Mercoledi 17 Novembre

Mercoledi 24 Novembre

Aula GOLGI

Ore 15,00 - 16,00

Esercitazioni di Biochimica

Regolazione dell’Espressione Genica

Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:

DNA RNAtranscript

mRNA mRNA

inactivemRNA

protein

inactiveprotein

NUCLEUS CYTOSOL

trascrizione Maturazione trasporto traduzione

degradazione

controllo dell’attivita’

Erythrocytes White blood cells

Mol

ecul

ar m

ass

kDa

10

200

pH pH4 410 10

Different cell types contain different proteins

Mol

ecul

ar m

ass

kD

a

10

200

Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis

Hb Hb

• Perche’ l’emoglobina e’ presente ad alti livelli negli eritrociti e assente nei globuli bianchi ?

• Hb e Hb sono I polipeptidi che insieme all’eme formano l’emoglobina dell’adulto

• Concentriamoci sulla -globina .

• Se la regolazione coinvolge la sua sintesi allora dovremo studiare le cellule che la producono, gli eritroblasti.

Differenziamento degli eritrociti

Il differenziamento delle cellule del sangue nel midollo

spinale

Myeloid stem cells

(Precursor cells)

Erythroblasts

(Fanno l’emoglobina)

White blood cells except lymphocytes

(non contengono emoglobina)

Erythrocytes

(contengono l’emoglobina)

Regulation of globin synthesis

White blood cells Erythroblasts

DNA

globin mRNA

globin Protein

Gene presente Gene presente

Proteina quasi completamente

assente

Proteina presente

? ?

Regulation of globin synthesis

White blood cells Erythroblasts

DNA

globin mRNA

Globin Protein

Gene presente Gene presente

Proteina quasi completamente

assente

Proteina presente

Quasi assentepresente in grandi

Quantita’

Meccanismi che Potrebbero portare ad un aumento dell’mRNA di Hb

negli eritrociti1. globin mRNA e’ trascritto negli eritrociti e nei globuli bianchi

ma in questi ultimi :

• Non e’ processato e poi e’ degradato• Processato ma rapidamente degradato

2. globin mRNA e’ trascritto negli eritrociti ma non nei globuli bianchi

• Un modo di misurare SOLO la velocita’ di trascrizione e’ :

RUN-OFF TRANSCRIPTION

• Nucei ISOLATI, continuano a sintetizzare l’RNA

(run-off RNA), ma non iniziano nuove molecole di

RNA

• I nuclei sono incubati con ATP radioattivo.

• I run-off RNA sono isolati, separati e identificati.

• Un forte segnale significa che al momento dell’isolamento dei nuclei la cellula stava producendo molto RNA.

Run-off transcription

5’

5’

5’

5’

5’

Nessun nuovo inizio

Nessun nuovo inizio

Run-off transcription in vitro

precursori RadioactiviResult of hybridisation

globin

Run-off transcripts from Eritroblasti

Run-off transcripts from Gobuli Bianchi

Positive control,actin

Positive control, actin

globin

filterfilter

L’esperimento ci dice :

Negli eritroblasti il gene della globina e’ trascritto molto velocemente

Nei globuli bianchi la sua velocita’ di trascrizione e’ bassissima

globin

globin

Quindi la globina e’ presente solo negli eritroblasti perche’ qualche cosa influenza la

trascrizione del suo gene.

Controllo del livello di ferro nella cellula

• Il ferro e’ un nutriente essenziale

• La cellula lo usa per : citocromi, emoglobina e molti enzimi.

• Il ferro in eccesso e’ causa di formazione di radicali liberi

• Quindi il livello di ferro deve essere controllato accuratamente.

Fe 2+

Sangue

Fe 3+

Transferrin(trasporto)

Transferrinreceptor (ingresso)

Ferritin (Stoccaggio)

Regolazione di proteine trasportatrici/immagazzinamento del

ferro

• Quando il ferro e’ in eccesso la cellula deve diminuire il livello del recettore e aumentare quello della ferritina.

• La cellula ottiene questo mediante regolazione della traduzione,• Cosi la risposta e’ piu’ rapida

Controllo della Traduzione

1. Repressione - es. Iron Response Element della ferritina2. Stabilizzazione- es. IRE del recettore della transferrina

Ferritina - Lega il Ferro e lo conservaRecettore della Transferrina (TFR)- trasporta il ferro nella cellula

Se il Ferro e’ nella cellula - Si Ferritina, No TFRSe non c’e’ Ferro - Si TFR, No Ferritina

Come viene regolato tutto questo?

M

Coding region

AUG

Fe

m7G

Iron Response Element

IRE-BP (cytosolic aconitase)

Fe

M

Fe

Ferritin mRNA

Coding region

AUG

1. Repressione :-Ferro, ferritina NO

2. Attivazione:+ Ferro, ferritina SI

M

Coding region

AUG

m7G

Iron Response Element

IRE-BP (cytosolic aconitase)

Fe

M

Fe

TFR mRNA

Coding region

AUG

1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI

2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO

Coding region

AUG

m7G

Iron Response Element

IRE-BP (cytosolic aconitase)

TFR mRNA

Coding region

AUG

1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI

2. Degradazione:+ Ferro, TFR NOFe

RNAse

Il ferro previene il legame di una proteina di 90 kDa ad uno o piu’ Iron Response Elements.

•Recettore della Transferrina.

Stem loop al 3’. La presenza dello stem loop causa la degradazione dell’mRNA

Ferritina

Stem loop al 5’. La presenza della proteina sullo stem loop causa il blocco della traduzione.

Purificazione degliIntermedi dellatraduzione

CICLOEXIMMIDE: interferisce conLa reazione della peptidil transferasi(arresto dei ribosomi 80S sull’AUG)

GMP-PNP (Analogo del GTP pero’Non-idrolizzabile): GTP richiesto perL’unione della subunita’ 60S al complesso40S/mRNA

CAP analogo:inibisce il legame della40S all’mRNA

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’

WT-IRE: IRE come e’ nella Ferritina

C-IRE: IRE con una delezione

Componenti del ComplessoChe lega il CAP

NOTA BENE: all’inizio della traduzione il legame della 40S all’mRNA richiedeIl legame del “CAP binding Complex” al cappuccio dell’mRNA

NOTA: Il legame della 40S al CAP dell’mRNA richiede l’interazione di elF3 (che e’ legatoAlla 40S) con elF4 (legato al CAP)

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH°

La presenza di acqua ossigenata o ossido nitrico rende attiva IRP-1 (che e’ la IRE bindingProtein piu’ abbondante) che quindi causa un aumento del recettore della transferrina

Il ferro viene rimosso dal sangue e non genera radicali liberi!

DMT1

DMT2

Quindi DMT1 e’l’unico regolabiledal Ferro

DMT2DMT1

Se non e’ presente abbastanza FeNella cellula del Duodeno vieneIndotta la sintesi di DMT1