Lesioni squamose intraepiteliali: possiamo predirne l’evoluzione?

Franco Fulciniti Servizio di Citopatologia Clinica Istituto Cantonale di Patologia

Locarno, CH

Caso Clinico: storia di un ASC-US

• BM, nata 05 /91: esegue primo pap test a 16 a., nel 2007, con risultato negativo;

• 2 pap test praticati nel 2009 e nel 2010 sono negativi;

• Un ulteriore pap test, praticato nel 2012 mostra cellule squamose atipiche di significato indeterminato (ASC-US);

• HR-HPV test ( Cobas): + ( non 16, non 18).

Colposcopia del 18.01.2012

• ATZ a limiti netti nel fornice vaginale posteriore, con piccola area sospetta per lesione citopatica da HPV;

• Escissione: LSIL della parete vaginale;

Nuovo controllo del settembre 2012

• Esegue pap test di controllo il 13.09.2012, con diagnosi di LSIL;

• La colposcopia identifica una piccola area sospetta a livello della cervice uterina, sulla quale si effettuano biopsie multiple, con diagnosi istologica di LSIL-CIN 1.

Nuovo controllo del 26.05.2014

• Un pap test ripetuto evidenzia nuovamente una lesione ASC-H;

Controllo del 03.08.2015

• Un pap test ripetuto evidenzia una lesione ASC-H;

• Dal sedimento si prepara un cell-block, colorato con H.E.

• Viene effettuato un CIN TEC Plus test (doppia immunocolorazione per proteina p16 e Ki67, con risultato positivo.

Conizzazione

• CIN 2-3 della zona di transizione; margini di escissione liberi da lesioni.

Definizione di biomarcatore

• Indicatore biologico, genetico o biochimico che può essere messo in relazione con l’insorgenza o lo sviluppo di una patologia, come la presenza di un agente infettivo o l’esistenza di un tumore.

• Le caratteristiche richieste a un buon marcatore biologico sono: (a) elevata sensibilità e specificità per malattia; (b) elevato valore predittivo positivo e negativo (c) la possibilità di essere misurato o quantizzato in maniera oggettiva, possibilmente in tempi brevi; (d) di essere relativamente insensibile a errori di campionamento.

Enciclopedia Treccani, 2008 ( modificato)

Biomarcatori in citopatologia cervico-vaginale: desiderata

• Aumento della sensibilità e della specificità diagnostica nelle lesioni indeterminate: ASC-US, ASC-H AGC;

• Riduzione del numero delle colposcopie e procedure bioptiche innecessarie;

• Predizione prognostica del rischio di CIN 2+ nelle categorie indeterminate;

• Miglioramento dell’accuratezza diagnostica nelle lesioni neoplastiche ghiandolari.

Biomarcatori disponibili

• HR-HPV test ( HC2, Cobas, Seegene, others);

• Proteina capsidica L1 del virus HPV;

• Proteine del ciclo cellulare ( p16INK4a, Ki 67 e loro combinazioni: CINTEC plus)

• Marcatori di instabilità genomica: (Topoisomerasi 2A: Top2A; proteine di mantenimento dei minicromosomi MCM2, 4 e 5);

HR-HPV test: vantaggi e svantaggi

• Alta sensibilità per infezione virale: > 90%

• Scarsa specificità per lesioni preneoplastiche;

• Già usato per lo screening primario in alcuni paesi europei;

• Possibilmente poco utile nelle classi di età 21-30 a, per la larga prevalenza dell’infezione virale;

• Genotipizzazione utile nella diagnosi di infezione persistente: Categoria HPV non 16-18 altamente predittiva di persistenza o progressione*;

*Lyons YA et al: Cancer Cytopathol 2015: 123(7): 435-42

Proteina capsidica L1 del Virus dell’HPV

• Espressa nella fase replicativa dell’infezione da HPV, nelle cellule squamose intermedie;

• Prodotta nelle infezioni episomali, in rapporto alla riproduzione virale, specie nei casi con scarsa o assente integrazione genomica dell’HPV nella cellula ospite;

• I virioni vengono liberati lentamente nello strato superficiale dell’epitelio squamoso per danno ossidativo dei ponti disolfuro, i quali legano le subunità pentameriche del capside.

• Solo in questa fase le proteine capsidiche possono essere riconosciute (ed aggredite) dal sistema immunitario cellulo-mediato ( cellule dendritiche intraepiteliali, o di Langerhans e cellule effettrici sensibilizzate);

• Il rilascio di virioni favorisce l’infezione di altre cellule epiteliali squamose.

Espressione di proteina L1

• Può essere studiata mediante colorazione ICC; • La immunocolorazione è nucleare; • La presenza o assenza di espressione di proteina L1 nelle SIL

ha significato prognostico; • L’espressione di L1 comporta generalmente un elevato

potenziale di regressione di lesioni LSIL o HSIL; • La mancata espressione di L1, viceversa, comporta di

solito un elevato potenziale di progressione; • Esiste una zona grigia (persistenza di malattia).

Melhorn et al. Modern Pathology (2013) 26, 967–974

In Situ Hybridization, HR-HPV, pap smear

Proteina p16INK4a

• Nota anche come inibitore chinasico ciclino-dipendente 2a (CKDN2A) è una proteina con funzione onco-soppressiva;

• Gioca un ruolo importante nel controllo negativo della transizione G1-S del ciclo mitotico attraverso l’inibizione delle ciclino-chinasi CDK4 e CDK6;

• A loro volta CDK 4 e 6 possono fosforilare il pRB, favorendo così la progressione nella fase S del ciclo cellulare.

• P16INK4a (p16) è normalmente espressa in cellule senescenti o con differenziazione di tipo terminale.

Meccanismo Molecolare

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Infezione da

HPV

persistente Progressione

del ciclo

cellulare

Effetto paradosso da iperaccumulo

(mancato consumo) di p16

Vantaggi e svantaggi dell’immunocolorazione per p16

• Può essere eseguita colorazione sequenziale con Papanicolaou ( senza perdita del dettaglio citologico);

• Miglioramento dell’accuratezza diagnostica nell’ASC-US, nelle SIL e nelle lesioni ghiandolari dell’endocervice.

• Espressione di p 16 frequente in cellule normali (endometrio in ciclo, c. metaplastiche, atrofia).

• In istopatologia è uno standard per la diagnosi di CIN 2 ( espressione diffusa, a tutto spessore della lesione).

CIN tec PLUS™: un’ ulteriore miglioramento come biomarcatore rispetto a p16

• L’espressione di Ki 67 è direttamente proporzionale alla proliferazione cellulare;

• p16 può essere espresso nella senescenza cellulare e nella pre-neoplasia;

• La contemporanea espressione di un marcatore di proliferazione e di uno associato ad apoptosi e senescenza cellulare (p16), è segno di un grave disturbo del ciclo cellulare.

Conclusioni: PALMS study ( Primary Asc-us LSIL Marker Study)

• Usando CIN TEC plus il referral rate alla colposcopia per donne <30 con ASC-US si sarebbe ridotto del 50%;

• In tale gruppo di donne il PPV di CIN TEC plus per CIN2 e CIN 3 è dell’86%, superiore al test HPV-HC2;

• Nelle donne con CIN 1, usando CIN TEC plus, il referral rate sarebbe stato del 50%, con un tasso residuo di rischio per CIN3 < 2%, senza significative differenze per età;

• I risultati di tale studio sono sovrapponibili a quelli ottenuti in analoghi studi di tipo retrospettivo.

Linee guida per l’uso di CIN TEC PLUS

• Nella riduzione di indicazione a colposcopia in pz. con ASC-US ricorrente;

• Nello studio delle lesioni SIL persistenti;

• Nello studio delle lesioni ASC-H;

• Nelle lesioni ghiandolari.

Pro-Ex C™

• Proprietary brand name per un cocktail di 2 MoAb: anti TOP2a e MMP 4-6 ( BD);

• Sia TOP2a che MMP sono fortemente amplificate nell’instabilità genetica associata alle neoplasie;

• L’espressione di entrambe le proteine è nucleare, mediante un semplice test ICC.

Sintesi degli studi ProEX C

• Utile nella diagnosi differenziale tra adenoca. endocervicale vs. endometriale;

• Migliora la sensibilità della sola citologia nelle lesioni CIN 3+ (92% vs. 52%), ma peggiora lievemente la specificità ( 92% vs. 94,4%);

• Risultati molto simili a CINTEC plus, sia pur con maggiore sensibilità e specificità di quest’ultimo.

Conclusioni

• Nella scelta dei biomarcatori in patologia cervico-vaginale, vanno privilegiati quelli che possono essere determinati simultaneamente sullo stesso campione biologico;

• L’adozione giudiziosa dei biomarcatori si traduce in maggior efficacia clinica, con conseguente riduzione del numero di colposcopie e di test invasivi ed un uso mirato di questi ultimi ai casi nei quali vi sia effettiva indicazione.

Grazie per la vostra attenzione