi sono stati esposti ad unico stimolo di 120 db di 40 ms

presentato ogni 15 s per 50 minuti (200 prove). L'assuefazione a lungo termine dell’acoustic startle può

essere anche usata come un indice di memoria attraverso la conduzione di una seconda sessione (per

esempio, 24 h dopo) e valutare le ritenzione a lungo termine dell’assuefazione.

Fig. Confronto delle risposte da spavento di 3 diversi ceppi di topi CD-1; DBA-1, DBA-2 durante la ripetuta esposizione ad uno

stimolo acustico d’intensità pari a 120 db. Anche qui è mostrta ala media ogni dieci blocchi ed è visibile l’abtuazione allo stimolo.

Prepulse inhibition (PPI)

In questa versione del test, è valutata l'attenuazione prodotta da uno stimolo di bassa intensità presentato

poco prima dello stimolo di spavento. Il PPI viene valutato nel giorno seguente il test dell’acoustic startle.

Questo serve ad abituare gli animali alle procedure di trattamento basilari e ad eliminare gli animali che si

spaventano eccessivamente o quelli che non rispondono (quindi fuori dalla baseline). La sessione di PPI

comincia con tre scoppi a 120 dB di 40 ms (non sono inclusi nell'analisi), seguita dalle presentazioni su tre

tipi di prova: 120 dB per 40 sec per un solo stimolo acustico, uno stimolo a 120 dB preceduto dagli stimoli di

PPI in livelli compresi tra 5 e 15 dB al di sopra del rumore di fondo (cioè, da 70 a 80 dB per il 65 dB del

rumore di fondo) e prestimolazioni singole (che non dovrebbero produrre una risposta di spavento cfr fig

20); è spesso utile includere più di un livello di intensità e anche un trial "senza stimolo" per valutare

l'influenza del rumore di fondo sulle misure dello spavento.

Funzione motoria ed esplorazione spontanea

Sebbene molti sperimentatori giudichino l'attività di locomozione come una misura eccessivamente

semplicistica, le alterazioni di questo comportamento possono rivelare delle informazioni importanti sui

meccanismi potenziali di azione delle droghe. Allo stesso modo, modelli di lesione al cervello, impiegati da

molti ricercatori, possono produrre alterazioni limitate o pronunciate nel comportamento motorio. Gli

animali geneticamente modificati sono usati nella ricerca dei geni correlati all’apprendimento e alla

memoria. La locomozione ed il comportamento esplorativo potrebbero essere anche influenzati da altri

fattori, come il momento della giornata (i roditori sono degli animali notturni e sono quindi

considerevolmente più attivi durante i periodi di oscurità), l'ansietà (gli animali potrebbero essere più o meno

attivi in base alla situazione alla quale vengono esposti), lo stato di insonnia o l'arousal (gli stimolanti

tenderanno ad aumentare l'attività, mentre i sedativi tenderanno a diminuire l'attività, sebbene, l'importanza

di questi effetti possano dipendere spesso dalla razza dell’animale), la novità ambientale (i topi tendono ad

esibire un comportamento esplorativo maggiore quando esposti ad un ambiente nuovo e un’attività diminuita

sulla re-esposizione allo stesso ambiente, cioè, l'assuefazione), la motivazione (i topi deprivati di cibo

potrebbero mostrare attività aumentata), l'età (i giovani roditori sono più attivi rispetto a quelli anziani), la

salute generale e la derivazione genetica. Comunque, esistono variazioni naturali nei livelli di attività spesso

anche tra topi della stessa razza, malgrado il controllo dei fattori sopra descritti.

Esplorazione spontanea

Il metodo più semplice ed economico per valutare sia

l'esplorazione sia l’attività di locomozione è il sistema del

campo aperto. Consiste in un’arena quadrata (o circolare), circondata da mura, per evitare che l'animale

fugga, di misure standard (per esempio, 100 cm per 100 cm o 100 cm di diametro). Il pavimento è diviso in

regioni uguali con un pennarello che è stato fatto asciugare precedentemente per non produrre effetti olfattivi

superflui e distraenti. La scatola potrebbe essere di legno o plastica.

a. Protocollo tipico

Il campo aperto dovrebbe essere localizzato in una stanza tranquilla con un’illuminazione soffusa per

ridurre l'ansietà a meno che, questa, non sia il costrutto che si desidera studiare. L'osservatore

dovrebbe essere posto a una certa distanza dal dispositivo, guardando il tutto attraverso un monitor.

Se si vuol misurare l’azione stimolante di una droga, il roditore prima dovrebbe essere abituato al

dispositivo per 3 o 5 sessioni per ridurre l'attività. Non bisogna farlo abituare se si studia come

risposta l’ansia ad un nuovo ambiente. Per lo studio di lesioni al cervello, si potrebbero esaminare le

prestazioni nei tempi di risposta, prima e dopo l’intervento chirurgico.

Lo sperimentatore registra, in seguito, i comportamenti specifici usando delle schede tecniche

appropriate sulla base del tempo prestabilito (5 a 10 minuti). I parametri da registrare sono: la

locomozione (numero dei quadranti attraversati entro un tempo stabilito), i comportamenti

stereotipati (come leccare, mordere, muovere la testa,"thigmotaxis" ossia, tempo speso vicino alle

pareti, frequenza e durata di "rearing" cioè quando l’animale che si solleva sulle zampe posteriori ed

infine il "grooming" che consiste nello strofinamento del corpo con le zampe o strofinamento delle

zampe sulla testa). Queste attività potrebbero essere separatamente registrate per le regioni periferice

o per il centro dell'arena e l’ultima cosa su cui riflettere è il grado di ansietà esperita dal roditore (

animali con più alti livelli di attività al centro dell'arena sono meno ansiosi).

L'attività di Locomozione può essere anche indice di apprendimento, memoria e ansietà. L'assuefazione

all’attività di locomozione in un ambiente nuovo può essere usata per valutare la memoria nei topi. In questa

procedura, il topo è brevemente esposto (5 minuti) ad un campo aperto nuovo e viene valutata l'attività di

locomozione. La memoria per la nuova esperienza è poi testata esponendo il topo, in un momento

successivo, allo stesso campo aperto. L'attività durante la seconda esposizione è usata come indice per

valutare la memoria, attività più scarsa è indicativa di una migliore memoria per il campo aperto. Il modello

di esplorazione può essere anche un indice importante di ansietà. Una valutazione piuttosto superficiale

dell’ansietà può essere ricavata paragonando il tempo trascorso nella periferia dell'arena con quello trascorso

al centro della stessa. Gli animali ansiosi tendono a trascorrere più tempo nella periferia. In più, l'iniziale

blocco, da parte dell’animale, in un campo aperto è un indice di ansietà, dunque la latenza del movimento

verso una distanza data (o muoversi attraverso un numero dato di quadrati) può essere anche usata per

valutare la paura e l'ansietà. Una valutazione più formale dell’ansietà può essere fatta usando un campo

aperto diviso in due: un'area ben illuminata ed un'area scura (zona sicura per l’animale) e viene confrontato il

tempo relativo all'attività in queste due zone. Un ansiolitico

aumenterà il tempo speso nella zona più illuminata.

Funzione motoria

Uno dei più comuni metodi per la misurazione della capacità di un

roditore di mantenere l'equilibrio e tenere il passo attraverso un’asta

ruotante è rappresentato dal RotaRod e viene usato per valutare la

funzione motoria. Il test richiede che il topo cammini su un’asta

ruotante di diametro standard (3,5 cm) che aumenta la velocità dopo

un periodo determinato, finché l’animale non riesce più a mantenere

la sua posizione cadendo dall’asta. La latenza nel cadere dall’asta

ruotante è considerata come una misura della funzione motoria.

Alcuni sperimentatori modificano l’asta

stessa includendo una serie di sbarre

d’acciaio inossidabile con un diametro

specifico. In questo caso, viene registrata

come misura motoria, il tempo impiegato

per cadere e l’aderenza nel fare due

rotazioni piene.

Beam balance walking

Mentre il RotaRod è utile per determinare i deficit motori

grossolani ed evidenti nel roditore, per una valutazione della

coordinazione motoria, si può utilizzare una trave sulla quale far

camminare il topo, il cui test esamina essenzialmente la capacità

dell'animale di rimanere eretto e camminare su un’asta elevata e

abbastanza stretta senza cadere sulle imbottiture sottostanti. I

modelli con lesioni al cervello unilaterali tendono a indurre un

effetto di emiparesi che può fare scivolare il roditore da un lato, di solito controlaterale al locus della

lesione. Al termine della trave c’è un piattaforma poco più larga o una casupola scura “sicura” per

permettere al topo di riposarsi tra una prova e l’altra. E’ necessario collocare l'animale alla fine della trave

(il posto più lontano dalla piattaforma). Gli animali dei ceppi più attivi cammineranno per istinto lungo

l’asta, così da raggiungere il lato opposto. Si deve contare il numero di falli con le zampe, definiti come il

numero di volte in cui le zampe anteriori o posteriori scivolano dalla superficie orizzontale della trave, su

un numero predeterminato di passi (50 solitamente).

Compito spaziale di navigazione (Morris Water Maze)

Sin dagli inizi del 20° secolo, la memoria spaziale e

l’apprendimento son stati oggetto di valutazione da

parte dei neuro scienziati. Il compito del water maze,

ideato principalmente per misurare l’apprendimento

spaziale e la memoria, è diventato utile per valutare gli

effetti dell’invecchiamento, di lesioni sperimentali e

gli effetti della droga, soprattutto nei roditori. Per

quasi due decenni il Water Maze di Morris (MWM)

è stato il compito maggiormente usato ed approvato

dagli psicologi comportamentali e dai farmacologi,

esso impiega una varietà di processi mnemonici sofisticati. Questi processi

riguardano l'acquisizione e la localizzazione spaziale di cues visivi che

vengono successivamente elaborati, consolidati, trattenuti e poi ricuperati, con

lo scopo di nuotare fino alla localizzazione di una piattaforma nascosta per

fuggire all'acqua. I processi generali implicati nella navigazione visuospaziale

dei topi sono gli stessi processi cognitivi utilizzati dagli esseri umani, infatti,

diverse prove confermano l'utilità del modello per lo studio sulle malattie neurodegenerative come

l'Alzheimer (AD) e il Morbo di Parkinson (PD). Nel MWM si mette in evidenza: (1) L'integrità funzionale

dei sistemi colinergici nella corteccia anteriore, indispensabili per avere una prestazione efficiente nel

MWM, che invece, appaiono seriamente compromessi nei pazienti che soffrono di AD. Questa

compromissione risulta in correlazione col grado di demenza ed è anche in molti pazienti PD che soffrono di

un declino cognitivo legato ai nuclei ippocampali. Altri dati rivelano quanto l’ippocampo sia una struttura

essenziale per l’apprendimento spaziale e risulti atrofizzato nei pazienti con AD. Il MWM consiste in una

larga piscina circolare di acqua (per esempio, diametro: 180 cm, l'altezza: 76 cm) a temperatura ambiente (o

poco più) con una piattaforma nascosta appena sotto la superficie dell’acqua (~ 1 cm). La piattaforma è resa

invisibile attraverso uno di questi mezzi: aggiunta di un agente (cioè, latte in polvere) così da rendere l'acqua

opaca; utilizzando una piattaforma in plexiglas chiara nell'acqua limpida; oppure, usando una piattaforma

dipinta dello stesso colore del muro della piscina e del pavimento. I topi sono testati individualmente e

collocati nei vari quadranti della piscina; si registra il tempo trascorso e/o la distanza attraversata per

raggiungere la piattaforma nascosta. E’ necessario riempire la piscina a una profondità di 35 cm di acqua

(mantenuta a 25 ± 1.0°C). La piattaforma dovrebbe essere sommersa fino ad 1,0 cm sotto la superficie

dell'acqua e collocata al centro del quadrante nord-est. La piscina dovrebbe essere localizzata in una grande

stanza con un numero di cues visibili (riflessi luminosi) di immagini geometriche (quadrati, triangoli, cerchi

o anche semplicemente quadri, ecc.) sul muro, ma con il resto della stanza scura per nascondere lo

sperimentatore. L'attività di nuoto di ogni topo può essere monitorata attraverso una telecamera che registra

dall’alto. Dopo ripetute entrate nel labirinto, i topi diventano progressivamente più efficienti e rapidi nel

localizzare la piattaforma.

Nel test della piattaforma nascosta ogni topo

viene sottoposto a quattro prove giornaliere

per quattro giorni consecutivi. Ogni giorno,

la prova inizia collocando il topo nell'acqua

frontalmente al muro della piscina in uno dei

quattro quadranti. L'ordine quotidiano di

entrata nei singoli quadranti è randomizzato in modo tale che tutti e 4 quadranti siano usati una volta ogni

giorno. E’ importante non collocare il topo nei quadranti adiacenti in maniera consecutiva poiché il topo

potrebbe adottare delle strategie di posizione o altre non-mnemoniche (per esempio, tutti i giri a destra) per

localizzare la piattaforma. Inoltre, l'ordine dovrebbe essere cambiato ogni giorno successivo. Per ogni prova,

al topo è consentito nuotare per un massimo di 90 sec. Quando riesce a trovare la piattaforma, gli viene dato

un periodo di riposo di 30 sec sulla stessa. Se fallisce entro il periodo assegnato, al topo verrà attribuito un

punteggio e poi, dopo i 90 sec, sarà collocato sulla piattaforma per 30 sec di riposo. In ogni caso, gli viene

dato subito il trial successivo (ITI = 30 sec). In alcuni casi, il topo

potrebbe cadere o saltare via dalla piattaforma e riprendere il nuoto,

prima che trascorrano i 30 sec d’intervallo. Quando accade ciò, il

cronometro dovrebbe essere subito fermato, il topo recuperato e

collocato sulla piattaforma fino allo scadere dei 30 sec d’intervallo.

Il quinto giorno può essere soministrato il Test di trasferimento

(probe trials), composto di due trials in cui la piattaforma viene tolta

dalla piscina per misurare il pregiudizio o la distorsione (bias)

spaziale, misurando il tempo che trascorre e la distanza percorsa in ciascuno dei quattro quadranti. Una

misura importante sarà la percentuale del tempo totale trascorso e la distanza percorsa dal topo all’interno del

quadrante target precedente, cioè quello entro cui aveva memorizzato e trovato precedentemente la

piattaforma. Naturalmente, sarà registrato il tempo trascorso nel quadrante target precedente.

Il test della piattaforma visibile potrebbe essere eseguito per

identificare se una droga o altre manipolazioni sperimentali

siano associati a cambiamenti evidenti o deficit nell'acuità

visiva. Un problema visivo dell’animale potrebbe

confondere le analisi dei dati, dato che la performance

dipende dall'uso di cues visivi durante il compito. Subito

dopo il test di trasferimento del quinto giorno, si colloca la

piattaforma nella piscina nel quadrante localizzato al lato

opposto rispetto alla posizione originale . Un coperchio o un

ulteriore supporto o rivestimento esterno viene poggiato sulla piattaforma rendendola così visibile

elevandone la superficie al di sopra del livello di acqua (a 1,5 cm). E’ importante abbassare l’illuminazione,

cosicchè i cues della stanza non siano più visibili. Per questa procedura non viene usato il video ma, solo un

cronometro. E’ necessario che il topo si abitui per un trial alla serie nuova di condizioni per localizzare la

piattaforma visibile, senza alcun limite temporale. Una volta trovata la piattaforma, gli si danno 30 sec sulla

piattaforma. Il topo, subito dopo, dovrebbe essere sottoposto ad una seconda prova simile e la latenza per

trovare la piattaforma sarà utilizzata come misura dell’acuità visiva. La posizione di piattaforma dovrebbe

essere cambiata in ogni prova successiva per assicurare che, la posizione visibile della piattaforma, sia

effettivamente individuabile da lontano ed il topo non faccia uso dei cues visivi fissi.

Dopo il completamento dei primi cinque giorni del test del water maze ed un periodo di riposo (almeno una

settimana), una seconda serie di prove potrebbe essere condotta come descritto sopra ( test della piattaforma

nascosta) senza però, che la posizione della piattaforma sia cambiata nei quadranti (relearning). Le

prestazioni quotidiane (la media di quattro prove al giorno per topo) potranno essere poi paragonate. Le

curve dell’apprendimento saranno generalmente più discendenti rispetto alla prima fase del test, poiché un

numero di fattori relativi alla posizione della piattaforma iniziale, saranno man mano appresi. Tra le

procedure alternative vi è il Test del richiamo della posizione (Place Recall Test). In questa procedura, i test

della piattaforma nascosta sono prima eseguiti come descritto sopra in animali sani, al fine di far ben

apprendere la posizione della piattaforma. Successivamente, i ratti vengono manipolati sperimentalmente (ed

es: vengono indotte delle lesioni, drogati o altre manipolazioni fisiologiche, ecc…) e poi vengono sottoposti

di nuovo ai test della piattaforma nascosta o al probe test. Così, possono essere studiati gli effetti delle

manipolazioni sperimentali su tutti i processi usati per risolvere i compiti ad accezione dell’apprendimento e

della memoria, come processi di memoria di ritrovamento, bias spaziali, effetti della manipolazione motoria,

sensoriale e motivazionale. Altre varianti si basano sulle Procedure di discriminazione della piattaforma.

Questi metodi richiedono ai ratti di discriminare tra due visibili piattaforme: una è rigida e capace di

sostenere il peso del ratto, mentre, l’altra piattaforma è fluttuante e non può sostenere il peso del ratto. Nella

versione non-spaziale del compito, i ratti imparano a discriminare visivamente tra due piattaforme differenti,

attraverso la forma, la luminosità, o pattern disegnati. Infine, le procedure di Working Memory nel MWM

includono un paradigma con 2 trials al giorno nel quale la piattaforma nascosta è localizzata in uno dei

quattro quadranti ed è poi riposizionata casualmente in ognuno dei giorni successivi del test. Ogni ratto

dovrebbe ottenere delle informazioni riguardanti la posizione della piattaforma durante il primo trial che

saranno utilizzate per identificare la sua posizione nel trial 2.

Il Water Maze di Morris (MWM), quindi, è un paradigma molto versatile che può essere usato per lo studio

dell’apprendimento spaziale e non spaziale (discriminazione) così come avviene nei processi di WM.

Infine, abbiamo il radial-arm maze, una versione più

complessa dell Y-maze discrimination, in cui l’animale

si trova dinanzi due strade da scegliere, in una delle quali

c’è una ricompensa di cibo. Ideato per la valutazione

dell’apprendimento spaziale e della memoria nei roditori

in radial arm è stato sviluppato originariamente per i

ratti, è stato usato, poi, anche per i topi ed altre razze. Il

radial-arm maze nella sua attuale configurazione fu

sviluppato da David Olton et coll. Tipologie simili di labirinto sono state utilizzate sin dalla prima metà del

ventesimo secolo; il più comune è quello ad 8 bracci. Il radial-arm maze trae vantaggio dalla naturale

tendenza, nei roditori, ad esplorare nuovi posti per fare rifornimento di cibo. Essi memorizzano velocemente

il labirinto mostrando livelli asintotici d’apprendimento con un’accurata performance, contrariamente a

quanto accade dopo l’assunzione di droghe, quando hanno lesioni o manipolazioni comportamentali indotte

per valutare le basi neurali delle funzioni cognitive. I ratti usano dei cues visivi esterni al labirinto per

navigare al suo interno. Aree del cervello come l’ippocampo e la corteccia frontale, così come il sistema di

trasmissione colinergico, sono implicate nella risoluzione del labirinto.

Il numero dei bracci del radial arm maze può variare infatti, labirinti più grandi, a 12 o a 17 bracci, vengono

utilizzati per fornire maggiori possibilità di testare sia la memoria di lavoro (WM) sia quella retrospettiva o

referente, proprio perché aumentano il carico cognitivo.

Il centro ottagonale dell’arena è di 50 cm di perimetro con 8

bracci estesi radialmente per 60 cm. Il cibo è localizzato nel

fondo di ogni braccio. Un cerchio posto al centro della

piattaforma, indica il punto di partenza per ogni sessione. Il

labirinto deve essere inserito all’interno di una stanza che

contiene molti cues visivi, normalmente fissi durante il test.

L’aggiunta di ulteriori bracci (ad es: 16) serve per

incrementare il carico cognitivo e per testare simultaneamente

la WM e la memoria a lungo termine.

Affinchè le procedure abbiano successo è importante che, sia i ratti sia i topi, si adattino alla presa e alle

mani dell’uomo, prima di cominciare il test per evitare che l’animale subisca stress e diventi aggressivo

complicando l’interpretazione dei risultati. Poiché, sia i ratti che i topi,

sono soliti correre all’interno del labirinto per cercare cibo, è importante

fornire loro ricompense di cibo (cereali, Kellogg’s, acqua o latte). Superata

la procedura di handling, si deve sistemare il ratto al centro dell’arena e

riempire le vaschette con il cibo. Poi bisogna registrare il tempo necessario

a mangiare tutto il rifornimento, più il tempo sufficiente per terminare tutta

la sessione (5 minuti per gli 8 bracci del labirinto). Si ripete giornalmente

la sessione fino a che il ratto si cibi di tutte le ricompense entro il tempo minimo, per poi cominciare

l’addestramento.

Il modo più comune di usare il radial maze consiste semplicemente nel rinforzare il ratto ad entrare in ogni

braccio. Prima di ogni sessione, tutti i bracci del labirinto sono forniti di 1/3 o ½ pezzi di barrette di cereali. I

rinforzi non vengono riposizionati durante la sessione. La sessione del labirinto comincia quando il ratto

viene posto al centro di un cerchio di plastica all’interno della piattaforma centrale. Dopo 10 secondi,

questo cerchio viene rimosso ed il ratto può cominciare liberamente ad esplorare il labirinto. La scelta del

braccio viene registrata quando il ratto è arrivato a toccare con le zampe oltre la metà della lunghezza dello

stesso. La sessione del test continua fino a che il ratto entra in tutti gli 8 bracci o al termine dei 5 minuti

prestabiliti. E’ necessario ripetere l’addestramento dalle 3 alle 5 volte a settimana. Ratti e topi hanno bisogno

dalle 18 alle 24 sessioni per completare le fasi dell’addestramento ed entrare in un periodo stabile di

performance, durante il quale gli effetti della memoria potranno essere testati.

Il labirinto può essere usato anche per distinguere la memoria di lavoro, definita la memoria che elabora in

simultanea cambiamenti del contenuto nei bracci, come opposta alla memoria referente o a lungo termine,

ossia quella che ci permette di contenere dei concetti prefissati. La procedura consiste nel togliere da alcuni

bracci il cibo. L’entrata in questi bracci dovrebbe rappresentare un errore registrato in memoria (referente),

poiché il loro stato di deprivazione del cibo non è stato modificato. Il compito consiste nel cercare il cibo

negli altri bracci che sono stati, invece, forniti di cibo sin dall’inizio della sessione. Quando il ratto rientra in

questi bracci, è un errore di working memory, poiché sono stati in precedenza svuotati della ricompensa.

Sebbene, alcuni ricercatori testino i due tipi di memoria nel labirinto ad 8 bracci con 4 bracci pieni e 4 bracci

senza cibo, questo sembra abbassare la sensibilità del compito perché la ritenzione della memoria di 4

posizioni è abbastanza semplice. Quindi, spesso si è stabilisce di utilizzare un labirinto a 16 bracci, con 12

bracci pieni di ricompensa e 4 vuoti. Per l’apprendimento della discriminazione non spaziale, possono essere

usate differenti trame nel pavimento come stimoli critici per il ritrovamento della ricompensa nel radial

maze. Le ricompense possono essere poste nel braccio con trame particolari, ma non in altri. L’ubicazione

delle trame del pavimento deve cambiare in ogni sessione. Il metodo più comune per la misurazione è di

contare il totale degli errori nel completare il compito. In più, i ratti non sempre finiscono il labirinto nel

tempo stabilito. La misura della latenza è data dal rapporto tra la durata totale della sessione divisa il numero

delle entrate nei bracci (secondi X num entrate). Alla fine si effettua la media del numero delle sessioni in

cui i punteggi sono stati più accurati.