Il DNA del tartufo. Tracciabilità e valorizzazione di un prodotto di eccellenza

del territorio Manuela Giovannetti, Cristiana Sbrana

Camera di Commercio di Pisa 10 marzo 2017

Prof. Manuela Giovannetti, Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari e Agro-

ambientali, Università di Pisa

Dr. Cristiana Sbrana, Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria, C.N.R.

Il tartufo è il corpo fruttifero fungino e si sviluppa in seguito alla formazione di simbiosi dette micorrize tra il fungo e le piante ospiti

Le ife fungine circondano e penetrano le radici, dove i nutrienti del suolo assorbiti dal fungo (soprattutto azoto, fosforo e zolfo) vengono ceduti alla pianta in cambio di zuccheri

La formazione delle micorrize favorisce la crescita delle piante:- protegge dagli stress idrici e da malattie dovute a nematodi, funghi e batteri- attraverso le reti formate dal micelio nel suolo apporta nutrienti che non sarebbero immediatamente disponibili per le piante e trasferisce nutrienti tra le piante supportando la crescita dei semenzali e delle piante in ombra

Dalle micorrize si sviluppa la rete di micelio e da questo si ha la produzione del carpoforo: il tessuto fertile interno (gleba) si sviluppa in seguito alla fusione di miceli compatibili per dare il micelio dicariotico in grado di differenziare aschi e ascospore

Ciclo vitale di Tuber magnatum1. rilascio degli aschi2. miceli primari da germinazione delle ascospore3. formazione delle ectomicorrize4. spermatizzazione nei miceli extraradicali5. sviluppo dei primordi dell’ascocarpo6. maturazione dell’ascocarpo

(Paolocci et al. 2006)

I corpi fruttiferi si formano quando la pianta simbionte ha raggiunto la maturità fisiologica e ha formato una buona quantità di micorrize e le condizioni ecologiche sono favorevoli

La conservazione delle aree vocate e produttive è di fondamentale importanza, soprattutto per Tuber

magnatum, per il quale la micorrizazione di piante ospiti è ancora poco efficiente.

La ricerca e l’identificazione di corpi fruttiferi nelle aree di produzione si basa su caratteri morfologici visivi e

olfattivi: colore del peridio, ornamentazioni di superficie, aroma.

Ma una più certa appartenenza alle diverse specie di Tuber può essere ottenuta mediante analisi

morfologiche e molecolari

Numero di spore negli aschi,

forma, ornamentazioni,

grandezza e colore delle

spore osservate al microscopio

Analisi delle sequenze di DNA

estratto dal tessuto interno del carpoforo

Un viaggio dal macroscopico…al microscopico

T. melanosporum: 1-8 per asco, marrone scuro 20x29-26x35 μm, spinulate

T. magnatum: 1-3 per asco, gialle, 15x20-25x35 μm, 3-5 alveolature grandi sull’asse maggiore

T. borchii: 1-4 per asco, brune, 20x22-35x50 μm, 5-8 alveolature piccole sull’asse maggiore

Esempi di caratteri morfologici delle spore in alcune specie di Tuber

T. aestivum: 1-6 per asco, gialle, 15x20-35x45 μm, reticolo irregolare con 3-4 alveolature sull’asse maggiore

Anche se generalmente i caratteri distintivi delle spore si conservano durante i processi tecnologici per la produzione di salse, creme, ecc., non sempre l’identificazione morfologica delle specie contenute nei prodotti finiti è chiara, perché in assenza di criteri relativi alla morfologia del carpoforo, i caratteri tassonomici delle spore di alcune specie appaiono simili

Analisi morfologica di prodotti «al tartufo»

Permettono l’identificazione tassonomica certa delle specie di Tuber da campioni di carpofori, radici micorrizate, prodotti gastronomici utilizzando metodi basati sul sequenziamento di regioni di DNA conservate o amplificazione di sequenze specie-specifiche

Le analisi molecolari

Tuber dryophilum AF003917

Tuber oligospermum AF106891

B5RCB8RCTuber borchii FJ554519Tuber borchii FJ554521B3Tuber borchii FJ554524B1B11RCB7RCB4B2RCB6RC

M6RCM9M2RCM4RCTuber magnatum JQ925645M5M10M11RCTuber magnatum AJ002509M12RCM1Tuber magnatum AF106888

Tuber aestivum EU753266.1

Choiromyces alveolatus EU669384

100

53

64

100

99

100

80

100

82

0.05

Elaborando un albero basato sulla somiglianza tra le sequenze otteniamo la certezza della identificazione se le sequenze ottenute dai nostri campioni si raggruppano con quelle della specie in oggetto e il gruppo ha un buon supporto statistico

sequenziamento della regione del DNA ribosomale

Amplificazione di sequenze specie-specifiche

Può permettere di rilevare direttamente la presenza di specie di Tuber in prodotti gastronomici, che rappresentano matrici analiticamente «difficili» per il basso rendimento in DNA di Tuber delle procedure di estrazione

Esempio di rilevazione di DNA di Tuber magnatum in mix con altri

DNA fungini, fino a una proporzione di 1 ng T. magnatum e 99 ng

altro DNA (da Iotti et al. 2012)

In aggiunta a analisi molecolari utili per l’identificazione della specie, il DNA estratto dai carpofori può essere amplificato per ottenere altri tipi di sequenze, non più localizzate solamente in una regione specifica ma distribuite in tutto il genoma del fungo

Questi tipi di analisi, di “fingerprinting” permettono di individuare differenze all’interno della specie, legate all’origine geografica o a caratteri dei singoli isolati, e potrebbero essere utili per il riconoscimento dei tartufi autoctoni e per la loro tipizzazione

(Molinier et al. 2015)

Analisi di regioni di DNA ripetuto

Hanno permesso ad esempio di caratterizzare le popolazioni europee di Tuber aestivum, che mostrano ampie differenze genetiche tra i diversi areali geografici

Ma chi fa la differenza nell’aroma?

I carpofori di Tuber borchii,Tuber maculatum e Tubermagnatum ospitano popolazioni vitali e coltivabili di 100.000 – 100.000.000 batteri!!!

Non sappiamo come si diversificano le popolazioni batteriche tre le diverse aree geografiche, ma sappiamo che svolgono funzioni cataboliche e di difesa nelle micorrize e nel carpoforo e che variano durante lo sviluppo e la maturazione della gleba

(Deveau et al. 2016)

GRAZIE PER L’ATTENZIONE