Tubulopatie

Licia PeruzziSC Nefrologia Dialisi e Trapianto

Ospedale Infantile Regina Margherita Torino

Ruolo del tubulo renale…• omeostasi elettroliti• omeostasi idrica• omeostasi soluti organici

alterazioni di questi meccanismi inducono importanti anomalie

per molti anni l’inquadramento nosografico delle tubulopatie è stato estremamente ostico

TUBULO RENALE

…negli ultimi 15 anni le conoscenze molecolari e genetiche hanno ridefinito il capitolo delle tubulopatie

da un punto di vista genetico, funzionale, fisiopatologico e diagnostico

Tubulopatie congenite..Primitive: dovute a difetti molecolari di carrier o

canali tubulari

Secondarie: dovute a difetti di � recettori (Ca++ sensing receptor, recettore

ADH) � enzimi (PHEX, 1αidrossilasi etc) �malattie metaboliche con alterato

funzionamento cellulare (malattie mitocondriali, galattosemia, S.di Lowe)

Tubulopatie congenite..�inquadramento fisiopatologico: basato

sull’effettoEs: tubulopatie ipercalciuricheutile ai fini diagnostici ma non identifica il

meccanismo molecolare, ne’ la sede del difetto.l’effetto può essere secondario

�inquadramento anatomico: basato sulla sede e sul tipo di molecola coinvolta

Es. tubulopatie dell’ansa di Henle

classificazione più complessa ma che tiene conto del tipo di molecola coinvolta e degli effetti derivanti

Tubulopatie congenite primitive….

• TUBULO PROSSIMALE: cistinuriaS. di DentRTA prossimale

• ANSA DI HENLE E TUBULO DISTALE:S. di BartterS di GitelmanS ipoMg-ipercalciuriaS da perdita isolata Mg

• TUBULO COLLETTORE: S di LiddlePseudoipoaldost.RTA distaleDiabete insipido nefrog.

Incidenza: sempre <1/50000/anno

Prevalenza: nel 2003 erano stati stimati per tutte le tubulopatie max 50-60 pazienti afferenti all’area pediatrica del Piemonte (60/600.000 bambini ovvero prevalenza di 6/100.000 bambini)

Codifica ICD9-CM: molto carente non consente codifica specifica

Codifica DM 279/2001: comprende pochissime diagnosi raggruppate in maniera disomogenea

Tubulopatie renali congenite

ICD9-CM

255.1 Iperaldosteronismo Sindrome di Bartter

270.0 Malattie del trasporto degli aminoacidi

271.1 Galattosemia

271.4 Glicosuria renale

275.3 Disordini del metabolismo del fosforo

275.4 Disordini del metabolismo del calcio

588.0 Osteodistrofia renale Anomalie tubulari con perdita di fosfati

588.1 Diabete insipido nefrogeno

588.8 Altre patologie specificate, causate da ridotta funzione renale

DM 279/2001RCG010: iperaldosteronismi primitivi:

RCG040: Disturbi del metabolismo e del trasporto degli aminoacidi:

RCG060: Disturbi del metabolismo e del trasporto dei carboidrati:

RCG070: Alterazioni congenite del metabolismo delle lipoproteine:

RC0150: sindrome di Wilson:

RC0170: rachitismo ipofosfatemico vitamina D resistente:

RFG100: paralisi normokaliemiche ipo e iperkaliemiche:

RNG100: altre anomalie congenite multiple con ritardo mentale:

RJ0010: diabete insipido nefrogenico:

Dal DM 279/2001:

• Le tubulopatie erano identificate in maniera disorganica sotto codici diversi, parziali e troppo restrittivi.

• Alcune come le acidosi tubulari renali non erano codificabili in alcun modo

• Molta attenzione alla tubulopatie secondarie a danno tubulare da malattia metabolica

• Escluse le anomalie primitive di pompe tubulari

• Codifica basata sui alcuni sintomi e non su classificazione rigorosa anatomica o funzionale

Dal 2003 nella Regione Piemonte Gruppo di lavoro sulle malattie escluse nell’ambito del gruppo di studio sulle malattie rare

Aprile 2005 approvato dalla Regione Piemonte integrazione del DM 279/2001(D.G.R. n. 38-15326 del 12.04.05)

Altre Regioni (es Lombardia, Veneto, Abruzzo) stanno seguendo lo stesso orientamento

Parere positivo dell’ISS dal 2005

Gruppo di Studio della Società Italiana di Nefrologia sta portando avanti questa istanza presso il Ministero della Salute

Tubulopatie congenite primitive….

• TUBULO PROSSIMALE: S. di Dent cistinuriaRTA prossimaleSindrome di Fanconi

• ANSA DI HENLE E TUBULO DISTALE:S. di BartterS di GitelmanS ipoMg-ipercalciuriaS da perdita isolata Mg

• TUBULO COLLETTORE:RTA distalePseudoipoaldost.S di LiddleDiabete insipido nefrog.

CISTINURIA• disordine del trasporto degli aminoacidi

dibasici (lisina, arginina e ornitina) e della cistina

• Aa cationici vengono riassorbiti nel tubulo prossimale con 3 sistemi:

a. condiviso da Cys e Aa-dibasicib. specifico per Cysc. specifico per Aa-dibasici

Cys poco solubile forma calcoli nei soggetti omozigoti

CISTINURIA• ereditarietà: AR• 1-2% delle litiasi dell’adulto• 6-8% delle litiasi del bambino• prevalenza 1:7000-1:15.000

• Classificazione fenotipica: I, II, III si basa sul grado di uptake intestinale della cistina negli omozigoti e sul livello di escrezione di Cys negli eterozigoti….. rivista alla luce delle indagini molecolari

CISTINURIA: aspetti molecolari

• Gene: rBAT (SLC3A1) chr 2p21• codifica per trasportatore Na+-indep• proteina del brush border 685 aa• 4 domain intramembrana• appartiene alla famiglia 4F2 • legata a subunità leggera che

conferisce specificità

Sistema di trasporto Na+

indipendente Cistinuria tipo II e III

Cistinuria tipo I

CISTINURIA: aspetti molecolari

• Gene SLC3A1 (proteina rBAT): descritte oltre 40 mutazioni tutte nei pazienti con cistinuria tipo I

• Gene SLC7A9: codifica per la subunitàleggera

• chr 19q13.1• 37 mutazioni descritte: prevalentemente

nei pazienti con cistinuria tipo II e III

S. di DENT (nefrolitiasi X-linked ipercalciurica)

• L’identificazione del difetto molecolare ha consentito di raggruppare sotto questo nome 4 malattie definite:

� nefrolitiasi X-linked (USA)� malattia di Dent (GB)� rachitismo ipofosfatemico X-linked (Italia)� proteinuria di basso MW ipercalciuria

nefrocalcinosi (Giappone)

S. di DENT

• Tutte le 4 malattie hanno in comune:• Proteinuria di basso peso molecolare• Altri difetti del tubulo prossimale (glicosuria,

fosfaturia, aminoaciduria)• Ipercalciuria / nefrocalcinosi• mai acidosi tubulare• Predominanza maschile• Evoluzione in IRC

Gene CLCN5 (chr Xp11.22)

Canale del Cl- voltaggio dipendente (ClC5)

Proteina ClC5 è espressa nelle vescicole di endocitosi subapicali, appena sotto i microvilli del brush border, del tubulo prossimale e colocalizza con la pompa H+-ATPasi del brush border

E’espressa anche da ansa di Henle e tubulo collettore

Gunther W et al: PNAS 1998

ClC5 H+ATPasi ClC5 + H+ATPAsi

beta2micro

• ClC5 è essenziale per l’endocitosi fornendo uno shunt elettrico necessario per l’acidificazione delle vescicole.

Inattivazione di questo meccanismo determina un difetto dell’endocitosi

Proteinuria di basso peso molecolare

….a tuttora non è chiaro il meccanismo del’ipercalciuria:

Alterazione omeostasi del Ca++:

• attraverso endocitosi di PTH

• espressione recettore tubulare del PTH

• trasportatore di fosfati NaPi-2

• stimolazione vit D3 idrossilasi

• aumentato assorbimento intestinale Ca++• ruolo di Cl C5 nell’ansa di Henle• alterato riassorbimento nei segmenti distali ?

Il canale del cloro (ClC5) e la ipercalciuria…

MG maschio 6 anni• familiarità:

IRC in dialisi attualmente trapiantato

Connettivite atipica, sindrome APS

A 6 anni riscontro casuale di

PROTEINURIA ISOLATA +++

0.5 g/die 1.5 g/die

BIOPSIA RENALEOttica: 62 corpuscoli del Malpighi: 4 con sclerosi globale del flocculoverosimilmente di tipo involutivo, raccolti in un'unica area. I restanti glomeruli hanno spazi uriniferi liberi e assi mesangiali in alcuni segmenti lievemente allargati x aumento sia della sostanza fondamentale sia della componente cellulare.Le membrane basali sono sottili e circoscrivono lumi di capillari pervi.

l'interstizio è di connettivo finemente fibroso, in limitate piccole aree lievemente infiltrato da elementi infiammatori di tipo parvi-rotondo-cellulare.I tubuli non mostrano significative alterazioni patologiche. Nulla di rilevante a carico della componente vascolare sulle sezioni esaminate.

Immuno istochimica: positività discreta x IgM (++) generalizzata e diffusa in esili tralci mesangiali a distribuzione irregolare.inoltre una positività spiccata x C3 (+++) al polo vascolareIl quadro microscopico ottico non si discosta significativamente dalla norma,tranne che per la presenza di focali aspetti di glomerulosclerosi globale verosimilmente di tipo involutivo.In considerazione dell'indagine immunoistochimica ci si potrebbe orientare nel senso di una glomerulonefrite a depositi di IgM.

BIOPSIA RENALEIndagine ultrastrutturale: sono stati esaminati 6 glomeruli. I podociti mostrano brevi tratti di fusione dei pedicelli. Gli assi mesangiali sono esili e comprendono occasionali piccoli depositi elettrondensi. le membrane basali hanno spessore conforme all'età del paziente e i lumi dei capillari sono pervi.

Il reperto ultrastrutturale si accorda con la diagnosi precedentemente posta di glomerulonefrite a depositi IgM.

INDAGINI DI LABORATORIO (A)

• proteinuria 24 ore: 1.5 g/24h(rapporto proteinuria/creatininuria 1.5-2)

• proteinuria sotto sforzo:lieve aumento• immunoglobuline: normali• complementemia: normale• FAN, anti DNA, ENA….: tutti negativi• Anti fosfolipidi:tutti negativi

INDAGINI DI LABORATORIO (B)

• proteinuria tubulare:alfa1 microglobulina 43 µg/mmol Cr (vn <22) RBP 17 µg/mmol Cr (vn <0.24)

• calciuria/creatininuria: 0.24 mg/mg (vn <0.15)

• elettrolitici urinari: sodiuria, potassiuria, fosfaturia normali

• EGA: normale

ECOGRAFIA RENALE

• Entrambi i reni presentano morfologia e dimensioni comprese nei limiti della norma. Si rileva diffusa iperecogenicità della midollare con corticale assottigliata e reletivamente ipoecogena. Non si osservano immagini iperecogene di tipo litiasico.

Analisi molecolare del gene del canale del cloro CLCN5.

Il sequenziamento diretto dei prodotti di amplificazione ha evidenziato la presenza di una mutazione nell’esone 2.

sostituzione nucleotidica 391 C>T, che causa la sostituzione dell’amminoacido Arginina con un codone di stop (R347X).

E’ una mutazione ricorrente, già descritta in altri pazienti con malattia di Dent, inattivante la proteina per prematura terminazione della catena polipeptidica.

LT maschio 6 mesi• familiarità:

IRC in dialisi

GN proliferativa mesangiale con IgM ??

A 4 mesi riscontro ecografico di iniziale nefrocalcinosi

INDAGINI DI LABORATORIO

• proteinuria tubulare:alfa1 microglobulina 65 µg/mmol Cr (vn <22) RBP 27 µg/mmol Cr (vn <0.24)

• calciuria/creatininuria: 0.78 mg/mg (vn <0.15)• elettrolitici urinari: sodiuria, potassiuria, fosfaturia normali• EGA: normale

Analisi molecolare del gene del canale del cloro CLCN5.

•allele complesso [1448 C>T;1552_1553insAG] nell’esone 8 due mutazioni: •una sostituzione nucleotidica C>T al nucleotide 1448 • una inserzione del dinucleotide AG in posizione 1552. •La prima è una mutazione missenso non conservativa (S386F) che induce la sostituzione dell’amminoacido Serina con Fenilalanina in posizione 386 della proteina•la seconda è una mutazione frameshift che introduce un codone di stop in posizione 434 (S388fsX434).

Si tratta quindi di una mutazione inattivante il canale ClC-5 per prematura terminazione della catena amminoacidica. Sia la mamma di T che la nonna sono risultate eterozigoti per l’allele complesso.

ACIDOSI TUBULARE PROSSIMALE

• Caratterizzata da acidosi metabolica ipercloremica da alterata capacità d riassorbire HCO3-

• è molto rara in forma isolata, piùfrequentemente si associa a sindrome di Fanconi completa (galattosemia, sindrome di Loewe, tirosinemia, s di Wilson, cistinosi etc)

•80-90% del carico filtrato di HCO3- è riassorbito nel tubulo prossimale

Na+

K+

Na+K+ATPasi

ACIDOSI TUBULARE PROSSIMALE forme complesse

nelle forme generalizzate di tubulopatia prossimale il difetto è secondario ad alterazioni della sintesi di ATP o della pompa Na+/K+ATPasi basolaterale necessaria per mantenere il gradiente del Na+

• pRTA austosomica dominante: mutazioni del gene NHE3. Descritta una sola famiglia in Costa Rica. Modello topo KO.

• pRTA Autosomica recessiva con anomalie oculari: mutazioni nel cotrasportatore NCB1 (gene SLC4A4). RTA, ritardo mentale, glaucoma, cataratta e cheratopatia a banda (NCB1 espresso anche nell’occhio e nel cervello)

• pRTA autosomica recessiva con osetopetrosi e calcificazioni cerebrali: numerose mutazioni dell’anidrasi carbonica (CAII)

RTA PROSSIMALE forme isolate

S. Di BARTTER• È in realtà un gruppo di tubulopatie

ereditarie strettamente correlate con sintomatologia clinica comune ma diversi difetti molecolari

• Caratteristiche cliniche salienti: alcalosi metabolica ipokaliemica, perdita di sodio, iperaldosteronismo iper-reninemico con PA normale, iperplasia dell’apparato iuxtaglomerulare.

+ ATP

Cl

Na

K

K

Na

Cl Cl

K

ANSA di HENLE Tratto ascendente spesso (TAL)

Barttin

+ ATP

Cl

Na

K

K

Na

Cl Cl

S di BARTTER tipo I S di BARTTER tipo III

Cl

S di BARTTER tipo II

BarttinS di BARTTER tipo IV

S di BARTTERTipo I:• mutazioni di NKCC2 (gene SLC12A1)• chr 15q15-21• fenotipo: Bartter prenatale, polidramnios,

nascita pretermine, alcalosi ipokaliemaica severa, scarsa crescita, ipercalciuria e nefrocalcinosi

• quadro simile alle alterazioni indotte dalla furosemide

• attivazione RAS è secondario alla perdita di Na+

• ipercalciuria e nefrocalcinosi sono secondarie al mancato gradiente elettrico tubulare positivo con impedito riassorbimento di Ca++ e Mg++

S di BARTTERTipo II:• mutazioni di ROMK (KCNJ1)• chr 11 q24-25• fenotipo: Bartter prenatale, polidramnios,

nascita pretermine, alcalosi ipokaliemica severa, scarsa crescita, ipercalciuria e nefrocalcinosi

• talora l’ipopotassiemia è più tardiva e vi può essere una fase con iperpotassiemia e acidosi neonatale

S di BARTTERTipo III:• mutazioni di ClC-Kb (CLCNKB) (gene della famiglia

dei canali del cloro voltaggio dipendenti tipo s Dent)

• chr 1 p36

• fenotipo: Bartter classico senza nefrocalcinosima talora variabile in intensità per probabile presenza di vie alternative per il riassorbimento del Cl sulla membrana basolaterale

S di BARTTERTipo IV:• mutazioni di barttina (BSND) (subunità

regolatoria β dei canali del cloro ClC-K-a e ClC-K-b: ne consente montaggio sulla superficie cellulare e funzionamento)

• fenotipo: Bartter classico severo simile al tipo I ma senza nefrocalcinosi

• Sempre associato a sordità neurosensoriale congenita

• Accumulo intracellulare di Cl e grave perdita tubulare di sodio

MECCANISMO DELLA SORDITA’ DA MUTAZIONI DELLA BARTTINA

+ ATP

Cl

Na

K

K

Na

Cl Cl ClBarttin

NKCC1

Lume della scala media

Cellule marginali della stria vascolare dell’orecchio interno

ClClBarttin

ClC-Ka

KCNQ1

NELL’ORECCHIO INTERNO

S di GITELMAN• clinica: quadro più lieve di ipopotassiemia

associata a ipomagnesiemia e ipocalciuria• Talora solo debolezza o ipereccitabilità

muscolare• Esordio frequente in età adulta

� Difetto molecolare: TSC (o NCCT) canale tiazido sensibile del tubulo distale (geneSLC12A3)

� trasportatore di Cl- elettroneutro�Chr 16q13�Sintomi simili alla somministrazione cronica di

tiazidici

Tubulo distale

-

S di GITELMAN• il mancato funzionamento del cotrasportatore

NCCT determina un aumentato apporto di Na+ e Cl- al dotto collettore

• Contrazione di volume → Attivazione RAS →iperaldosteronismo e perdita di K+

• ipocalciuria: meccanismo analogo ai tiazidici: cellula iperpolarizzata per uscita del Cl- stimola al riassorbimento del Ca+ via canali voltaggio dipendenti

• Ridotto Na+ intracellulare facilita la fuoriuscita del Ca++ via scambiatore Na+/Ca++

• il meccanismo della perdita urinaria di Mg++ non è chiaro: via paracellulare (via paracellina 1)?

RIASSORBIMENTO TUBULARE DEL MAGNESIO

DCT: ruolo di TRPM6 regolato da EGF

TAL: ruolo della claudina 16 (paracellina) : canale del Na+ in uscita verso il lume tubulare che crea gradiente ionico + che favorisce riassorbimento di Mg++

S. IPOMAGNESIEMIA IPERCALCIURIA NEFROCALCINOSI FAMILIARE (FHHN)

• Autosomica recessiva• Grave deplezione di Mg++• Ipercalciuria/nefrocalcinosi → IRC• Anomalie oculari• Difetto molecolare: gene PCLN-1 (paracellina-1)

che codifica per CLAUDINA 16 proteina delle tight junction

• Chr 3q27

Mutazioni PCLN-1: aumenta la resistenza elettrica →→→→ridotta permeabilità al Mg++ (assorbito solo per via paracellulare)

S da PERDITA ISOLATA di Mg++

• Molto rara. Autosomica dominante• Ipomagnesiemia paucisintomatica e ipocalciuria• Difetto molecolare: Na+/K+ATPasi subunità γ

sulla membrana basolaterale del tubulo distale• Alterazione del voltaggio intracellulare: ridotto

assorbimento di Mg

• Prima malattia umana in cui è stato identificato un difetto della Na+/K+ATPasi

DIFETTI DEL CALCIUM SENSING RECEPTOR• CaR: è membro della superfamiglia dei

recettori legati a G protein• Chr 3q13.3-q21• Espresso su rene (membrana basolaterale

della TAL) e paratiroidi• Attivazione del recettore: inibisce la

funzione di ROMK determinando ridotto riassorbimento di NaCl: viene meno la forza trainante per il riassorbimento di Ca++

• MUTAZIONI con aumento di funzione• con diminuzione di funzione

DIFETTI DEL CALCIUM SENSING RECEPTORDiminuzione di funzione: aumentato

riassorbimento renale di Ca++ e upregolazione del PTHIpercalcemia ipercalciurica familiare (FHH)

Aumento di funzione: ridotto riassorbimento di Ca++ e dowregolazione di PTHipocalcemia, ipercalciuria con PTH normale o basso Nefrocalcinosi AD

CaRBlocco funzione

S di LIDDLE• Autosomica dominante• Comparsa precoce di severa

ipertensione arteriosa, alcalosi metabolica, ipopotassiemia

• renina e aldosterone soppressi

• Difetto molecolare: attivazione costitutiva del canale epiteliale del Na+ del tubulo collettore (ENaC)

Na+

Cellule principali del dotto collettore

2αααα:1ββββ:1γγγγ

S di Liddle: mutazioni subunità ββββ o γγγγ: ↑↑↑↑ attività del canale

S. di LIDDLE• ↑↑↑↑ attività del canale ENaC: riassorbimento incontrollato di Na+, espansione di volume, inibizione Renina-Aldosterone, ipertensione

• meccanismo molecolare: mutazioni di ENaC determinano la perdita di sequenza regolatoria PY che lega la proteina Nedd4 determinando endocitosi e degradazione del canale

• aumentata espressione di canali ENaC sulla superficie cellulare e aumentato riassorbimento di Na+

PSEUDOIPOALDOSTERONISMO tipo I

• rara• Clinica: perdita di Sali e resistenza ai

mineralcorticoidi• Iponatremia, iperkaliemia, acidosi metabolica,

Aldosterone e renina ↑↑• AD più lieve AR più severa con ritardo di

crescita, grave ipetrpotassiemia e acidosi• Difetto molecolare: mutazioni con perdita di

funzione del canale ENaC: incapacità di aprirsi

• Topi KO per le tre subunità: α è la piùimportante anche nel polmone

•

RTA DISTALE• Clinica: acidosi metabolica ipercloremica a causa

di difetto di escrezione di H+ distale

• Poliuria, vomito, disidratazione, ritardo di crescita, ipokaliemia, pH urinario alcalino

• Ipercalciuria e ipocitraturia con nefrocalcinosi

• Freq associazione con sordità neurosensoriale

• AD o AR.

Cellule intercalate del dotto collettore

ATP

H+-ATPase

H+/K+ATPase

dRTA• difetto molecolare: gene AE1 (=Banda 3 del GR)

scambiatore di anioni Cl-/HCO3-

• mutazioni responsabili delle forme dominanti• forme AR: mutazioni della subunità B1 della H+-

ATPase (gene ATP6B1)• Chr 2p13• espressa anche da coclea e sacco endolinf.

Orecchio: sordità per alterazione del pH dell’endolinfa

• Forme senza sordità: mutazioni del gene• ATP6N1B Chr 7q33-34• ATP6N1A subunità accessoria di H+-ATPasi

DIABETE INSIPIDO NEFROGENICO• mancata risposta all’ADH• Clinica: polidispia, poliuria, disidratazione,

ipernatremia, scarso accrescimentoDifetti molecolari:• Forme XL recessive: recettore AVPV2• Chr Xq28

• Forme AR• Acquaporina 2 (AQP2)• Chr 12q13• alterata espressione in membrana:

persistenza nel RE

Cellule principali del dotto collettore

AVP