Meccanismi di patogenesi batterica: esotossine lezione - tossine... · Antigeni esogeni (batteri,...

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Meccanismi Meccanismi di patogenesi batterica: di patogenesi batterica: esotossine esotossine esotossine esotossine G. Di Bonaventura G. Di Bonaventura Università di Chieti Università di Chieti-Pescara Pescara

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Meccanismi Meccanismi di patogenesi batterica:di patogenesi batterica:

esotossineesotossineesotossineesotossine

G. Di BonaventuraG. Di BonaventuraUniversità di ChietiUniversità di Chieti--PescaraPescara

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Azione patogena dei batteri mediata da fattori di virulenza

• Produzione di tossine (tossinogenesi)

–– esotossine (principalmente Gram+)

– endotossine (LPS) (solo Gram-)

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• Sostanze proteiche (PM: 10-900 kDa) sintetizzate in forma solubile dai batteri, in particolar modo dai Gram+

• Spesso controllate da geni extracromosomici (plasmidi)

• Vengono escrete nel mezzo circostante, ma rilasciate anche in seguito a lisi cellulare

• Si legano a specifici recettori cellulari (specificità cellulare) risultando tossiche o letali per le cellule dell’ospite

Esotossine: principali caratteristiche

risultando tossiche o letali per le cellule dell’ospite

• Elevata tossicità (anche per ingestione) per gli animali: dose minima letale 1-5 µg (appena 2x10-5 µg per la tossina botulinica)

• La natura proteica le rende altamente antigeniche (immunogene), stimolando così la formazione di antitossina neutralizzante

• Apirogene

• Convertite (mediante trattamento con formalina, acidi, calore) a tossoidi o anatossine

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Sull’inibizione delle tossine batteriche si basa la risposta immunitaria attiva, caratteristica dei principali vaccini antibatterici

Le tossine batteriche sono, infatti, il principale bersaglio della sieroprofilassi

Costituenti dei principali vaccini antibatterici (vaccino antitetanico, antidifterico e antipertosse) sono le anatossine o tossoidi, esotossine alle quali è stato

artificialmente eliminato il potere tossico preservandone le proprietà antigeniche (immunogene)

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Esotossine: classificazioneEsotossine: classificazione

• Specificità di bersaglio (tropismo cellulare):

– tossine neurotrope: agiscono a livello del sistema nervoso centrale o periferico (tossina tetanica e botulinica)

– enterotossine: agiscono sulla mucosa intestinale (tossina colerica, enterotossine di E. coli)

– tossine pantrope: diffusione dei recettori cellulari (tossina – tossine pantrope: diffusione dei recettori cellulari (tossina difterica, tossina pertossica, tossina di Shiga)

• Meccanismo di azione:

– superantigeni (tossine tipo I)

– esotossine che danneggiano le membrane della cellula ospite(tossine tipo II)

– tossine A-B ed altre tossine che interferiscono con le funzioni della cellula ospite (tossine tipo III)

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Esotossine di tipo I

Superantigeni

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Attivazione linfociti T4:“Presentazione” dell’antigene

1. Antigeni esogeni (batteri, virus, miceti, protozoi) vengono fagocitati da antigen-presenting cells (APC: macrofagi, cellule dendritiche, linfociti B) all’interno di un fagosoma.

2. Il fagosoma si fonde con il lisosoma.3. Degradazione proteasica degli antigeni a peptidi.4. Molecole MHC-II vengono sintetizzate nel reticolo

endoplasmico e trasportate verso il complesso di Golgi. Legame della catena Ii alle molecole MHC-II (per evitare che peptidi per MHC-I si leghino a MHC-(per evitare che peptidi per MHC-I si leghino a MHC-II).

5-6.Il complesso MHC-II / Ii chain viene trasferito nel complesso di Golgi all’interno di vescicole.

7. Le vescicole si fondono con il fagolisosomacontenente peptidi. La catena Ii viene rimossa ed i peptidi sono liberi di legarsi al MHC-II.

8. Il complesso MHCII-peptide viene trasportato alla membrana citoplasmatica dove si ancora.

9. Il complesso peptide/MHC-II può essere riconosciuto da un linfocita T4 mediante T-cell receptor (TCR) e CD4 aventi forma complementare.

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“Presentazione” dell’antigene

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I superantigeni sono proteine batteriche ad azione toxin-like che attivano le cellule T CD4+ legandosi

aspecificamente (senza presenza di Ag specifico) al T cell receptor (TCR) ed al complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (MHC-II) dei macrofagi.

L’interazione aspecifica APC-linfocita T mediata dal superantigene si traduce nella attivazione e

proliferazione delle cellule T e nell’attivazione dei macrofagi con rilascio di elevate dosi di diverse

Legame convenzionale linfocita T4-antigenemacrofagi con rilascio di elevate dosi di diverse

citochine: dapprima IL-2 (febbre, nausea, vomito, diarrea) che, a sua volta, stimola la sintesi di altre citochine (IL-1, IL-8, TNF-α, PAF) coinvolte nella patogenesi dello shock (danno endoteliale, CID,

insufficienza respiratoria)

linfocita T4-antigene

Superantigene : legame aspecifico

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� Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) , prodotta da alcuni ceppi di S. aureus che causano la sindrome dello shock tossico (febbre, rush, shock)

� Enterotossine, prodotte da S. aureus; causano tossinfezione alimentare (nausea, febbre, vomito, diarrea). La tossina stimola il

Esempi di alcuni superantigeni di origine microbica

alimentare (nausea, febbre, vomito, diarrea). La tossina stimola il vago causando vomito incoercibile.

� Tossina pirogenica, prodotta da ceppi invasivi di S. pyogenes� superantigeni associati a S. pyogenes potrebbero causare psoriasi

� Heat-stable toxins (sta) di ceppi enterotossigenici di E. coli� Antigeni di M. tuberculosis, del virus rabbico e di HIV

possono essere considerati superantigeni

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Esotossine di Tipo II

Tossine che agiscono a livello della superficie cellulare

Le tossine emolitiche (emolisine o citolisine) sono enzimi che producono pori nella membrana cellulare, digeriscono materiali cellulari, alterano la

composizione della membrana

Tossina esfoliativa (due varianti antigeniche: A , B), prodotta da S. aureus, causa il Tossina esfoliativa (due varianti antigeniche: A , B), prodotta da S. aureus, causa il clivaggio delle proteine di matrice extracellulare dello strato granuloso

dell’epidermide (sindorme della cute pseudo-ustionata)

Esotossina B, prodotta da ceppi invasivi di streptococchi β-emolitici di gruppo A (Streptococcus pyogenes). Questa esotossina è una proteasi che degrada il tessuto

muscolare (miosite) o la guaina di rivestimento del muscolo (fascite necrotizzante).

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Citolisine prodotte da Gram+

• Queste citolisine sono costituite in gran parte da una sola subunità

• Agiscono formando un poro “a biscotto” (proteico) nella membrana cellulare bersaglio

• I pori annullano il gradiente Na+/K+• I pori annullano il gradiente Na+/K+

transmembrana, provocando una lisi osmotica della cellula

• L’ingresso di Ca2+ extracellulare causa un’attivazione della cellula bersaglio

• Esempi: listeriolisina (Listeria monocytogenes), pneumolisina(Streptococcus pneumoniae), tossina-a (S. aureus)

Streptolisina O vs eritrociti di coniglio

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Citolisine prodotte da Gram-

• Repeats-in-ToXin (RTX) family� E coli – emolisina alfa (HlyA)

� P. vulgaris – emolisina

� Pasteurella haemolytica - leucocidina

• Meccanismo di azione similare a quello delle• Meccanismo di azione similare a quello dellecitolisine prodotte dai Gram+

• Agiscono formando un poro funzionaletransmembrana, sebbene la strutturadifferisca da quella dei pori prodotti daGram+

E. coli: HlyA

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Esotossine prodotte da Clostridium perfringens

Tossine ad effetto necrotizzante ed emolitico che, insieme alla distensione del tessuto ad opera del gas prodotto dalla

fermentazione dei carboidrati, favoriscono la diffusione dellagangrena gassosa (mionecrosi). Possono essere inoltre

causa di una forma mista diarroico-dissenterica.

� tossina alfa (lecitinasi): aumenta la permeabilità dei � tossina alfa (lecitinasi): aumenta la permeabilità dei capillari e delle cellule muscolari distruggendo la lecitina presente nella membrana citoplasmatica . Questo causa edema nella gangrena gassosa.

� tossina kappa (collagenasi): causa la degradazione del tessuto connettivale e muscolare, responsabile delle lesioni molli della gangrena gassosa.

� tossina mu (ialuronidasi): causa la rottura dei legami intercellulari nel tessuto.

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Esotossine prodotte da Clostridium difficile

Colite pseudomembranosa = sindrome dissenterica con crampi,

diarrea acquosa/sanguinolenta, febbre, leucocitosi

� La Tossina A è una potente enterotossina che esercita � La Tossina A è una potente enterotossina che esercita

anche attivitità citolitica, danneggiando le cellule mucosali

intestinali, che in tal modo perdono il controllo del flusso

di H2O. Inoltre, esse richiamano e distruggono i

neutrofili, causando il rilascio degli enzimi lisos omiali

che potenziano il danno tessutale.

� La Tossina B è una potente tossina citolitica.

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� Le tossine A-B sono proteine dimeriche, ossia composte da due parti:

componente A (active) e componente B (binding).

� Sono prodotte sia dai batteri Gram-positivi che Gram-negativi e secrete

nell’ambiente esterno

Esotossine di Tipo IIITossine “A-B” che interferiscono con le funzioni

della cellula ospite

� Il componente B si lega al recettore superficiale della cellula ospite, così

determinando la specificità di bersaglio della tox.

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• La tossina viene, quindi, traslocata attraverso la membrana:

• per endocitosi: il componente A si separa da B per migrare nel citoplasma;

• altre tossine A-B prevedono l’ingresso nella cellula del solo componente A, generalmente attraverso un poro di membrana.

• La principale difesa dell’ospite nei confronti delle tossine è rappresentata dalla produzione di anticorpi anti-tossina (neutralizzanti). Una volta legata dall’anticorpo, la tossina non potrà più legarsi al recettore di superficie cellulare.

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• Tossina difterica (Corynebacterium diptheriae)

• Tossina di Shiga (Shigella dysenteriae, E. coli enteroemorragici

EHEC)

• Tossina colerica (Vibrio cholerae)

Esempi di tossine A-B

• Tossina colerica (Vibrio cholerae)

• Tossina pertossica (Bordetella pertussis)

• Enterotossine (Clostridium perfringens, Bacillus cereus)

• Tossina carbonchiosa (Bacillus anthracis)

• Tossina tetanica o tetanospasmina (Clostridium tetani)

• Tossina botulinica (Clostridium botulinum)

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Esotossine che interferiscono con le funzioni della cellula ospite

Inibizione della sintesi proteica cellulare:

* tossina difterica (Corynebacterium dyptheriae)

* tossina di Shiga (Shigella dysenteriae)

* tossine Shiga-like (E. coli enteroemorragici)

* tossina A (Pseudomonas aeruginosa)

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regione che lega il recettore

regione catalitica

• Prodotta da Corynebacterium diphteriae per conversione lisogenica (fago temperato β) del gene tox, attivato da carenza di Fe.

Tossina difterica

regione di traslocazione

attivato da carenza di Fe. • La tossina difterica (62 kDa)

presenta tre regioni distinte:• B, lega il recettore (COO-)• T, di traslocazione• A, catalitica (NH3+)

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Legame della tossina al recettoremediante il sito B; clivaggio da proteasi

Internalizzazione tox per endocitosi

Dopo acidificazione dell’endosoma,la regione di traslocazione (T) si inseriscenella membrana endosomiale

La regione catalitica (A) passa nel citosoldove provoca ADP-ribosilazione di EF-2,inattivandolo

Meccanismo di azione della tossina difterica

1 2

3 4

1• La morte cellulare è causata da un blocco della sintesi proteica secondario alla ADP-ribosilazione di EF-2, fattore

23

4

ribosilazione di EF-2, fattore necessario per la traslocazione dal sito A al sito P della catena nascente. • Bersaglio della tossina sono le cellule cardiache, nervose e renali (tossina pantropa)• La porzione “D" del vaccino DTP contiene il tossoide difterico per stimolare la sintesi di Abs “neutralizzanti”, ossia diretti verso il componente B della tossina.

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Tossina di Shiga (e tossine Shiga-like)

• Tossina A-B (struttura A-B5), prodotta da Shigella spp e da E. coli enteroemorragici (E. coli O157:H7)

• Si lega al globoside Gb3 di membrana• Introduzione della tox per endocitosi• Tox (frammento A1) con attività catalitica N-

glicosidasica, che causa la degradazione di rRNA della cellula ospite, prevenendo così l’adesione del tRNA “carico” e, in tal modo, blocca la sintesi proteica cellulare.

• La tossina inoltre: – potenzia il rilascio LPS-mediato di citochine quali IL-– potenzia il rilascio LPS-mediato di citochine quali IL-

1 e TNF-α– danneggiando le pareti dei vasi ematici, sembra

essere responsabile della sindrome uremica emolitica, complicanza della shigellosi e delle infezioni da E. coli O157:H7

Esotossina A di P. aeruginosa� Tossina A-B: componente A (COO-), componente B (NH3+)� Meccanismo di azione similare a quello della tossina difterica

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Alterazione del contenuto intracellulare di

AMP- ciclico (azione

catalitica ADP-ribosilante):

Esotossine che interferiscono con le funzioni della cellula ospite

* tossina colerica

* tossina pertossica

* tossina termolabile di E. coli

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Tossina colerica

• Prodotta da Vibrio cholerae

• Struttura A2-B5

• Il componente A, formato da due frazioni (A1, A2), è dotato di attività

ADP-ribosilante

• Il componente B, formato da 5 frazioni, lega il ganglioside GM1 presente • Il componente B, formato da 5 frazioni, lega il ganglioside GM1 presente

sulle cellule epiteliali dell’intestino tenue (enterotossina)

• Aumenta la concentrazione di AMPc, causando:

- liberazione di ioni sodio, potassio, bicarbonati

- perdita di liquidi (fino a 20 L/die acqua), diarrea e grave

disidratazione

• Batterio poco invasivo, patogenicità legata alla tossina.

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Proteina G inibitoriaProteina G stimolatoria

L’adenilato-ciclasi converte l’ATP in AMP-ciclico (cAMP), “secondo” messaggero che attiva diversi geni e funzioni cellulari.La funzione dell’adenilato-ciclasi è regolata da due proteine dette proteine G (che legano il GTP): la proteina G stimolatoria (Gs) attiva l’adenilato-ciclasi, la proteina G inibitoria (Gi) inibisce l’attivazione dell’adenilato-ciclasi.

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Proteina G inibitoriaProteina G stimolatoria

La proteina G stimolatoria (Gs) è il bersaglio dellatossina colerica , che la immobilizza nello stato attivato,causando un significativo (fino a 100 volte maggiore)aumento della quantità intracellulare di cAMP

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La tossina colerica

L’aumento di AMPc blocca il normale trasporto di Na+ dal lume intestinale verso il torrente ematico e causa la fuoriuscita, verso il lume, di K+ e bicarbonati

Il movimento di ioni richiama H2O dal torrente circolatorio verso il lume intestinale, causando diarrea e massiva perdita di liquidi (mortalità per disidratazione).

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• Prodotta da Bordetella pertussis

• Costituita da una subunità tossica S1 e 5

subunità di legame (da S2 a S5 + 2 subunità

S4).

Tossina pertossica

• La S2 si lega al lattosilceramide. La S3 si lega

a recettori presenti sui fagociti causando un

aumento del CR3 sulla superficie cellulare.

• La porzione S1 della tossina ha attività ADP-

ribosilante e si lega alla proteina Gi

(regolazione negativa dell’adenilato-ciclasi),

inibendola.

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Proteina G inibitoriaProteina G stimolatoria

La proteina G inibitoria (Gi) è il bersaglio della tossina de llapertosse. La Gi inattivata non è in grado di inibire l’adenilatociclasi, con conseguente aumento della quantità intracellularedi cAMP

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Tossina pertossicaeffetti biologici

� A seconda del tipo cellulare interessato, l’aumento intracellulare di AMPc può causare:

- nell’epitelio respiratorio, l’aumento delle secrezioni respiratorie e della produzione di muco, caratteristiche dello stato parossistico della muco, caratteristiche dello stato parossistico della pertosse (tosse, broncospasmo, dispnea);

- nei fagociti, riduzione della fagocitosi (chemotassi, engulfment, killing);

- nel sangue, un’aumentata sensibilità all’istamina e conseguente aumento della permeabilità capillare, ipotensione e shock;

- nelle cellule nervose, può causare encefalopatia.

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Esotossine che interferiscono con le funzioni della cellula ospite

Alterazione del contenuto

intracellulare di AMP-ciclico

(azione enzimatica adenilato-ciclasica):

tossina di Bacillus anthracistossina di Bacillus anthracis

* Fattore I o edema factor di Bacillus anthracis: è una

adenilato ciclasi batterica che provoca aumento di

AMPc intracellulare

* Fattore II (protective antigen): componente B della

tossina

* Fattore III: metalloproteasi

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Tossina carbonchiosa

� Bacillus anthracis produce tre tossine (2 x A + 1 B):

- antigene protettivo (protective antigen, PA)

- fattore edematogeno (edema factor, EF)

- fattore letale (lethal factor, LF)

� PA (83 kDa) funge da componente B, legandosi ai recettori e viene clivato da una proteasi, scoprendo un sito di legame per LF e/o EF.

� EF (componente A) è una adenilato-ciclasi che potenzia la sintesi di AMPc nella cellula ospite, influenzando la fagocitosi ed inibendo la produzione di TNF e IL-6 da parte dei monociti. Ciò è responsabile dell’alterazione delle difese dell’ospite e causa parte dei monociti. Ciò è responsabile dell’alterazione delle difese dell’ospite e causa un forte edema (accumulo di liquidi negli spazi intercellulari), caratteristico dell’antrace.

� LF (componente A) è una proteasi che inibisce la chinasi-chinasi attivata da stimoli mitogeni (MAPKK).

- A bassi livelli, LF inibisce il rilascio di citochine pro-infiammatorie IL-1, TNF-α e NO. Questo può inizialmente ridurre la risposta immune nei confronti del microrganismo e della tossina da esso prodotta.

- Ad alti livelli, invece, LF è citolitico per i macrofagi, causando il rilascio di IL-1, TNF- α e NO. L’eccessivo rilascio di queste citochine può portare ad una massiva risposta infiammatoria ed alla cascata dello shock, simile allo shock settico.

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Principali gruppi di esotossine (classificate

per meccanismo d’azione)

Interferenza con il rilascio di

neurotrasmettitori (tossine neurotrope):

* tossina tetanica

* tossina botulinica

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• Tossina neurotropa prodotta da Clostridium tetani(a codificazione plasmidica)

• Sintetizzata come singola molecola (150 KDa),viene quindi scissa da proteasi in due subunità peptidiche:

Tossina tetanica (tetanospasmina)

peptidiche:- subunità leggera (catena A) e subunità pesante (catena B) unite da un ponte S-S.

• La catena B si lega con l’estremità -COOH terminale ad un recettore sulla superficie deineuroni (ganglioside GM2).

• La catena A, una zinco-endopeptidasi, viene internalizzata e risale dalle terminazioni periferiche al SNC tramite trasporto assonale retrogrado.

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A-B. La trasmissione nervosa è regolata dall’equilibrio tra

Tossina tetanica: meccanismo di azione

A-B. La trasmissione nervosa è regolata dall’equilibrio tra neurotrasmettitori eccitatori ed inibitori.

C. I neurotrasmettitori inibitori (GABA, glicina) prevengono la depolarizzazione della membrana postsinaptica e la conduzione del segnale elettrico.

D. La tetanospasmina non interferisce con la produzione del GABA o della glicina, ma con il loro rilascio (attività presinaptica). In assenza di neurotrasmettitori inibitori, l’eccitazione degli assoni non è contrastata, causando la simultanea contrazione dei muscoli flessori ed estensori (paralisi spastica , morte per insufficienza respiratoria)

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La componente "T" del vaccino DTP consiste nel tossoide tetanico, che stimola la produzione di anticorpi neutralizzanti, ossia diretti verso il componente B della tossina. Una volta legata dall’anticorpo, la esotossina non sarà più in grado di legarsi ai recettori cellulari di superficie.

Rilascio muscolare per azione dei neuroni inibenti

Meccanismo di azione della tetanospasmina

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Tossina botulinica

• Clostridium botulinum produce una endopeptidasi che blocca il rilascio di acetilcolina a livello della giunzione neuromuscolare.

• La tossina botulinica scinde la sinaptobrevina interferendo con laformazione delle vescicole sinaptiche.

• Il risultato è la paralisi flaccida : debolezza discendente bilaterale acarico dei muscoli periferici, morte per paralisi dei muscoli respiratori.

Contrazione muscolare mediata da acetilcolina

Meccanismo di azione della tossina botulinica

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tossina tetanica

vs vs

tossina botulinica

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Enterotossine

� Diversi batteri (Clostridium perfringens, Bacillus cereus) producono

esotossine che si legano alle cellule del piccolo intestino. La

maggior parte di queste tossine causa una ADP-ribosilazione delle

proteine della cellula ospite che modula la sintesi di molecole

regolatrici a struttura ciclica (cAMP, cGMP) nelle cellule della

mucosa intestinale.

� Elevati livelli di cAMP e cGMP provocano la perdita di elettroliti e

di acqua, causando diarrea.

� Invece, le enterotossine prodotte da Staphylococcus aureus e dai

ceppi enterotossigenici di Escherichia coli esibiscono un differente

meccanismo d’azione, funzionando da superantigeni.

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Proprietà delle

tossine batteriche di

tipo A–B

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Le endotossine batteriche

L’endotossina è il lipolisaccaride (LPS) che

costituisce il rivestimento esterno dei batteri

gram negativi

E’ prodotta quindi dai solo batteri gram

negativi

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n Esotossineu Natura proteica

F Termolabili

u Immunogeniu Neutralizzabili da

n Endotossineu Lipopolisa ccaridi

F Termostabiliu Immunogeni , ma non

neutralizzabil i daanticorpi

Confronto

u Neutralizzabili daanticorpi

u Profili di azione moltodifferenziati

u Estrema potenzau Alcune attive per

ingestione

anticorpiu Profili di azione po co

differenziatiu Meno potentiu Inattive per

ingestione

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Le diverse attività

del lipopolisaccaride

Tossicità mediata

dell’endotossina

da P.R. Murray, K.S. Rosenthal, G.S. Kobayashi, M.A. PfallerMicrobiologia

EDISES

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SEPSI SEPSI

Indica una risposta infiammatoria sistemica (SYRS, Systemic Inflammatory

Response Syndrome) sostenuta da gravi infezioni (principalmente da gram

negativi) in organi o apparati (polmoni, addome, vie urinarie). E’ caratterizzata dalla

massiccia produzione di elevate quantità di fattori infiammatori (PGs,TNFs, IL1,

IL6, IL8, IL12).

Le citochine proinfiammatorie innescano:

• alterazione degli endoteli vascolari con collasso ipotensivo (sepsi ipotensiva)

•la cascata della coagulazione con la formazione di diffuse coagulazioni intravasali•la cascata della coagulazione con la formazione di diffuse coagulazioni intravasali

(DIC: disseminated intravascular coagulation)

•estesi fatti emorragici con la grave compromissione di diversi organi (Shock

settico) ed effetti fatali per il paziente

SHOCK SETTICOSHOCK SETTICO

Termine utilizzato per raggruppare una serie di eventi fisiopatologici che portano al

collasso del sistema circolatorio causando il quadro clinico della sindrome da

insufficienza multipla di organi (MOFS) che può provocare la morte del paziente