Lezione 03 (22-11-06) Immunologia

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    3 LEZIONE DI IMMUNOLOGIA (22 NOVEMBRE 2006- 1 ORA)

    Abbiamo visto la volta scorsa la struttura delle immunoglobuline, molecole effettrici prodotte dalla plasmacellula, cherappresenta la cellula di differenziazione terminale, cio che non in grado di riprodursi, che se perde leimmunoglobuline di membrana che possedeva come linfocita B acquisisce una enorme capacit protido-sintetica che indirizzata appunto alla sintesi di immunoglobuline. Limmunoglobulina sintetizzata da una plasmacellula ha la stessa

    identica specificit dell immunoglobulina di membrana che rappresentava il recettore del linfocita B da cui deriva.Badate bene: lisotipo pu cambiare, cio si pu avere un IgG o unIgA, per la specificit identica a quella delrecettore del linfocita B dal quale la plasmacellula deriva.

    Oggi vediamo come avvieneLINTERAZIONE TRA LANTIGENE E LANTICORPO.

    Possiamo considerare lanticorpo allo stesso modo sia che si tratti di una Ig di membrana, cio che fa parte integrantedel linfocita B e rappresenta il suo recettore di riconoscimento per lantigene, sia che si tratti di una Ig solubile,presente nel sangue, negli interstizi e cos via.Abbiamo gi visto che la zona specifica per lantigene identificabile nel dominio variabile di ciascuna catena pesanteassieme al dominio variabile corrispettivo della catena leggera. Quindi ricordiamo che la struttura base di un Ab, che siaesso di membrana o che sia esso solubile, di norma bivalente.

    Prendiamo in considerazione il singolo sito di combinazione dellanticorpo con lantigene: dominio variabile di unacatena pesante pi dominio variabile di una catena leggera, come indicato nel disegno, molto semplice ma abbastanzaefficace perch d innanzitutto unidea precisa di quello che il requisito essenziale per linterazione antigene-anticorpo e cio la complementariet spaziale. Qui rappresentato un antigene che va ad incastro, tipo puzzle, tra lezone delimitate dai siti che determinano la complementariet, tra le regioni del dominio variabile delle due catene.

    In questa immagine possiamo anche anticipare un altro dato: lantigene qualcosa di complesso; per esempio noi

    possiamo considerare una Salmonella come un antigene o meglio un mosaico di antigeni, anche pensando alla solasuperficie della salmonella. Questo vale per una cellula, come la Salmonella, e pu valere anche per una molecola chesia un minimo complessa.Quindi su una molecola complessa, cos come su un patogeno, possiamo avere delle strutture che vengono pifacilmente riconosciute e che sono denominate DETERMINANTI ANTIGENICI. In questo caso i determinantiantigenici sono indicati in nero e si combinano con le regioni che determinano la complementariet della catena H inalto e della catena L in basso.

    Diamo una definizione di ANTIGENE: sostanza che introdotta in un ospite induce una risposta immunitaria specifica.Finora abbiamo visto la risposta immunitaria come un qualcosa di attivo: attivazione, proliferazione, espansione delclone, produzione di molecole effettrici e cos via. QUESTA UNA MODALITA DI RISPOSTA del sistemaimmunitario, quella pi evidente.C unaltra modalit di risposta che non meno importante ed una modalit di tipo NEGATIVO: lintroduzione indeterminate condizioni di un antigene determina si una risposta immunitaria, una risposta specifica, ma questa rispostasi traduce in una assenza di proliferazione e di attivazione di risposta come visto fin ora, cio non c produzione di Ab,di linfociti T sensibilizzati e cos via.

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    Questo tipo di risposta viene definita anche una risposta di tipo TOLLEROGENO, cio che induce il fenomeno dellatolleranza: noi messi a contatto con una determinata sostanza possiamo rispondere con una risposta immunitaria di tipopositivo (proliferazione cellulare, espansione del clone e cos via) oppure, in condizioni diverse, possiamo risponderecon una non risposta che specifica perch vale solo per quellantigene e non per gli altri.La tolleranza un fenomeno molto importante che sta alla base dello stato di salute di tutti noi, anche se lintroduzionedella tolleranza un fenomeno che sta alla base di alcune malattie di un certo rilievo.

    Quindi, due modalit di risposta nei confronti dellantigene.

    Lantigene poi lo possiamo anche definire in base alle sue caratteristiche:

    - IMMUNOGENICITA: in grado di indurre una risposta immunitaria specifica, sia essa positiva o negativa;genera immunit, riconoscimento. Il vero antigene immunogeno; immunogeno e antigene vengono spessousati come sinonimi.

    - ANTIGENICITA: in grado di interagire coi componenti del sistema immunitario che esso ha attivato, sianoessi anticorpi, siano essi cellule, come le cellule T che derivano dalla proliferazione del clone che lo hariconosciuto allinizio.

    Queste due caratteristiche sono tipiche dellantigene completo o immunogeno.

    Unaltra definizione importante quella di APTENE: esso possiede solo la seconda propriet; introdotto nellanimaleda esperimento, (normalmente nelluomo come pu avvenire per vari contatti fortuiti), non in grado di indurre unarisposta immunitaria specifica n di tipo tollerogeno n di tipo positivo. Per se questa risposta viene indotta in qualchemodo, perch ad esempio laptene legato a una proteina, e allora si ha la produzione di anticorpi, laptene in grado diinteragire coi prodotti della risposta immunitaria, cio manca di immunogenicit ma possiede la capacit di interagirecoi prodotti della risposta immunitaria una volta che questa sia stata attivata.La sostanza che normalmente conferisce immunogenicit allaptene viene definita SOSTANZA CARRIER oVETTORE.

    Mentre gli apteni sono di norma delle sostanze molto semplici, i carrier sono di norma delle sostanze dotate di una certacomplessit strutturale.

    Caratteristiche degli antigeni completi o immunogeni:

    - sono di norma delle macromolecole, ma non tanto il peso molecolare che vi viene indicato (cut off = 3000-5000 Dalton) che fa la differenza quanto la

    - complessit chimica e strutturale. Gli immunogeni per eccellenza sono le proteine, in particolare le proteineglobulari; pi raramente sono polisaccaridi, oppure lipidi o addirittura acidi nucleici, perch i polisaccaridi, adesempio, magari hanno elevatissimo peso molecolare ma spesso sono costituiti da unit che si ripetono, quindila complessit strutturale molto relativa;

    - devono essere degradabili, cio devono essere scindibili in componenti pi semplici. Questo rende lecomponenti degradabili da quelle cellule che le abbiano endocitate, in modo particolare per le proteine, e rendepossibile la presentazione di oligopeptidi a linfociti T. Ecco perch le proteine sono i migliori immunogeni:ricordiamo che il linfocita T riconosce solo, di norma, degli oligopeptidi, presentati nel contesto di molecoledi prima e di seconda classe. La proteina deve essere degradabile per consentire questa riduzione sinoalloligopeptide significativo da presentare al linfocita T da parte della cellula presentante lantigene;

    - devono essere riconosciuti come estranei(condizione self- non self perch possa attivarsi tutto il processo).

    Esempio del funzionamento del sistema aptene- carrier:abbiamo il topolino di laboratorio al quale viene inoculato meta-ammino benzene solforato. Non produce nessunarisposta misurabile in termine di anticorpi.A un topolino con caratteristiche genetiche identiche rispetto al primo viene invece inoculata ovalbumina alla quale stato legato covalentemente il m-ammino benzene solforato. Questo secondo topolino produce anticorpi che sono direttisia verso lovalbumina sia verso il m-ammino benzene solforato. Se poi in vitro noi vogliamo vedere la reazione trasiero dellanimale e la sostanza chimica che abbiamo utilizzato, vedremo che ci sar uninterazione antigene- anticorpo.

    Altro esempio:

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    Questa una proteina che ha delle parti della sua struttura che hanno una capacit immunogenica particolarmenterilevante nei confronti del S.I. Vengono chiamate determinanti antigenici nativi. Abbiamo il di-nitrofenolo che

    stato coniugato in un secondo tempo; come un aptene che da solo non in grado di determinare una risposta. Unavolta veicolato al carrier diventa anchesso riconoscibile come determinante antigenico e quindi abbiamo una rispostaadeguata.

    Nel parlare di antigeni e di determinanti antigenici, soprattutto visto che parliamo di interazione antigene- anticorpo,dobbiamo ricordarci che una caratteristica essenziale dei determinanti antigenici per quanto riguarda il riconoscimentodegli anticorpi lACCESSIBILITA:una struttura chimica che sia posta su una superficie deve essere perfettamente accessibile allinterazione spaziale colsito di legame dellanticorpo.

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    La stessa molecola posta in una posizione pi interna e con distanza fra le catene laterali come nella figura in alto adestra ha determinanti antigenici non accessibili n per il riconoscimento n per una eventuale interazione conlanticorpo stesso.

    Ci vuole una certa complessit strutturale di una proteina o di altre sostanze ad alto peso molecolare, che abbiano poidelle zone riconoscibili dal S.I. come particolarmente rilevanti nel senso che per ciascuna di queste zone esiste unacellula che ha il recettore specifico. Perch linterazione, lattivazione e la risposta possa avvenire indispensabile chequeste strutture di superficie siano accessibili stericamente.

    Altro esempio:abbiamo uno schema di una molecola di mioglobina presente nello sperma di balena. un esempio che viene spessoriportato perch ci permette di identificare vari tipi di determinante antigenico.

    Se la utilizziamo, (tenendo presente la struttura terziaria di questa proteina complessa), per inocularla a un animale,vedremo che abbiamo vari tipi di anticorpo, non un anticorpo unico per questa proteina.Alcuni reagiranno con un determinante antigenico che costituito dalla zona dei 3 amminoacidi 83, 144 e 145. Questinon sono a.a. in sequenza nella struttura primaria, ma sono da un punto di vista sterico in qualche modo assemblati.Questi sono i cosiddetti determinanti antigenici conformazionali.Se noi, senza alterare la struttura primaria, trasformiamo questa proteina in un nastro di a.a. , lanticorpo non pi ingrado di riconoscere questo determinante antigenico: la proteina stata denaturata e senza questa struttura non piriconoscibile da quei linfociti B dotati del recettore specifico per il determinante costituito da quegli a.a.Unaltra possibilit di determinante antigenico quella indicata dagli a.a. 34,53 e 113: stesso identico discorso di prima.Ci possono essere per dei determinanti antigenici che sono invece costituiti da degli a.a. che sono in sequenza:DETERMINANTI ANTIGENICI LINEARI. In questo caso la zona determinata dagli a.a. che vanno dal 18 al 22.Quello che ha una certa rilevanza per la diagnostica e per altri aspetti che se per esempio viene persa la strutturaterziaria, i primi due determinanti non vengono pi riconosciuti, mentre il terzo, che legato strettamente alla strutturaprimaria, comunque riconosciuto. Se io devo fare una ricerca di laboratorio su un siero e voglio sapere se hadeterminati anticorpi verso un determinante antigenico, se lo sto cercando come determinante antigenico assemblato odiscontinuo devo stare bene attento a utilizzare la proteina nelle condizioni native, a non esporla a sostanze riducenti, aelevato calore, a non denaturarla. Se invece devo determinare se quellindividuo ha anticorpi verso un determinante cheso essere lineare posso ricorrere tranquillamente allimmuno-blotting, al western blot, anche se l vado a bollirelantigene.L a.a. 109, messo al centro della figura, a differenza degli altri, non accessibile dallesterno, non determina rispostaanticorpale, ma stato visto che la.a. cruciale delloligopeptide che viene riconosciuto dai linfociti T.Quindi nei confronti dello stesso immunogeno i linfociti B e T riconoscono cose un po diverse.Il siero di chiunque di noi, anche considerati anticorpi contro un patogeno, che sia Brucella o che sia Salmonella, sarcomunque un siero policlonale.(vedi figura sotto)

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    Epitope sta per determinante antigenico. Abbiamo un antigene: le varie parti vengono riconosciute da vari recettori equindi vari cloni linfocitari che daranno luogo ciascuno a un anticorpo specifico per il determinante; di norma noiavremo questo immunogeno con vari determinanti antigenici ed una risposta anticorpale, abbinata nella figura percolore, che corrisponde a ciascun determinante. Andando a valutare in proporzione quanti sono gli anticorpi con laspecificit verso un determinante rispetto a un altro, si vede che alcuni di questi determinanti antigenici sono piefficaci di altri nel determinare una risposta.Per esempio in questo caso abbiamo la parte gialla, violetta e nera che corrisponde al determinante antigenico sotto, chepu essere considerato come un determinante immunodominante.(warning!!! Qui penso si intenda dire che, essendo lepitope a destra riconosciuto da 20 anticorpi e gli altri da un

    numero maggiore, essendo pi specifico, risulti essere quello pi rilevante. Sto lasciando la frase letterale della profper avere un documento oggettivo)Quindi nellambito di strutture complesse abbiamo determinanti antigenici vari di cui uno o pi di uno possono esseredominanti, particolarmente rilevanti.

    Ci possono essere sulla superficie cellulare delle zone con addensamento di determinanti antigenici pi o menodominanti, o anche il ripetersi dello stesso determinante antigenico in pi parti della superficie.

    Ricordiamoci per i B abbiamo determinati conformazionali cos detti ASSEMBLATI, e determinanti lineari.

    Concludiamo ricordando quello che abbiamo gi visto sulla molecola di mioglobina, cio che T e B riconoscono partidiverse dello stesso antigene perch hanno modalit di riconoscimento diverse.

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    In questo caso abbiamo lesempio del glucagone. Consideriamo la sua sequenza aminoacidica da 1 a 29: la rispostaanticorpale si concentra soprattutto su determinanti antigenici costituiti da a.a. tra l1 e il 17; mentre il recettore dei T,(visto con un test funzionale), la stimolazione linfocitaria dellimmunit ritardata, riconosce soprattutto determinantiantigenici tra il 18 e il 29. Questo un aspetto peculiare.

    Nellinterazione antigene- anticorpo:

    fondamentale la complementariet sterica e migliore tale complementariet migliore linterazione, maggiore lastabilit del legame antigene-anticorpo.Il legame tra il sito di interazione per lantigene nellanticorpo e lantigene stesso, un legame reversibile, noncovalente, e la stabilit di questo legame tanto maggiore quanto maggiore la complementariet. Questo perch leforze non sono legami chimici, sono forze di tipo fisico che richiedono, per potersi manifestare, una vicinanza notevoletra le superfici.

    Queste sono le forze attrattive. Perch si manifestino tutte contemporaneamente (compreso il legame idrofobico)

    necessario che la distanza sia veramente minime; per avere questa minima distanza necessaria la complementariet.Le altre forze sono le forze di Van der Waals, forze elettrostatiche, ponti idrogeno, tutte forze facilmente removibili alivello di singolo sito di legame.La forza di attrazione che si sviluppa a livello di un singolo sito di legame (FAB= frammento che lega lantigene), ciotra un unico sito di combinazione e il suo determinante antigenico, viene definita AFFINITA DELLANTICORPOed misurabile con una costante. Laffinit quindi ci misura a livello del singolo sito dinterazione la forza di attrazionefra le superfici di un sito di combinazione e il suo determinante antigenico. Se noi consideriamo una molecola di IgGper esempio sappiamo che la molecola bivalente, quindi abbiamo due siti in cui si sviluppa questa forza di attrazione.Naturalmente si hanno impegnati tutti e due i siti.Se consideriamo una IgM avremo che il numero di siti in cui si pu sviluppare questa attrazione ancora moltosuperiore. Il numero di siti di combinazione viene definito VALENZA, e la forza complessiva che deriva dallaffinit edalla valenza viene definita AVIDITA. SUPERIORE AL PRODOTTO DELLAFFINITA PER IL NUMERO DISITI, c un bonus, perch interrompere contemporaneamente tutte le forze di attrazione su tutti i siti di legame

    difficile da un punto di vista pratico, molto pi difficile che interrompere un singolo sito di legame. Si dice che lavalenza d un bonus rispetto allaffinit e il legame viene reso molto pi stabile.Anche questo ha dei risvolti pratici: per esempio pensiamo alla IgM, la prima immunoglobulina che viene prodotta, lIgche presente in circolo, che serve come difesa immediata nei confronti di tutti i patogeni o sostanze tossiche circolanti(batteriemie, tossiemie, setticemie ecc.). Laffinit delle IgM bassa, per multivalente, quindi ha unavidit moltoelevata che la rende particolarmente efficace nonostante la sua bassa affinit; ci la rende unottima molecola di primoimpiego.A questo aggiungiamo che un potentissimo attivatore del complemento.

    Questo il calcolo:

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    proprio perch un legame reversibile abbiamo un equilibrio tra le componenti, cio lantigene, lanticorpo e ilcomplesso antigene- anticorpo.Un modo per determinare linterruzione del legame antigene- anticorpo aumentare la concentrazione di uno dei duecomponenti. Un altro modo pu essere variare il pH, vari modi che si usano in diagnostica per recuperare ad esempio unAb dopo determinate reazioni.

    Altro aspetto: rapporto reciproco nella concentrazione tra un determinante antigenico, un antigene solubile, elanticorpo, molto importante nello stabilire il tipo di reazione che avviene, e il fatto che questa reazione possa essereresa rilevabile direttamente oppure no.

    Quando c unequivalenza nelle concentrazioni, si formano dei complessi con legami a ponte tra vari anticorpi eantigeni, e questi complessi diventano insolubili e tendono a precipitare. Quindi noi abbiamo una visione direttadellavvenuta reazione antigene- anticorpo.Se invece:

    (nel primo caso a sinistra) abbiamo un eccesso di anticorpi; lantigene cos poco che pu andare a legarsi solo aqualcuno dei siti di combinazione di quelli disponibili, quindi non si pu creare il lattice cos detto, che quello alcentro.Una situazione analoga ma inversa si crea quando si ha un eccesso di antigene; questo pu avvenire anche se lantigene corpuscolato.

    Reazioni di agglutinazione Widal-Wright: immaginiamo che lantigene sia una Salmonella, e che lanticorpo sia direttoverso uno degli antigeni che ci interessa vedere nella salmonella. Abbiamo una sospensione di Salmonelle aconcentrazione costante, e abbiamo il siero di un soggetto in cui vogliamo vedere se ci sono anticorpi diretti versoquesto particolare antigene della Salmonella. Noi possiamo mettere direttamente a contatto il siero del soggetto con lasospensione, pu darsi che ci sia una agglutinazione (quando si forma il complesso delle cellule si dice che si passa adagglutinazione) e si vede abbastanza bene ad occhio nudo; oppure possiamo non vedere niente, rimane una sospensioneuniforme e omogenea. Questo non ci autorizza a dire che il soggetto negativo, perch io potrei avere una tale

    concentrazione di anticorpi nel siero del soggetto da realizzare la situazione descritta nella figura a sinistra; quindi hotalmente tanto anticorpo che non riesce a fare ponte tra una cellula allaltra e ad agglutinare; il cosiddetto fenomenodella prozona.Se io poi faccio delle diluizioni sequenziali, se positivo ad un certo punto mi compare lagglutinato, nella zona diequivalenza; linverso della diluizione che mi d lagglutinato si chiama TITOLO ANTICORPALE.Se continuo a diluire la reazione si negativizza; quindi fare una siero diagnosi di Widal- Wright per la Salmonellasignifica cercare la presenza degli anticorpi con questo sistema e determinarne il titolo; una valutazionesemiquantitativa.Se io lo faccio oggi e ho un titolo di uno a centosessanta, lo rifaccio allo stesso soggetto dopo una settimana e ce lhouno a 640, io ho un titolo che sta salendo: il soggetto sta attivamente producendo anticorpi.Poi io posso anche evidenziare se gli anticorpi presenti sono di tipo IgG o di tipo IgM, mi basta utilizzare un anticorpoanti-IgG o anti-IgM.

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    Specificit:capacit di discriminare non solo tra self e non self,ma nellambito del self e del non self tra una sostanza elaltra.Lanticorpo quello che pi facile,in qualche modo, da evidenziare per quanto riguarda questa caratteristica.Allora,trasferiamo questo,per esempio,anche a livello del recettore.Il recettore del B limmunoglobulina,il recettoredel T appartiene alla superfamiglia delle immunoglobuline.La struttura analoga ed anche i processi di ricombinazione che portano alla sua sintesi sono analoghi. Quindi noi

    partiamo adesso vedendo com che si arriva ad avere una proteina che,per unidentit di alcune parti della suastruttura,ha una differenziazione enorme per unaltra parte che quella che determina la specificit. Allora,comericorderete dalle lezioni degli anni scorsi,questo dovuto al fatto che limmunoglobulina o la singola catenapolipeptidica che entra nella composizione dellimmunoglobulina non risponde alla legge un gene-una proteina o unacatena,ma risponde ad unaltra norma che una catena-pi segmenti genici. Allora,per chiarirci in alto abbiamo illinfocita B e a destra limmunoglobulina completa,in questo caso di membrana. Allora,riporta lo schema che abbiamovisto la volta scorsa,cio abbiamo una parte costante e una parte variabile per ciascuna delle catene pesanti eleggere.Nel dominio variabile,in alto,ci sono delle zone tratteggiate pi scure che corrispondono alle parti ipervariabiliche vanno a determinare la cosiddetta regione che determina la complementariet o CDR,che sono tre per una catena eper laltra. Allora,quello da chiarire che la parte costante codificata da un gene,la parte variabile codificata da tresegmenti genici assemblati per la catena pesante,da due per la catena leggera. Quindi quei 110 amminoacidi cheformano la parte variabile richiedono praticamente nella catena pesante tre segmenti genici che vanno a formareinsieme un unico gene funzionale variabile, mentre tutto il resto codificato da un gene che codifica per la parte

    costante,diverso a seconda della classe immunoglobulinica.Quindi vi ho portato anche questa diapositiva perch segnalato anche il fatto che esiste un recettore pre-B o sepreferite un pre-recettore B e questo ve lo segnalo perch vorrei,lo faremo la volta prossima,per che questo processo diricombinazione tra i vari segmenti,di variazione nei punti di congiungimentovenisse contestualizzato in un processodi maturazione della cellula,che quello che avviene negli organi linfatici primari:nel midollo osseo per i B e nel timoper i T. E in questo processo di maturazione la sintesi di un recettore efficiente lo scopo di tutta la maturazione stessa.E la prima tappa di successo,un elemento di sopravvivenza per la cellula proprio la sintesi e lesposizione di un pre-recettore,sia per i B sia per i T. Quindi tutta la maturazione di queste due linee cellulari cos importanti finalizzataallacquisizione di caratteristiche cellulari,di membrana,in modo particolare del recettore con la sua specificit,cheviene acquisita nellorgano linfatico primario,quindi prima di qualsiasi contatto con sostanze esterne.Per il B qui c la maturazione dalla cellula pro-B,una cellula staminale,fino al linfocita B col suo recettore dimembrana :PRO-B CELL -- PRE-B CELL -- B-CELL-- PLASMA CELL

    Qui sotto riportato il patrimonio genetico di una qualsiasi nostra cellula. Tutte le nostre cellule sono dotate di tutti isegmenti genici che qui vedete,cos disposti. Questa la linea germinale cosiddetta.Soltanto nei linfociti B,e solo in loro,cominciano quei processi che porteranno alla fine a livello del DNA ad unaformazione di un gene variabile,che quello nella penultima riga,V-D-J,che potr essere di volta in volta trascrittounitamente a uno qualsiasi dei geni che codificano per le varie catene pesanti. Per il gene variabile sempre quello.Struttura:Ricordiamocelo, parte costante e parte variabile. Stesso discorso vale per i T. Ve lo cito perch cos quando arriveremoal T in pratica gi fatto. Anche l abbiamo un dominio costante e un dominio variabile per ciascuna catena. Ilrecettore dei T un eterodimero con due catene :a e b oppure g e d. La struttura,sempre lestremit N terminale coldominio variabile verso lesterno, laltra estremit transmembrana e poi allinterno del citoplasma. Ricordate questadiapositiva,labbiamo vista la volta scorsa,queste sono le catene leggere e abbiamo visto che ci sono delle posizioni incui la variabilit amminoacidica massima e vedete che il CDR3,quindi intorno allamminoacido 100,rappresenta unodei punti di massima variabilit tra i tre. Se guardiamo la catena pesante idem, sempre il CDR3 che ha la massima

    variabilit.Adesso vediamo quali sono i geni o i segmenti genici che codificano per queste parti che poi noi vediamo tradotte inproteine. Allora,per quanto riguarda le immunoglobuline i geni sono disposti su tre cromosomi:

    CATENA PESANTE: CROMOSOMA 14 CATENA LEGGERA:

    KCROMOSOMA 2L CROMOSOMA 22

    Il discorso si applica in modo molto simile per tutti e tre. Allora,la caratteristica qual ? Che tutte le nostre cellule,comevi ho detto,hanno nel DNA dei geni definiti VH sul cromosoma 14. Questi geni o segmenti genici,V da variabilit. Ilnumero di questi segmenti genici molto elevato,qui sono riportate 45, abbastanza recente. Poi esistono altri segmentigenici che si chiamano D (diversit) e qui ne abbiamo 23. Poi abbiamo degli altri segmenti genici che vengono definiti Jo joing perch stanno tra la parte di cromosoma che ospita i geni per la parte costante delle catene pesanti e quelli che

    invece ospitano quelli per la parte variabile.Allora,questo un patrimonio che abbiamo in tutte le cellule;cos che fa diversi i linfociti B da tutte le altre cellule? Ilfatto che nel midollo osseo la cellula staminale che comincia a diventare qualcosa che non pi cellula staminale e non neanche un pro-eritroblasto o pro quello che volete, ma diventa un pro-linfoblasto B,cosa succede? Che a livello del

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    cromosoma 14 comincia un fenomeno di ricombinazione: il primo fenomeno interessa sempre la catena pesante,quindisempre il cromosoma 14 e la prima ricombinazione che avviene sempre quella tra D e J. Quindi,solo successivamentese va a buon fine la sintesi e anche la trascrizione e la sintesi, della catena pesante cominciano i fenomeni diricombinazione su uno degli altri due cromosomi:il 22 oppure il 2. A proposito della catena leggera noterete che inquesto caso i segmenti genici che devono provvedere alla parte variabile sono solo V e J,mancano i segmenti D(diversit).

    Allora,in questo caso abbiamo chiaramente una catena leggera,manca il D,praticamente si ha unaltra caratteristica deilinfociti sia B sia T,che sono gli unici in grado di sintetizzare dei complessi enzimatici che vengono definiti RAG o,sepreferite,i geni che codificano per questi complessi enzimatici si chiamano RAG che sta per:geni che attivano laricombinazione. Sono RAG 1 e 2 e sono fondamentali perch possa avvenire questo processo che non avviene in altrecellule. In altre cellule i geni ci sono ma anche questi non vengono trascritti e quindi non si ha la produzione deglienzimi. In pratica si ha lavvicinamento,diciamo cos,in questo caso una catena leggera,di uno dei vari geni V ad unodei vari geni J,la parte di DNA interposta viene eliminata grazie a delle DNasi e si ha,diciamo,una saldatura,se voletedir cos,tra le due porzioni di DNA. Nel punto di giunzione per,sapete,non che il taglio da parte delle nucleasiavvenga in maniera precisa tra una tripletta e laltra,pu cadere allinterno di una tripletta e dar luogo a dei codoni chenon sono funzionali,allora si pu avere laggiunta da parte di altri enzimi,per esempio la desossinucleotidil transferasi,dinucleotidi per completare la tripletta. Allora,abbiamo multipli segmenti,una ricombinazione tra questi segmentiassolutamente random,quindi casualissima,ma soprattutto abbiamo questa generazione di diversit legata allaggiunta dinucleotidi nel punto di ricombinazione. Per cui,se anche io avessi lo stesso segmento genico J e lo stesso segmento

    genico V ricombinati,la possibilit statistica di avere lo stesso gene che codifica per la stessa parte variabile minimaperch laggiunta di nucleotidi cambia comunque la sequenza amminoacidica che viene trascritta.Questo per dire che se noi vogliamo stabilire,per esempio,se una determinata cellula B o non B(qualche volta puessere molto importante:una leucemia acuta pu essere talmente differenziata che non ha n indicatori morfologici,n dimembrana tali da poterci dare delle indicazioni,per noi possiamo cercare se ha cominciato a ricombinare il proprioDNA) non abbiamo ancora nessuna proteina che ci indichi che un B,neanche una proteina citoplasmatica come lacatena m,tanto meno un recettore sulla superficie,per possiamo vedere se ha cominciato a ricombinare.Se non haricombinato,facendo un southern blot,cio andando a vedere il DNA,vediamo che abbiamo una banda di 6 kDalton checorrisponde ad una grossa quantit di DNA che quello non ricombinato che presente in tutte le cellule non B. Mentrequi abbiamo due cloni di cellule B ed presente la quota di 6kDalton,ma la quota pi abbondante data dalle altre duebande,dove il grosso del DNA gi ricombinato e ha avuto gi la sua sezione di una parte(?). Questo vale per i B e valeper i T,grosso modo,visto che i processi sono analoghi,per capire se una cellula altamente differenziata, che nonpossiamo assolutamente etichettare in nessun modo,morfologicamente o con marcatori di membrana,possiamo andare a

    vedere se ha ricombinato,per esempio,a livello del DNA per le immunoglobuline oppure per il TCR e questo ci d gidelle indicazioni.Questa laggiunta dei nucleotidi e corrisponde al fatto che,in questa fase,lo vedremo,le cellule sia T sia B,esprimonogeni e li trascrivono e sintetizzano lenzima TDT,che molto importante nel determinare questa variabilit giunzionale.Ecco,questo per esempio,partendo dallo stesso corredo genetico si pu arrivare ad avere,da una cellula staminaleindifferenziata,attraverso la ricombinazione,tre cloni differenti di cellule B, ciascuna con la propria specificit.Badate,questo della generazione di diversit il punto chiave del sistema immunitario. Se un sistema immunitario non in grado di generare una diversit sufficiente o non in grado di riconoscere alcuni antigeni,questo comportaunimmunodeficienza perch il giorno in cui avviene il contatto con quel determinato antigene che magari presente suun patogeno,allora la mancanza di risposta,non risposta negativa,ma proprio il mancato riconoscimento teorico perchmanca nella generazione di diversit quel singolo recettore che non stato prodotto,si hanno conseguenze catastrofiche.Ma quello che dobbiamo pensare che,con questo sistema,praticamente noi abbiamo una potenzialit di recettoridiversi pari a 10^11,praticamente non abbiamo mai un numero di cellule in circolo B che possono esprimere tutti i

    recettori contemporaneamente, quindi siamo attrezzati per tutti gli antigeni,anche quelli di sintesi,e c tuttora unasovrabbondanza di recettori.Notate bene che T hanno ancora una diversit recettoriale notevole. Questa diversit si crea durante la maturazione dablasto,da cellula staminale al linfocita B o rispettivamente T.Allora,come avviene? Primo sempre il cromosoma 14 e per primo ricombina sempre D-J. Successivamente uno deigeni V viene ricombinato random con D-J. Questa sequenza V-D-J che abbiamo ricombinato a livello del DNA vienetrascritta come tale assieme a tutto il resto del cromosoma su un trascritto di RNA primario. Badate che importante!Perch importante? Perch non viene ricombinato a livello di DNA il V-D-J pi una catena pesante,no,i geni dellecatene pesanti rimangono integri sul cromosoma 14,lunica cosa che viene ricombinata,modificata in modopermanente,sono i geni della parte variabile che vengono ricombinati in modo da dare un gene funzionale per la partevariabile,V-D-J. Questo viene anche trascritto e solo successivamente la parte di DNA interposta tra il V-D-J e il geneper la parte costante selezionato con la trascrizione viene eliminato,ma a livello di splicing dellRNA. Il patrimoniogenetico con il DNA rimane intatto ed questo che ci consente nella prima risposta di dare anticorpi IgM e nellaseconda risposta, sempre utilizzando lo stesso V-D-J,quindi la stessa specificit,di invece trascrivere,utilizzare adesempio g o a, fare lo splicing dellRNA e quindi produrre una catena di tipo a con quella specificit.

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  • 8/7/2019 Lezione 03 (22-11-06) Immunologia

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    Allora,una volta che andata a buon fine la sintesi della catena m si ha il blocco della ricombinazione a livello delcromosoma 14. Quindi,siccome di cromosomi ne abbiamo due,si attiva su uno,automaticamente se la ricombinazione ela trascrizione vanno a buon fine si ha lesclusione dellaltro allele.Finito questo comincia random la ricombinazione o sul cromosoma 2 o sul 22: V-J e poi sempre trascrizione RNAprimario,splicing e poi labbinamento delle due catene.Noterete quindi che la parte variabile codificata dal gene funzionale V-D-J per la catena pesante e V-J per la catena

    leggera.Allora,qual il recettore pre-B? Il recettore pre-B,quando il linfocita B ottiene il primo successo sintetizza la catenam,la troviamo nel citoplasma sola,isolata e poi viene portata sulla superficie cellulare assieme ad una catena leggerafissa,invariante,in attesa di attivare la trascrizione e di sintetizzare la catena leggera definitiva. Quello il recettore pre-B che quello che assicura la sopravvivenza di quella cellula.Quando arriva a buon fine anche la trascrizione,lo splicing e la sintesi della catena leggera,allora si ha la formazionedellimmunoglobulina completa,come tetrametro,con due catene pesanti uguali e due catene leggere uguali che vieneespressa sulla superficie cellulare.A questo punto c un altro fenomeno,anche qui c il blocco per quanto riguarda il cromosoma 2 dellallele,se ilcromosoma 2 che ha formato la catena K,il cromosoma 22 verr anchesso inibito.Per se il recettore espresso sulla superficie cellulare nel midollo osseo mostra unaffinit di legame recettoriale perautoantigeni molto elevata si ha una ripresa della ricombinazione,praticamente la trascrizione e la sintesi della primacatena leggera viene abortita e si riattiva sullaltro cromosoma per la catena leggera,per esempio il 22 nel nostro caso,la

    ricombinazione V-J la trascrizione e la sintesi in questo caso di catena L. Viene di nuovo legata la catena m che era gistata sintetizzata e viene espresso un nuovo recettore e questo non ha autoaffinit per cellule . Questo fenomeno sichiama editing(?) recettoriale. Cio,mentre nel T se la cellula ha autoaffinit per gli autoantigeni del timo va in apoptosie basta,muore,alla cellula B viene concessa una chance di sopravvivenza sfruttando la seconda catena leggera che ha adisposizione in sintesi perch presumibilmente la specificit complessiva sar diversa.

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