Metode de determinare a activității enzimatice Polarimetria · si de clivare The substrate...
Transcript of Metode de determinare a activității enzimatice Polarimetria · si de clivare The substrate...
Metode de determinare a activității enzimatice
http://www.medicilon.com/
Polarimetria
Hidroliza zaharozei folosind soluții de diluții 1:250, 1:500,
1:1000 de invertază din drojdieMcIntosh,. K.A. et al. (1998),
J. Pharm. Biomed. Anal., 17, 1037-1045
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
-D-glucoză + O2 acid D-gluconic + H2O2
Polarimetria
Determinarea activității glucoz-oxidazei
530 12,70
Ganapathy Subramanian, Chiral Separation Techniques: A Practical Approach, Wiley-VCH, 2007
Kim, E. et al., Optics Communications249(1–3), 2005, 351
Ganapathy Subramanian, Chiral Separation Techniques: A Practical Approach, Third EditionChapter 16 Polarimeter Chiral Detectors in Enantioseparations Wiley-VCH, 2007
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
Polarimetria
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
Metode electrochimice
Bisswanger, H. (2012) Practical Enzymology
Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany Ramsay, R. R. and Tipton, K. F. (2017)
Molecules, 2017, 22, 1192
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
Metode electrochimice
Matt,D.J.L., et al., Food Chemistry, 239, 15, 2018, Pages 268
https://slideplayer.com/slide/1391968/
Metode potențiometrice
NAD(P)+/NAD(P)H
FAD/FADH2
Fe2+/Fe3+(citocrom).
Detecția potențiometrică a pesticidelor organofosforiceZdrachek, E. and Baker, R., Anal CHem, 2019, 91, 2-26
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
Alte metode
Diferența dintre reactivitatea chimică (structurile)S/P
Stoparea reacției enzimatice
Cuantificare specifică – reacție (extracție selectivă?)
Detecție ușoară
T, pH, solv. Organic,SDS, inhibitori - ioni ai metalelor grele, EDTA
Metode discontinue: radiometrice, HPLC
Disfuncții ale intestinului pentru pacienți cu EED
https://www.pinterest.co.uk/pin/
Etichetarea radioactivă
Metodă discontinuă de măsurare a activității enzimatice (P pe filtru)
Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis,
Capitol 1, Willey & Sons (1998)
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
Etichetarea radioactivă
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
Etichetarea radioactivă
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
https://www.creative-enzymes.com/
Acil transferaze
https://www.promega.ro
https://www.hartmann-analytic.de/
Alte metode (HPLC)
Separarea substratului și produșilor unei reacții catalizate de adenozin kinaza
pe HPLC (fază inversă)Rossomando, E.(Ed) HPLC in Enzymatic Analysis,
Capitol 1, Willey & Sons (1998)
Monitorizarea activității enzimatice
Metode de determinare a activității enzimatice
Detecția 254 nm
Evaluarea calității preparatelor enzimatice
Parametri:
Activitatea
Puritatea
Stabilitatea
Modul de
preparare/împachetare
activitatea specifică
activitatea catalitică /conținut de proteină
totală.
U/mg sau U/g
Lipaza
Fractions
Total
activity
(U)
Total
protein
(mg)
Specific
activity
(U/mg)
Purification
fold
Yield
(%)
Crude 139.4 3.84 36.28 1 100
A.S.
fraction a
(35- 85%)
45.21 1.17 38.7 1.07 32.43
PEG
fraction b
(20%
w/w)
74.07 0.54 138.3 3.81 53.14
Monitorizarea activității enzimatice
Conținut de proteină totală
absorbție UV
metoda biuretului
metoda cu acid bicinconinic
metoda Lowry
legare de coloranți
(Coomassie Brilliant Blue G
250)
analiza Kjeldahl
Stabilizare enzime
Agenți stabilizare (soluție):
glicerină (50%)
sulfat de amoniu (3,2 M)
clorură de sodiu (3M)
liofilizare
+ alți stabilizatori
BSA
inulină
U/mg sau U/g
Monitorizarea activității enzimatice
Păstrarea
endonucleazelor temperaturi < -20 0C
Metalo-enzimele EDTA dezactivare
Enzimele cu -SH ioni ai metalelor grele dezactivare
Clasificarea enzimelor
Shewale – Enzyme everywere - 1996
Enzyme classification
Baze de date generale
Baze de date specifice
Baze de date pentru enzime
General databases
Database for special enzymes classes
Available enzyme databases
Enzyme Commission / International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB)
Comisia de Enzimologie /Uniunea Internațională de Biochimie și Biologie Moleculară (IUBMB)
http://www.enzyme-database.org/
Bazele de date generale
ExplorEnz
General enzyme databases
Bazele de date generale
General enzyme databases
Bazele de date generale
Raportare de enzime necatalogate → a sugereza modificări
Conținutul din ExplorEnz apare și pe pagina de web a IUBMB / secțiunea nomenclatura enzimelor
https://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
o rules for naming enzymes
o nomenclature of biochemical molecules
Bazele de date generale
UniProt https://www.uniprot.org
SIB-ENZYME conectează nomenclatura cu secvența (UNIPROT)
SIB-ENZYME connects the nomenclature with sequence (UNIPROT)
General enzyme databases
SIB Swiss Institute of Bioinformatics https://enzyme.expasy.org/
Compresive catalog of protein sequence/ functional annotation
It has four components
UniProt Knowledgebase (UniProtKB)
UniProt Archive (UniParc)
UniProt Reference Clusters (UniRef)
UniProt Metagenomic and Environmental Sequences(UniMES)
Bazele de date generale
https://enzyme.expasy.org/
General enzyme databases
Bazele de date generale
http://www.ebi.ac.uk/intenz/
IntEnz – Integrated relational Enzyme database (nomenclatura)
General enzyme databases
Contain enzyme data – enzyme name / reaction – NC- IUBMB
Bazele de date generale
IntEnz General enzyme databases
Some enzyme data
ChEBI
ChEBI – dictionary of Chemical Compound of Biological Interest
Hosted by EBI European Bioinformatics Institute
ChEBI provide links to protein sequences (UniProt)
Bazele de date generale
IntEnz
Browse EC 7 Translocases EC 7.3. (translocare anioni)
EC 7.3.2 (hidroliza nucleozid trifosfaților) EC 7.3.2.7 ATPaze ce transportă arsenit
Bazele de date generale
IntEnz
EC 7.3.2.7 ATPaze ce transportă arsenit
ChEBI (dicționar pentru compușii de interes biochimic)
Baze de date pentru enzime
http://www.brenda-enzymes.org/index.php
BRENDA
Enzyme-Fuctional databases
o clasificare și nomenclatură
Baze de date pentru enzime
BRENDA - gamă largă deproprietăți enzimatice
o reacții și specificitate(substrate naturale/artificiale)
Enzyme-Fuctional databases
o classification și nomenclature
BRENDA – full range of enzyme properties
o reactions și specificiy(natural / artificial substrates)
Inhibitori, cofactori,ioni metalici, activatori
Inhibitors, cofactors,metal ions, activators
o Posedă un dictionar pentruliganzi Chemical Identifier(INChI)
o Equipped with a thesaurus forligand namesChemical Identifier (INChI)
o Compuși care interacționează (grafic)
o Compounds interacting (graphical representations)
Baze de date pentru enzime
BRENDA - gamă largă deproprietăți enzimatice
o izolarea și preparareaorganism, tesut saulocalizare celulară
o fiecare intrarereferințe bibliografice
Enzyme-Fuctional databases
o structura enzimelor
o parametri funcționali
o informații legate deorganismul din care provinTaxTree explorer
o Functional parameters
o organism-relatedinformationsTaxTree explorer
BRENDA – full range of enzyme properties
o isolation and preparationsource of enzymeorganism, the tissue,subcellular localization
o enzyme structure
o Each entry linked withliterature refereces
Baze de date pentru enzime
BRENDA - gamă largă deproprietăți enzimatice
Baze de date pentru enzime
o aplicații și inginerie
o enzimele - responsabilepentru anumite boli
Enzyme-Fuctional databases
o application and engineering
o Enzyme – disease relationships
Două baze complementareAMENDAFRENDA
Two supplements to BRENDAAMENDA
(Automatic Mining of ENzyme DAta)FRENDA
(Full Reference ENzyme DAta)
Extrase din PubMedAbstacte
Extracted from PubMed abstract(US National Library of Medicine)
Baze de date pentru enzime
KEGG - gamă largă de proprietăți enzimatice
Enzyme-Fuctional databases
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)
Informații despre enzime - parte a bazei de date LIGAND
Enzyme information is stored as a part of the LIGAND database
Conține Consisting of
compusi compound
medicamente drug
glicani glycan
reactii reaction
Interactiuni reactanti Rpair (reactant pair alignment)
enzime enzymes
Baze de date pentru enzime
Enzyme-Fuctional databases
Baze de date pentru enzime
Enzyme-Fuctional databases
KEGG – mentinuta de Kanehisa Laboratories in the Bioinformatics Center of Kyotoși de Human Genom Center of the University of Tokyo
KEGG – developed and mantained byKanehisa Laboratories in the Bioinformatics Center of Kyoto and the Human Genom Center of the University of Tokyo
DateNomenclaturaSubstrateProdusiReactiiNume de geneStructura metabolitiDiagrame reactieCăi metabolice
Data compriseNomenclatureSubstrates ProductsReactionsGene namesChemical structure of metabolitesReactions diagramsMetabolic pathways
Baze de date specializate pentru unele enzime
Special Enzyme Databases
MEROPS (https://www.ebi.ac.uk/merops/)
Baza de date pentru peptidaze(proteaze, proteinaze sauenzime proteolitice)
Resourse for peptidase (proteases, proteinases orproteolytic enzymes)
ClasificareaCompararea secvențelor(proteolitic / de legare inhibitor)
The ClassificationSequence comparisonsDomains (peptidase / inhibitor unit)
O proteină a cărei secvență este cunoscută și care este caracterizată biochimicreprezentativă
A proteine that has been sequenced and characterized biochemically Representative (“holotype”)
Baze de date specializate pentru unele enzime
Special Enzyme Databases
MEROPS (https://www.ebi.ac.uk/merops/)
SecvențeleVariante ale secv. reprezentativeSpecii proteice
All sequencesVariants of holotype“Protein species”
Secvențele proteiceasemănătoare statisticFamilie
The sequences of statistically related protein species“Family”
Familia 3D asemănătoare str. primară situs activ similarăascendent comun → Clan
Familysimilar 3D structureactive site residues same ordercommon ancestor → “Clan”
Baze de date specializate pentru unele enzime
Special Enzyme Databases
MEROPS (https://www.ebi.ac.uk/merops/)
Baze de date specializate pentru unele enzime
Special Enzyme Databases
MEROPS
Descrierea specificitățiipentru substratPeptidaze cu > 10 scindăriO prezentare a preferințelorsi de clivare
The substrate specificity Any peptidase with > 10 cleavagesA display – the amino acids preferred at its substrate binding sites
AminoaciziiVerde polariRosu aciziAlbastru baziciNegri nepolari
Amino acidsgreen polarred acidicblu basicblack hydrophobic
Baze de date cu enzime specializate
MEROPS – specificitate de clivare cleavage specificity
aminopeptidase A (Homo sapiens)
Ectoenzimădegradează
angiotensina II
Dostal, D.E. Baker, K. M.
Circulation Research.
1999;85:643-650
Special Enzyme Databases
Ectoenzymedegrades
angiotensin II
Baze de date cu enzime specializate
MEROPS substrate cu relevanță fiziologică (P)
sau nu (N)
substrate sintetice (S)
Special Enzyme Databases
MEROPS artificial (S) substrate pathologicaly relevant (P)
or not (N)
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
MetaCyc (https://metacyc.org)
Special Enzyme Databases
metabolismul moleculelorde dimensiuni mici
conține căi metabolice(microbiane sau vegetale)dovedite experimental
informații - enzimele ce asistă anumite reacții
Enzyme-Fuctional databases
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
MetaCyc – căutare după cod
Special Enzyme Databases
Enzyme-Fuctional databases
Search by EC number / names
orzbarley (Hordeum vulgare)
Enzima-marker pt dezvoltarea embrionară a semințelor de grâu(în decursul germinației)The enzyme serves as a marker of embryonic development in germinating wheat grains
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
MetaCyc
Special Enzyme Databases
Enzyme-Fuctional databases
Diagramă grafică a reacțieiA graphycal reaction diagram
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
REBASE (http://rebase.neb.com/rebase/rebadvsearch.html)
Special Enzyme Databases
Enzyme-Fuctional databases
enzimele de restricțieADN metiltransferazele proteinele înrudite Procesele biologice de restricție-modificare
restriction enzymesDNA methyl transferasesrelated proteinsRestriction-modification process
Informații bibliografice situsurilor de recunoaștere
de legaredisponibilitatea comercială sensibilitatea la metilare, cristalizarea secvențelor acestora
Referenced informationrecognition and cleavage sitescommercial availabilitymethylation sensitivitycrystal datasequence data
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
REBASE
Special Enzyme Databases
Enzyme-Fuctional databases
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
REBASE
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
REBASE
Date cinetice Kinetic data
http://www.cazy.org/CAZY – Carbohydrate-Active enZYme Database
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
familii de “module” enzimatice legare carbohidrațilorFormare/modificare/clivarelegături glicozidiceGlicozil transferaze
Formare de di-, oligo- sau polizaharide
Families of structurally related catalytic and carbohydrate-binding modulesDegrade/modify/create new glycosidic bondsGlycosyl transferase (EC 2.4.a.b.)
https://www.sbhsciences.com/
CAZY
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
CAZY
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
Alte clase de enzime Liazeesteraze
Enzime active la carbohidrațiidentificarea in genom
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
CAZYpedia http://www.cazypedia.org/
http://bioinf.man.ac.uk/phosphabase/index.html
PhosphaBase (PhB) – baza de date pentru fosfataze
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
T. Igawa, International journal of urology, 2017DOI:10.1111/iju.13197aria
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
resorufin-based substratesprotein tyrosine phosphatase (PTP) activity in vitro and in living cellsacidic and neutral pH.
Substrate pe bază de resorufinprotein tirozin fosfataze (PTP) activitatea in vitro și in vivopH acid / neutru
Biswa et. al, Chemical Communication, 14, 2017
PhosphaBase (PhB) – baza de date pentru fosfataze
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
DEPOD – baza de date pentru fosfataze umanehttp://depod.bioss.uni-freiburg.de/
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databasesSpecial Enzyme Databases
The human EPhOsphorylation Dtabase
DEPOD
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
Substrate experimentale testate
Proteic and nonproteic substrates
Metabolic PathwayKEGG
Cai metabolice
http://www0.nih.go.jp/mirror/Kinases/
PKR – the Protein Kinase Resource (old)
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
3000 de gene pentru kinazegenomul uman
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
3,000 protein kinase genes in human genomes
FuncțiileEvoluțiilediversitatea Factoricomportarea celulară “kinome”
functionevolutiondiversitykey controlerscell behaviorkinome
https://randr.nist.gov/enzyme/Default.aspx
TECRDBThe Thermodynamics of Enzyme-catalyzed Reactions Database
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
TECRDB
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
TECRDB
Baze de date pentru enzime
Baze de date cu enzime specializate
Enzyme-Fuctional databases
Special Enzyme Databases
codECmetoda tamponulreactia Enzimacofactorul
IDECmethodbufferreactionenzymecofactor
Baze de date pentru enzime
http://enzymefunction.org/projects
EFI (Enzyme Function Initiative)