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LE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE DELLE CELLULE

VEGETATIVE

La morfologia delle cellule vegetative, ovvero il loro aspetto, può essere osservata solo

attraverso l’osservazione microscopica, in quanto le loro dimensioni (1-10 µm = 10-3-10-2 mm)

sono troppo ridotte e non permettono la visione ad occhio nudo.

Il microscopio è in grado non solo di ingrandire l’immagine delle cellule, ma anche di risolverla

efficacemente, permettendo di vedere immagini ben separate fra loro.

La morfologia delle cellule batteriche può essere esaminata al microscopio in due modi:

ESAME MICROSCOPICO A FRESCO: consiste nell’osservare i microrganismi vivi tal quali,

cioè non colorati, e permette una visione reale e non distorta delle cellule batteriche. L’esame

viene effettuato su materiale liquido o reso tale per diluizione o sospensione con acqua e ha lo

scopo di osservare la forma e la disposizione delle cellule batteriche, oltre che l’eventuale

mobilità. L’efficacia dell’osservazione non è molto elevata con un normale microscopio a luce

riflessa, in quanto le cellule batteriche, essendo incolori, risultano scarsamente contrastate

rispetto al mezzo liquido in cui sono sospese; risultati migliori si ottengono utilizzando un

microscopio ottico a contrasto di fase.

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE: consiste nell’osservare i

microrganismi, in alcuni casi vivi, in altri morti, colorati. Sebbene i batteri non abbiano un

aspetto molto diverso dal loro ambiente circostante, essi differiscono chimicamente e quindi i

coloranti reagiscono in modo diverso con la cellula batterica e con ciò che la circonda. I vantaggi

principali dell’esame microscopico mediante colorazione rispetto all’esame a fresco consistono

nel fatto che essa, oltre a fornire un maggior contrasto tra i microrganismi e l’ambiente

circostante che permette perciò di osservare in modo più efficace la forma e la disposizione

delle cellule batteriche e in alcuni casi anche l’eventuale mobilità (tecniche di colorazione

semplice), consente la differenziazione fra i vari tipi morfologici (tecniche di colorazione

differenziale) e favorisce lo studio di alcune strutture della cellula (tecniche di colorazione

strutturale). Attualmente il microbiologo dispone di una vasta gamma di tecniche di colorazione,

tutte quante facenti uso di sostanze chimiche in grado di apportare colore (coloranti) e di fissare

il colore (mordenzanti).

CLASSIFICAZIONE,NOMENCLATURA E MORFOLOGIA DELLE CELLULE

BATTERICHE

Per uno studio ordinato e sistematico dei microrganismi occorre conoscere la loro collocazione tra gli esseri

viventi nell’ambito di una classificazione razionale.

Attualmente il tipo di classificazione più seguito è quello di Whittaker o “dei cinque regni”:

1. il primo livello, Monera (procariota), è costituito dagli esseri che si sono formati per primi circa tre

miliardi e mezzo di anni fa;

2. il secondo livello, Protista (eucariota unicellulare), corrisponde a organismi più recenti rispetto al

precedente;

3. il terzo livello è costituito dagli organismi più complessi, ripartiti in altri te regni, cioè Plantae

(piante: eucarioti pluricellulari), Fungi ( funghi: eucarioti uni e pluricellulari ) e Animalia (animali:

eucarioti pluricellulari).

Per i microrganismi, però, viene ancora largamente adottata la classificazione di Haeckel che li inserisce

nel regno dei Protisi, cioè di organismi primitivi e unicellulari. In tale regno essi vengono suddivisi

ulteriormente in base al loro grado di evoluzione e, di conseguenza, in base alla loro complessità cellulare.

Si distinguono così microrganismi a struttura cellulare di tipo procariota ed eucariota, come rappresentato

nella seguente figura:

I microrganismi procarioti per eccellenza sono rappresentati dai batteri e ci si riferisce ad essi per

descrivere la struttura fine della cellula procariota (vedi figure alla pagina successiva).

Forma della cellula batterica

La cellula batterica può assumere diverse forme, ma quelle più diffuse sono quelle assimilabili:

a sfera o cocchi

a cilindro bastoncino o bacilli o bastoncelli

a virgola o vibrioni

a spirale o spirilli

Accanto a questi modelli morfologici esiste

una varietà di forme non assimilabili a

figure geometriche ben definite in quanto

irregolari e non costanti.

Disposizione geometrica della cellula batterica

I batteri, qualunque sia la loro forma, possono associarsi con disposizioni particolari e caratteristiche della

specie a cui appartengono, che dipendono dagli elementi geometrici che si generano sul piano e nello

spazio tra le cellule figlie quando queste, avvenuta la scissione che le genera, non si separano. Nelle

seguenti pagine sono illustrate le disposizioni geometriche dei cocchi e dei bacilli.

DISPOSIZIONI GEOMETRICHE DELLA FORMA SFERICA o COCCACEA

Tipiche forme coccacee (a) Staphylococcus aureus, striscio colorato con il metodo Gram (x1500).

(b) Stafilococchi disposti a grappolo, microscopia elettronica a scansione (x34000).

(c) Streptococcus pyogenes, (x400).

(d) Streptococcus, microscopia elettronica a scansione (x33000).

(e) Micrococcus luteus, microscopia elettronica a scansione (x33000).

(f) Streptococcus pneumonite, colorazione basica al blu di metilene (x1000)

DISPOSIZIONI GEOMETRICHE DELLA FORMA CILINDRICA O A BASTONCELLO

Cellule a bastoncello

9.2. COLORANTI E MORDENZANTI

Una sostanza chimica per essere colorata deve contenere all’interno della sua molecola dei gruppi

cromofori, cioè raggruppamenti atomici che conferiscono colore alla molecola. Un cromoforo è, più

genericamente, un gruppo le cui transizioni elettroniche danno luogo ad assorbimento nel visibile e nel

vicino UV; si possono così definire cromofori tutti i gruppi insaturi in genere, come C=C, C=O, N=N, i

sistemi insaturi coniugati, gli anelli aromatici, ecc. Una sostanza colorata mostra il colore complementare a

quello che assorbe: ad esempio, una sostanza che presenta un massimo di assorbimento a 530 nm (zona

del verde: 490-570 nm), apparirà ai nostri occhi di colore rosso (zona del rosso: 640-790 nm).

Una sostanza colorata, contenente cioè un gruppo cromoforo, non è però ancora considerabile colorante in

senso stretto. Un composto chimico per essere definito colorante deve contenere all’interno della sua

molecola, oltre a dei gruppi cromofori, anche uno o più gruppi auxocromici, cioè raggruppamenti atomici

in grado di legarsi chimicamente ad un determinato substrato, rafforzando così l’effetto del gruppo

cromoforo e aumentandone la sua intensità colorante. Un auxocromico è un gruppo donatore di elettroni,

cioè un nucleofilo, tipo: -NH2 ammino, -NHR alchilammino, -NR2 dialchilammino, -OH ossidrile, -OCH3

metossile, -SH mercapto, -I- ioduro, -Br- bromuro, -Cl- cloruro.

I coloranti utilizzati in batteriologia possono essere utilizzati in soluzione alcoolica, idroalcoolica o acquosa.

COLORANTI BASICI:i coloranti sono definiti basici quando la specie chimica colorante è uno ione

positivo colorato e colorante, derivante cioè dalla dissociazione in acqua di un sale di una base organica:

BX(s) OH2

BX(aq) B+ + X

dove: B composto organico con caratteristiche basiche BX sale della base organica B+ ione positivo colorato e colorante

I coloranti basici (in genere cloruri di composti contenenti azoto pentavalente) presentano un’elevata

affinità per le specie chimiche caricate negativamente, pertanto reagiscono mediante scambio ionico con le

sostanze proteiche presenti sulla superficie delle cellule e con le sostanze acide presenti al loro interno

(acidi nucleici) e riescono a penetrare all’interno della cellula batterica colorandola, mentre l’ambiente

circostante rimane pressoché incolore.

Esempi di coloranti basici sono: il Blu di Metilene, il Violetto di Nicolle, il Violetto di Genziana, la

Fucsina, la Safranina.

COLORANTI ACIDI: i coloranti sono definiti acidi quando la specie chimica colorante è uno ione

negativo colorato e colorante, derivante cioè dalla dissociazione in acqua di un sale di un acido

organico:

AMe(s) OH2

AMe(aq) A + Me+

dove: A composto organico con caratteristiche acide AMe sale dell’acido organico A ione negativo colorato e colorante

I coloranti acidi (in genere sali alcalini di gruppi caricati negativamente, come i carbossili, COOH, e gli

ossidrili fenolici, OH), grazie alla loro carica negativa, presentano un’elevata affinità per le strutture

cellulari a carica positiva, pertanto hanno difficoltà a penetrare all’interno della cellula batterica che è

spiccatamente basofila per l’elevata presenza di sostanze acide e perciò vengono utilizzati quali coloranti di

contrasto: la parete delle cellule batteriche risulterà intensamente colorata in quanto costituita da molecole,

soprattutto proteine, che trasportano una carica positiva, mentre l’interno della cellula apparirà incolore o

solo leggermente colorato perché ricco di sostanze che trasportano una carica negativa, mentre l’ambiente

circostante assume la colorazione propria del colorante.

Esempi di coloranti acidi sono: l’Eosina, la Fucsina acida, la Nigrosina.

MORDENZANTE o MORDENTE :è una sostanza che presenta affinità chimica sia nei confronti del

colorante che i quelli della cellula batterica, perciò è in grado di accrescere il legame che si instaura tra la

cellula batterica e il colorante, cioè aiuta a fissare maggiormente il colorante sulla cellula. Sotto l’azione di

un mordente una cellula batterica viene colorata più intensamente ed è perciò più difficile lavar via la

colorazione.

Esempi di mordenti sono i composti organici e inorganici acidi e basici, i loro sali metallici e lo iodio,

che possono essere uniti al colorante nella preparazione della sua soluzione, oppure utilizzati in soluzione a

sé stante dopo la colorazione stessa.

ESAME MICROSCOPICO A FRESCO

Per esame microscopico a fresco si intende l’osservazione microscopica dei microrganismi vivi,

tal quali e non colorati.

Il preparato può essere allestito su vetrino semplice oppure su vetrino di Koch.

Materiale occorrente coltura di lavoro del microrganismo in esame in BTS

1 vetrino portaoggetto semplice con vetrino coprioggetto 1 vetrino portaoggetto a goccia pendente (di Koch) con vetrino coprioggetto 1 pinza di legno o di metallo 1 ansa di metallo bunsen microscopio

Allestimento del vetrino semplice

Aprire provetta contenente la brodocoltura in esame e flambarla velocemente.

Sterilizzare l’ansa di metallo per arroventamento sulla fiamma del bunsen, farla raffreddare per 20-30secondi all’aria, quindi prelevare un’ansata della brodocoltura e depositarla, strisciando l’ansa, sullaparte centrale del vetrino semplice portaoggetto.

Riflambare prima di richiuderla la provetta con la coltura di lavoro e il suo tappo.

Tenere il vetrino coprioggetto in mano e depositarlo in modo esattamente parallelo sulla goccia dipreparato depositata sul vetrino portaoggetto; in alternativa tenere il coprioggetto in posizione obliqua estrisciarlo sulla coltura. In entrambi i casi occorre evitare la formazione di bolle d’aria tra i due vetrini.

Allestimento del vetrino di Koch

Depositare sul bordo esterno della cavità emisferica del vetrino di Koch uno strato sottilissimo divasellina, facendo attenzione a non farla entrare nella cavità.

Aprire provetta contenente la brodocoltura in esame e flambarla velocemente.

Sterilizzare l’ansa di metallo per arroventamento sulla fiamma del bunsen, farla raffreddare per 20-30secondi all’aria, quindi prelevare un’ansata della brodocoltura e depositarla, strisciando l’ansa, sullaparte centrale del vetrino coprioggetto.

Riflambare prima di richiuderla la provetta con la coltura di lavoro e il suo tappo.

Sovrapporre il vetrino di Koch al vetrino coprioggetto, facendo combaciare la sua cavità con la goccia dicoltura. Premere delicatamente in modo che la vasellina depositata sul bordo della cavità faccia daadesivo tra i due vetrini, quindi capovolgete rapidamente: la goccia di coltura deve pendere all’internodella cavità.

Osservazione microscopica

Osservare al microscopio con l’obiettivo 100x ad immersione in olio, leggendo le relative istruzioni d’usodel microscopio.

Le cellule batteriche appaiono come forme trasparenti praticamente incolori, contorniate da un sottile bordo più scuro, su fondo illuminato anch’esso incolore.

Descrivere la forma e la disposizione e l’eventuale mobilità delle cellule vegetative delmicrorganismo in esame, facendo uso dei termini riportati nella precedente illustrazione.

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE SEMPLICE POSITIVA

O BASICA

Così chiamata perché utilizza un solo (semplice) colorante basico per volta.

Dato il carattere acidofilo del colorante basico (già spiegato in precedenza), esso penetrerà

all’interno delle cellule batteriche colorandole (alcuni dei coloranti basici disponibili contengono

anche un mordenzante, perciò la colorazione apparirà più intensa e persistente), mentre

l’ambiente circostante risulterà incolore.

Dato che tale tecnica di colorazione prevede l’uccisione dei microrganismi, è inutile utilizzare il

vetrino di Koch per osservare l’eventuale mobilità ed è perciò sufficiente preparare solo un

vetrino portaoggetto semplice con il relativo coprioggetto.


1 vetrino portaoggetto semplice con vetrino coprioggetto 1 pinza di legno o di metallo 1 ansa di metallo COLORANTI BASICI a disposizione: BLU DI METILENE (contiene anche il mordenzante fenolo) VIOLETTO DI NICOLLE (contiene anche il mordenzante fenolo) VIOLETTO DI GENZIANA (contiene anche il mordenzante ossalato di ammonio) FUCSINA FENICATA (contiene anche il mordenzante fenolo) SAFRANINA 1 bacinella per colorazioni con supporto di vetro spruzzetta con acqua distillata bunsen microscopio

Distensione della coltura

Questa fase del procedimento ha lo scopo di distendere uno strato sottile della coltura batterica sul vetrino semplice portaoggetto.

Sterilizzare l’ansa alla fiamma del bunsen e farla raffreddare all’aria.

Prelevare con tecnica sterile (flambando prima e dopo il recipiente) una goccia del brodo di coltura delmicrorganismo in esame e depositarla strisciando sul vetrino portaoggetto in modo da formare unostrato sottile ed uniforme.

Essiccamento della coltura

Questa fase del procedimento ha lo scopo di eliminare per evaporazione il solvente acqua, in modo che sul vetrino rimangano solo i microrganismi:

Reggere il vetrino in una zona non strisciata con la coltura con pinze di legno o di metallo e passarlovelocemente 2-3 volte sulla fiamma, in modo che questa lambisca appena lo striscio, fino a farevaporare tutto il liquido.

Fissazione della coltura

Questa fase del procedimento ha lo scopo di coagulare il protoplasma delle cellule, uccidendo così i microrganismi senza distorcerne le forme e le strutture e di far aderire le cellule al vetrino.

Reggere il vetrino con le pinze e portarlo a diretto contatto con la punta della fiamma per 1-2 sec (noneccedere con il tempo, altrimenti il vetrino si rompe).

Ripetere l’operazione altre 2-3 volte.

Colorazione con colorante basico (uno solo per volta)

Questa fase del procedimento ha lo scopo di mettere a contatto la coltura con il colorante basico prescelto, che, dato il suo carattere acidofilo, penetrerà all’interno delle cellule colorandole.

Appoggiare il vetrino sul supporto di vetro della bacinella per colorazioni.

Depositare sul preparato fissato 2-3 gocce di colorante e lasciarlo agire per circa 1-2 minuti.

Inclinare il vetrino per far scendere l’eccesso di colorante.

Lavare delicatamente con la spruzzetta di acqua dist. fino a che questa scende incolore e scolare l’acquarimasta.

Tamponare delicatamente il vetrino sopra e sotto con carta assorbente.

Coprire lo striscio colorato con il vetrino coprioggetto, cercando di non inglobare aria.



Le cellule batteriche appaiono colorate internamente su fondo illuminato incolore.

Descrivere la forma e la disposizione delle cellule vegetative del microrganismo in esame, facendouso dei termini riportati in precedenza (Esame microscopico a fresco).

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE SEMPLICE

NEGATIVA O ACIDA

Così chiamata perché utilizza un solo (semplice) colorante acido per volta.

Dato il carattere basofilo del colorante acido (già spiegato in precedenza), esso non riuscirà, di

norma, a penetrare all’interno delle cellule batteriche, ma ne colorerà solamente il contorno,

lasciando l’interno praticamente incolore.

Questa tecnica di colorazione non necessita della fase di fissazione dei microrganismi, perciò le

cellule rimangono vive e non artefatte. Si deve perciò utilizzare il vetrino semplice portaoggetto

con il vetrino coprioggetto; é bene non utilizzare il vetrino di Koch perché lo strato di colorante

apparirebbe come un campo troppo scuro all’osservazione microscopica.


1 vetrino portaoggetto semplice con vetrino coprioggetto 1 pinza di legno o di metallo 1 ansa di metallo COLORANTI ACIDI a disposizione: EOSINA FUCSINA ACIDA FUCSINA ACIDA MORDENZATA o COLORANTE DI MANEVAL (contiene anche i mordenzanti cloruro ferrico e fenolo) NIGROSINA 1 bacinella per colorazioni con supporto di vetro spruzzetta con acqua distillata bunsen microscopio

Colorazione con colorante acido (uno solo per volta) e distensione della coltura

Questa fase del procedimento ha lo scopo di distendere uno strato sottile del colorante e della coltura batterica sul vetrino; il colorante acido, dato il suo carattere basofilo, non penetra all’interno della cellula che perciò rimane incolore, mentre lo sfondo si colora.

Appoggiare il vetrino sul supporto di vetro della bacinella per colorazioni e deporre sul vetrino unagoccia di colorante.

Sterilizzare l’ansa e prelevare con tecnica sterile (flambando prima e dopo il recipiente) una goccia delbrodo di coltura e depositarla sul vetrino portaoggetto mescolandola con il colorante, strisciando conl’ansa in modo da formare uno stato sottile di liquido.


Questa fase del procedimento ha lo scopo di eliminare per evaporazione a temperatura ambiente il solvente, in modo che sul vetrino rimangano solo i microrganismi vivi.

Asciugare quasi completamente il preparato all’aria a temperatura ambiente, senza scaldare néfissare alla fiamma, quindi coprirlo con il vetrino coprioggetto cercando di non inglobare aria.



Le cellule batteriche appaiono incolori, o al massimo hanno il bordo colorato e l’interno praticamente incolore, su fondo intensamente colorato.

Descrivere la forma e la disposizione e l’eventuale mobilità delle cellule vegetative delmicrorganismo in esame, facendo uso dei termini riportati in precedenza (Esame microscopico a fresco).

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE STRUTTURALE

DELL’ENDOSPORA

Il termine strutturale deriva dal fatto che i coloranti utilizzati in questa tecnica di colorazione

colorano in modo diverso le varie strutture della cellula stessa, fornendo perciò un diverso

contrasto fra la struttura interessata alla colorazione, altrimenti invisibile perché di dimensioni

troppo ridotte, le altre strutture cellulari e l’ambiente circostante.

Le colorazioni strutturali sono spesso di tipo policromatico, in quanto utilizzano più di un

colorante per volta: il primo colorante interagisce indistintamente con tutte le strutture della

cellula, il secondo colorante, detto colorante di contrasto, colora o interagisce solo con

determinate parti della cellula che così vengono messe in contrasto sia con le altre strutture,

che con l’ambiente circostante.

Verranno di seguito proposte due tecniche di colorazione strutturale: quella per

l’endospora e quella per la capsula.

Numerosi batteri Gram positivi (vedi più avanti il significato del termine) sono in grado di

formare una caratteristica struttura cellulare molto resistente, detta endospora (o spora)

batterica. Queste strutture, a differenza delle cellule vegetative che le producono, sono dotate

di una straordinaria resistenza agli stress ambientali come il calore, le radiazioni ultraviolette, i

disinfettanti chimici e l’essiccamento, tanto da essere in grado di restare attive per lunghissimo

tempo, perciò impartiscono al microrganismo una specie di vita latente che gli permette di

sopravvivere in condizioni estreme e di rivitalizzarsi quando tali condizioni ambientali diventano

meglio sopportabili. A causa della loro resistenza e per il fatto che numerosi batteri sporigeni

sono patogeni pericolosi, le endospore batteriche rivestono una enorme importanza pratica nella

microbiologia industriale e medica. È per questo che risulta essenziale riuscire a sterilizzare le

soluzioni e gli oggetti solidi; le spore riescono infatti a sopravvivere all’ebollizione per una o più

ore e per ottenere un’adeguata sterilizzazione di molti materiali è necessario ricorrere alle

autoclavi.

Uno dei principali scopi delle spore batteriche è quello di aiutare la sopravvivenza della specie in

ambienti scarsamente dotati di umidità e di nutrienti.

Le endospore sono corpuscoli di forma tondeggiante più o meno schiacciata che misurano da

0,7 a 1,5 m e possono trovarsi in posizione diversa all’interno delle cellule batteriche: la

grandezza della spora e la sua posizione sono caratteristiche morfologiche e di classificazione.

Il microscopio ottico permette di osservare la presenza di una spora all’interno di un batterio.

Dato che sono difficilmente penetrabili dalla maggior parte dei coloranti, le spore vengono

spesso identificate come aree prive di colore in batteri colorati internamente con coloranti

basici. La tecnica di colorazione semplice, però, non è molto efficace, di conseguenza è

preferibile eseguire una doppia colorazione strutturale con coloranti basici.

L’endospora non si colora con le normali colorazioni ma, una volta colorata con un colorante

basico, resiste fortemente alla decolorazione e alla successiva colorazione con colorante basico

di contrasto.

La colorazione iniziale viene eseguita a caldo con Blu di Metilene (colorante basico), che

conferisce alle cellule batteriche compresa l’endospora un’intensa colorazione blu. La Safranina

(colorante basico) viene utilizzato come colorante di contrasto: l’endospora resta colorata di blu

anche dopo il lavaggio, mentre il resto della cellula e le cellule senza endospora perdono la

colorazione blu iniziale con il lavaggio e assumono la colorazione rosa-rossa del colorante di

contrasto.



vetrino semplice con il relativo coprioggetto seguendo il seguente procedimento.

Batteri formanti endospore


1 vetrino portaoggetto semplice con vetrino coprioggetto 1 pinza di legno o di metallo 1 ansa di metallo BLU DI METILENE (colorante basico iniziale) SAFRANINA (colorante basico di contrasto) 1 becher da 250 o 400 mL, supporto di vetro per colorazioni carta da filtro, spruzzetta con acqua distillata, bunsen, microscopio







Reggere il vetrino in una zona non strisciata con la coltura con pinze di legno o di metallo.

Passarlo velocemente 2-3 volte sulla fiamma, in modo che questa lambisca appena lo striscio, fino a farevaporare tutto il liquido.


Questa fase del procedimento ha lo scopo di coagulare il protoplasma delle cellule, uccidendo così i microrganismi senza distorcerne le forme e le strutture, e di far aderire le cellule al vetrino.



Colorazione iniziale con colorante basico Blu di Metilene

Questa fase del procedimento ha lo scopo di colorare indistintamente tutta la struttura cellulare con il colorante basico iniziale Blu di Metilene; l’operazione viene eseguita a caldo, in quanto il calore facilita la penetrazione del colorante nell’endospora difficilmente colorabile.

Riempire per metà con acqua distillata un becher da 250 o 400 mL e portate all’ebollizione.

Appoggiare sul becher un supporto di vetro per colorazioni e sistemare su questo il vetrino con lacoltura strisciata e fissata.

Coprire lo striscio con un pezzetto di carta da filtro e colorare abbondantemente con Blu diMetilene.

Lasciare il vetrino esposto ai vapori che si sviluppano dal bagnomaria per almeno 5 minuti, addizionandosopra alla carta altro colorante, in modo che essa risulti sempre ben bagnata di colorante.

Lavaggio del colorante basico iniziale

Questa fase del procedimento ha lo scopo di togliere la colorazione apportata dal colorante basico iniziale da tutte le strutture cellulari diverse dall’endospora: quest’ultima resterà colorata di blu in quanto, così come si colora difficilmente, altrettanto difficilmente si decolora, mentre l’altra parte della cellula si decolora.

Togliere il pezzetto di carta da filtro e lavare delicatamente con la spruzzetta di acqua dist. fino a chequesta scende incolore e scolare l’acqua rimasta.

Colorazione di contrasto con colorante basico Safranina

Questa fase del procedimento ha lo scopo di colorare con il colorante basico di contrasto Safranina tutte le strutture diverse dall’endospora: questa rimarrà colorata con il colorante iniziale, mentre le altre strutture assumeranno la nuova colorazione di contrasto.

Applicare il colorante basico di contrasto Safranina e lasciare agire per circa 1 minuto.

Lavare delicatamente con la spruzzetta di acqua dist. fino a che questa scende incolore e scolare l’acquarimasta.

Coprire ora lo striscio colorato con il vetrino coprioggetto, cercando di non inglobare aria.




Le cellule senza endospora appaiono colorate internamente di rosa-rosso su fondo illuminato e incolore.

Le cellule con endospora hanno invece l’endospora colorata internamente in verde e la restante parte della cellula in rosa-rosso su fondo illuminato e incolore.

Descrivere la forma e la posizione delle eventuali endospore presenti, classificando le cellulebatteriche con i seguenti termini.

Classificazione Descrizione Forma e posizione

BATTRIDI (bactridium)

cellule con endospora di diametro inferiore a quello della cellula stessa e con posizione centrale e a volte spostata verso una delle estremità

CLOSTRIDI (clostridium)

cellule deformate a forma di limone o di fuso per la presenza di una spora avente un diametro maggiore a quello della cellula stessa e in posizione centrale o subterminale

PLETTRIDI (plectridium)

cellule con endospora di diametro maggiore di quello della cellula stessa e in posizione terminale, che conferisce al microrganismo la forma di una racchetta

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE STRUTTURALE

DELLA CAPSULA

È anche questa una colorazione di tipo strutturale policromatico, il cui significato è già stato

spiegato nel paragrafo riguardante la colorazione dell’endospora.

Alcuni batteri sintetizzano uno strato di polimeri organici (in genere, polisaccaridi, tuttavia

possono essere composti anche da altre sostanze) che viene depositato sulla superficie esterna

della parete cellulare; questo strato mucoso di vario spessore e ben aderente alla parete è

chiamato capsula. Benché le capsule non siano necessarie per la crescita e la riproduzione dei

batteri nelle colture di laboratorio, sono tuttavia di notevole vantaggio per i batteri che crescono

nel loro habitat naturale. Esse, infatti, conferiscono ai batteri che ne sono dotati di una maggior

virulenza, tanto che lo stesso batterio privo di capsula viene distrutto facilmente senza

provocare malattia, cosa che non accade al batterio capsulato. La capsula contiene una grande

quantità di acqua, così da proteggere i batteri dall’essiccazione; protegge la cellula da un punto

di vista chimico-fisico dall’ambiente esterno, soprattutto nei confronti di numerose sostanze

tossiche idrofobe;favorisce l’attecchimento del batterio alle superfici di oggetti solidi in ambienti

acquatici o alle superfici dei tessuti delle piante e di animali ospiti.

Poiché la capsula, in seguito a colorazione semplice, spesso appare come un’area non colorata

attorno ad una cellula colorata, essa può essere confusa con artefatti non colorati, come zone

vuote che si formano a causa del restringimento delle cellule in seguito a fissazione su vetrino.

L’evidenziazione della capsula viene eseguita con doppia colorazione strutturale con coloranti

acidi.

Endospora di colore blu

Il colorante acido iniziale Nigrosina (o altro colorante acido) non penetra né nella cellula, né

nella sua capsula, ma colora soltanto l’ambiente circostante; il colorante acido di contrasto

Fucsina acida mordenzata con cloruro ferrico e fenolo (colorante di Maneval), proprio grazie al

mordente presente, riesce invece a penetrare nella cellula e la colora internamente, ma non

riesce a colorare la capsula perché estremamente resistente alla colorazione, perciò lo sfondo

intensamente colorato in blu-nero riesce a mettere in contrasto la capsula stessa, che rimane

incolore perché ha scarsissima affinità per i coloranti, con la cellula batterica, che si colora in

rosso-marrone.

Questa tecnica di colorazione non necessita della fase di fissazione dei microrganismi, perciò le

cellule rimangono vive e non artefatte e si deve perciò utilizzare il vetrino semplice portaoggetto

con il vetrino coprioggetto; é bene non utilizzare il vetrino di Koch perché lo strato di colorante

apparirebbe come un campo troppo scuro all’osservazione microscopica.


1 vetrino portaoggetto semplice con vetrino coprioggetto 1 pinza di legno o di metallo 1 ansa di metallo NIGROSINA (colorante acido iniziale) o altro colorante acido FUCSINA ACIDA MORDENZATA o COLORANTE DI MANEVAL (colorante acido di contrasto) 1 bacinella per colorazioni con supporto di vetro spruzzetta con acqua distillata, bunsen, microscopio

Colorazione iniziale con colorante acido Nigrosina e distensione della coltura

Questa fase del procedimento ha lo scopo di distendere uno strato sottile del colorante e della coltura batterica sul vetrino; il colorante acido, dato il suo carattere basofilo, non penetra all’interno della cellula che perciò rimane incolore, mentre lo sfondo si colora.

Appoggiare il vetrino sul supporto di vetro della bacinella per colorazioni e deporre su esso una goccia dicolorante.




Questa fase del procedimento ha lo scopo di eliminare per evaporazione a temperatura ambiente il solvente, in modo che sul vetrino rimangano solo i microrganismi vivi.

Asciugare il preparato all’aria a temperatura ambiente, senza scaldare né fissare alla fiamma.

Colorazione di contrasto con colorante acido Fucsina acida mordenzata

Questa fase del procedimento ha lo scopo di colorare internamente con il colorante acido di contrasto Fucsina acida la cellula batterica, in quanto, nonostante si tratti di un colorante acido, riesce a penetrare all’interno della cellula stessa perché mordenzato, e di aumentare l’intensità della colorazione dello sfondo; la capsula, invece, non riesce ad interagire neppure con il colorante di contrasto, perciò continua a rimanere incolore.

Addizionare allo striscio essiccato 1-2 gocce del colorante acido Fucsina acida mordenzata e lasciare acontatto per almeno 1 minuto.

Lavare delicatamente con spruzzetta di acqua dist. fino a che questa scende incolore e scolare l’acquarimasta.

Coprire ora lo striscio colorato ed essiccato con il vetrino coprioggetto, cercando di non inglobare aria.




Le cellule prive di capsula appaiono colorate internamente di rosso-marrone su fondo blu-nero.

Le cellule dotate di capsula possiedono invece, intorno alla zona colorata di rosso-marrone, un alone incolore, la capsula, che risalta come una zona illuminata tra lo sfondo blu-nero e il centro

della cellula rosso-marrone.

Batteri con capsula

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI

GRAM

Il termine differenziale deriva dal fatto che con tali tecniche è possibile suddividere i batteri in

gruppi distinti in base al tipo di reazione che manifestano se sottoposti a colorazione. Questa

differenziazione è dovuta alla diversa composizione cellulare dei diversi generi di batteri che,

non solo li differenzia gli uni dagli altri, ma anche dall’ambiente circostante.

Le tecniche di colorazione differenziale, così come quelle strutturali, sono di tipo policromatico,

in quanto utilizzano più di un colorante per volta: il primo colorante interagisce indistintamente

con tutte le cellule, il secondo colorante, detto colorante di contrasto, interagisce solo con

alcune di esse, che così vengono messe in contrasto sia con le altre cellule, che con l’ambiente

circostante.



vetrino semplice con il relativo coprioggetto.

La colorazione differenziale più nota e applicata in campo batteriologico è sicuramente la

colorazione di Gram, sviluppata nel 1884 dal medico danese Christian Gram, che permette di

suddividere i batteri con caratteristiche morfologiche simili in due classi distinte in base alla

natura chimico-fisica della loro parete cellulare, precisamente:

Sfondo di colore blu-

nero Capsula, alone

incolore Cellula di

colore rosso-marrone

BATTERI GRAM POSITIVI: possiedono una

spessa parete cellulare formata da un unico e

spesso (20-80 nm) strato di peptidoglicano (detto

anche mureina o mucopeptide batterico) posto al

di fuori della membrana citoplasmatica; il

peptidoglicano è un enorme polimero formato da

numerose subunità identiche contenenti sempre

due carboidrati azotati e molti differenti

amminoacidi. La parete dei batteri Gram positivi

contiene anche grandi quantità di acidi teicoici,

che sono polimeri di alcooli polivalenti legati da

gruppi fosfato; gli acidi teicoici non sono presenti

nella parete dei batteri Gram negativi.

La parete cellulare di batteri Gram positivi è in grado di trattenere all’interno della cellula

batterica, anche dopo aggiunta di un liquido decolorante, la colorazione iniziale fatta con un

colorante basico e mordenzata con iodio, di conseguenza queste cellule, quando vengono

sottoposte alla successiva colorazione con colorante basico di contrasto, rimangono colorate

internamente dal colorante basico iniziale, mentre l’ambiente circostante rimane incolore.

BATTERI GRAM NEGATIVI: la

parete cellulare delle cellule Gram

negative è molto più complessa

rispetto a quella delle cellule Gram

positive: comprende un sottile (1-

3 nm) strato di peptidoglicano che

aderisce alla superficie esterna

della membrana citoplasmatica e

rappresenta solo il 5-10% del peso

della parete; la membrana esterna

è situata al di fuori del sottile

strato di peptidoglicano; la

proteina di membrana presente in

maggior quantità è la lipoproteina

di Braun, che è legata molto saldamente al peptidoglicano sottostante e ancorata alla

membrana esterna, tanto da poter essere considerati come una sola unità; i costituenti peculiari

della membrana esterna sono i lipopolisaccaridi, grosse molecole formate da lipidi e da

carboidrati.

La parete cellulare dei batteri Gram negativi non è in grado di trattenere all’interno della cellula

batterica, dopo aggiunta di un liquido decolorante, la colorazione la colorazione iniziale fatta con

Parete di una cellula Gram positiva

Parete di una cellula Gram negativa

colorante basico e mordenzata con iodio in seguito, di conseguenza queste cellule, quando

vengono sottoposte alla successiva colorazione con colorante basico di contrasto, assumono la

colorazione di quest’ultimo, mentre l’ambiente circostante rimane sempre incolore.


1 vetrino portaoggetto semplice con vetrino coprioggetto 1 pinza di legno o di metallo 1 ansa di metallo VIOLETTO DI NICOLLE (oppure VIOLETTO DI GENZIANA) (colorante basico iniziale) SAFRANINA (oppure FUCSINA FENICATA) (colorante basico di contrasto) SOLUZIONE DI LUGOL (I2 + I)(aq) (soluzione mordenzante)

ALCOOL ETILICO 95° (oppure ACETONE) (liquido decolorante) 1 bacinella per colorazioni con supporto di vetro spruzzetta con acqua distillata bunsen microscopio







Reggere il vetrino in una zona non strisciata con la coltura con pinze di legno o di metallo.

Passarlo velocemente 2-3 volte sulla fiamma, in modo che questa lambisca appena lo striscio, fino a farevaporare tutto il liquido.


Questa fase del procedimento ha lo scopo di coagulare il protoplasma delle cellule, uccidendo così i microrganismi senza distorcerne le forme e le strutture e di far aderire le cellule al vetrino.



Colorazione iniziale con colorante basico (Violetto di Nicolle oppure Violetto di

Genziana)

Questa fase del procedimento ha lo scopo di colorare indistintamente tutte le cellule, sia Gram positive che Gram negative con il colorante basico iniziale a base di Cristalvioletto (Violetto di Nicolle oppure Violetto di Genziana), cioè con uno ione colorato positivo che reagisce con la cellula batterica avente debole carica negativa colorandola internamente di violetto.

Appoggiare il vetrino sul supporto di vetro della bacinella per colorazioni.

Coprire il vetrino con il preparato con Violetto di Nicolle (oppure con Violetto di Genziana) e lasciare acontatto per 2-3 minuti.

Scolare l’eccesso di colorante e lavare il vetrino con la spruzzetta di acqua dist. fino a che questa nonscende incolore.

Mordenzatura del colorante basico iniziale

Questa fase del procedimento permette al colorante basico iniziale una maggior penetrazione nella cellula batterica ed aumenta la stabilità della colorazione stessa.

Il mordente utilizzato nella colorazione policromatica di Gram è la cosiddetta soluzione di Lugol, cioè una soluzione acquosa contenente lo ione complesso I3

:

I + I2(aq) I3

Lo ione complesso I3 fissa il colorante sulla cellula in quanto forma complessi con il colorante,

perciò la cellula viene colorata più intensamente ed è perciò più difficile lavar via la colorazione

Coprire il vetrino con il preparato colorato con soluzione di Lugol e lasciare a contatto per 1 minuto.

Scolare l’eccesso di Lugol e lavare il vetrino con la spruzzetta di acqua dist. fino a che questa nonscende incolore.

Decolorazione del colorante basico iniziale

Si addiziona un liquido decolorante solubile in acqua (alcool etilico o acetone), che restringe i pori dello spesso strato di peptidoglicano tipico dei batteri Gram positivi; ciò comporta la ritenzione del complesso colorante-iodio durante la breve fase di decolorazione, così che questi batteri rimangono colorati in violetto. Al contrario, nei batteri Gram negativi, il peptidoglicano è presente solo in uno strato molto sottile, che presenta un grado relativamente basso di legami crociati ed inoltre possiede pori molto più grandi; in aggiunta, il trattamento con decolorante favorisce l’allontanamento dei lipidi dalla parete cellulare (perché solubili nel liquido decolorante) così da incrementarne la porosità. Per queste ragioni il liquido decolorante rimuove con più facilità il complesso Cristalvioletto-iodio dai batteri Gram negativi, che vengono perciò rapidamente e completamente decolorati.

Coprire il vetrino con il preparato colorato e mordenzato con Alcool etilico 95° (oppure con Acetone) elasciare a contatto per 1-2 minuti.

Scolare l’eccesso di decolorante e lavate il vetrino con la spruzzetta di acqua dist. fino a che questa nonscende incolore.

Colorazione di contrasto con colorante basico (Safranina oppure Fucsina

fenicata)

Durante questa fase del procedimento si utilizza un secondo colorante basico di contrasto in grado di colorare solo le cellule dei batteri Gram negativi di un colore diverso (rosa-rosso) rispetto a quello del colorante basico iniziale (violetto); il colorante di contrasto non attecchisce sui Gram positivi perché non decolorati, mentre colora nuovamente i Gram negativi la cui colorazione iniziale è stata asportata con la decolorazione: si crea quindi il contrasto desiderato fra le diverse cellule batteriche, alcune violette, altre rosa, e lo sfondo che rimane incolore.

Coprire il vetrino con il preparato colorato, mordenzato e decolorato con Safranina (oppure con Fucsinafenicata) e lasciare a contatto per 1-2 minuti.

Scolare l’eccesso di colorante e lavare il vetrino con la spruzzetta di acqua dist. fino a che questa nonscende incolore.

Coprire lo striscio colorato con il vetrino coprioggetto, cercando di non inglobare aria.

Tamponare delicatamente il vetrino sopra e sotto con carta da filtro.



Le cellule dei batteri Gram positivi appaiono colorate internamente in violetto su sfondo illuminato incolore.

Le cellule dei batteri Gram negativi appaiono colorate internamente di rosa-rosso, sempre su sfondo illuminato incolore.

Bisogna tuttavia prestare attenzione in quanto le cellule Gram positive invecchiate modificano in parte la loro parete cellulare, per cui appaiono di colore rosa come le cellule Gram negative.

Essendo la colorazione Gram una doppia colorazione basica, è possibile descrivere anche in questo casola forma e la disposizione delle cellule vegetative del microrganismo in esame, facendo uso deitermini riportati in precedenza (Esame microscopico a fresco).

SAGGIO DELLA ALANINA AMMINOPEPSIDASI


1 provettina sterile 1 tampone Grambioswab acqua sterile

Principio del metodo

Grambioswab sono tamponi di cotone impregnati con una soluzione di L-alanina 4-nitroanilide ed essiccati. Questo composto viene idrolizzato dall’enzima alanina amminopepsidasi situato sulla membrana cellulare dei batteri Gram negativi con formazione di L-alanina e di un composto colorato di giallo, la 4-nitroanilide. Tale enzima non è invece contenuto nella membrana cellulare dei batteri Gram positivi.

Procedimento

Siglare la provettina con il nome del gruppo.

Versare con tecnica sterile circa 0,5 mL di acqua sterile nella provettina.

Sempre con tecnica sterile toccare con la punta del tampone Grambioswab la coltura di lavoro delmicrorganismo in esame ed agitare.

Incubare a 37°C per 15-30 minuti lasciando il tampone dentro la provettina.

Lettura dei risultati

Esaminare il colore assunto dalla soluzione acquosa rispetto a prima dell’incubazione, quindi classificareil microrganismo in esame come di seguito indicato.

Colorazione della soluzione acquosa Tipo di microrganismo

Gialla Gram negativi

Nessun cambiamento di colore Gram positivi

Schemi riassuntivi delle osservazioni microscopiche

Esame microscopico a fresco

Fase del procedimento Scopo dell’operazione Preparazione del vetrino semplice e del vetrino di Koch con relativi coprioggetto

Pulire e sterilizzare i vetrini

Distensione della coltura e copertura con vetrino coprioggetto

Depositare sul vetrino un sottile strato di cellule batteriche

Osservazione microscopica con obiettivo 100x ad immersione in olio

Le cellule appaiono incolori, con bordo leggermente più scuro, su fondo incolore È possibile osservare la forma, la disposizione e l’eventuale mobilità delle cellule

Esame microscopico mediante colorazione semplice positiva o basica

Fase del procedimento Scopo dell’operazione Preparazione del vetrino semplice portaoggetto con relativo coprioggetto


Distensione della coltura Depositare sul vetrino un sottile strato di cellule batteriche

Essiccamento della coltura con calore Far evaporare il solvente

Fissazione della coltura con calore Uccidere le cellule senza deformarle con calore e farle aderire al vetrino

Colorazione con colorante basico (uno per volta); lavaggio dell’eccesso di colorante; copertura con vetrino coprioggetto

Colorare internamente tutte le cellule e lasciare lo sfondo incolore


Le cellule appaiono colorate internamente su fondo incolore È possibile osservare la forma e la disposizione delle cellule

Esame microscopico mediante colorazione semplice negativa o acida

Fase del procedimento Scopo dell’operazione Preparazione del vetrino semplice portaoggetto con relativo coprioggetto


Distensione della coltura e del colorante acido (uno per volta)

Depositare sul vetrino un sottile strato di cellule batteriche e colorare solo l’ambiente circostante

Essiccamento della coltura a temperatura ambiente e successiva copertura con vetrino coprioggetto

Far evaporare il solvente


Le cellule appaiono internamente incolori o solo leggermente colorate, con bordo più intenso, su fondo colorato È possibile osservare la forma, la disposizione e l’eventuale mobilità delle cellule

Esame microscopico mediante colorazione strutturale dell’endospora

Fase del procedimento Scopo dell’operazione Preparazione del vetrino semplice portaoggetto e relativo coprioggetto



Essiccamento della coltura a temperatura ambiente Far evaporare il solvente

Fissazione della coltura Uccidere le cellule senza deformarle con calore e farle aderire al vetrino

Colorazione iniziale con colorante basico (Blu di Metilene) per 5 minuti a caldo

Colorare internamente tutte le strutture delle cellule di blu e lasciare lo sfondo incolore

Lavaggio del colorante basico iniziale Le strutture cellulari diverse dall’endospora si decolorano

L’endospora non si decolora e rimane colorata di blu

Colorazione di contrasto con colorante basico (Safranina) per 1 minuto; lavaggio dell’eccesso di colorante di contrasto; copertura del preparato colorato con vetrino coprioggetto

Le strutture cellulari diverse dall’endospora lasciano penetrare il colorante basico di contrasto e si colorano di rosa-rosso

L’endospora non lascia penetrare il colorante basico di contrasto e rimane blu


Le strutture cellulari diverse dall’endospora appaiono rosa-rosse su fondo incolore

L’endospora appare blu su fondo incolore

In base alla posizione e alla dimensione dell’endospora è possibile classificare le cellule in: battridi, clostridi e plettridi

Esame microscopico mediante colorazione strutturale della capsula



Distensione della coltura e del colorante acido iniziale (Nigrosina o altro colorante acido)

Depositare sul vetrino un sottile strato di cellule batteriche e colorare l’ambiente circostante

Essiccamento della coltura a temperatura ambiente Far evaporare il solvente

Colorazione di contrasto con colorante acido (Fucsina acida mordenzata o colorante di Maneval) per 1 minuto; lavaggio dell’eccesso di colorante di contrasto; copertura del preparato colorato con vetrino coprioggetto

La parte interna della cellula diversa dalla capsula lascia penetrare il colorante acido di contrasto mordenzato e si colora di rosso-marrone

La capsula non lascia penetrare il colorante acido di contrasto e rimane incolore


Le cellule prive di capsula appaiono colorate internamente di rosso-marrone su fondo blu-nero

Le cellule con capsula appaiono rosso-marroni internamente, circondate da un alone incolore (la capsula), su fondo blu-nero

Esame microscopico mediante colorazione differenziale di Gram




Essiccamento della coltura Far evaporare il solvente

Fissazione della coltura Uccidere le cellule senza deformarle con calore e farle aderire al vetrino

Colorazione iniziale con colorante basico (Violetto di Nicolle o Violetto di Genziana) per 2-3 minuti; lavaggio dell’eccesso di colorante iniziale

Colorare internamente tutte le cellule di violetto e lasciare lo sfondo incolore

Mordenzatura del colorante basico iniziale con soluzione di Lugol per 1 minuto; lavaggio dell’eccesso di mordente

Aumentare il grado di penetrazione del colorante basico iniziale all’interno di tutte le cellule batteriche

Decolorazione del colorante basico iniziale con Alcool etilico 95° (oppure con Acetone) per 1-2 minuti; lavaggio dell’eccesso di liquido decolorante

Le cellule Gram positive non si decolorano e restano violette

Le cellule Gram negative si decolorano e diventano incolori

Colorazione di contrasto con colorante basico (Safranina o Fucsina fenicata) per 1-2 minuti; lavaggio dell’eccesso di colorante di contrasto; copertura del preparato colorato con vetrino coprioggetto

Le cellule Gram positive non lasciano penetrare il colorante basico di contrasto

Le cellule Gram negative lasciano entrare il colorante basico di contrasto e si colorano di rosa


Le cellule Gram positive appaiono viola su fondo incolore

Le cellule Gram negative appaiono rosa su fondo incolore

È possibile osservare anche la forma, la disposizione e la dimensione delle cellule

Saggio della alanina amminopepsidasi

Le cellule Gram positive NON producono una colorazione gialla nella fase acquosa

Le cellule Gram negative producono una colorazione gialla nella fase acquosa

Alunni CEPPO BATTERICO IN ESAME

Classe Genere

Data di consegna dei risultati Specie

LE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE

DELLE CELLULE VEGETATIVE

ESAME MICROSCOPICO A FRESCO

Forma delle cellule

Disposizione delle cellule

Mobilità (presente o assente)

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE SEMPLICE POSITIVA O BASICA

Forma delle cellule


ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE SEMPLICE NEGATIVA O ACIDA

Forma delle cellule


Mobilità (presente o assente)

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE STRUTTURALE DELL’ENDOSPORA

Endospora (presente o assente)

Forma dell’endospora

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE STRUTTURALE DELLA CAPSULA

Capsula (presente o assente)

ESAME MICROSCOPICO MEDIANTE COLORAZIONE DIFFERENZIALE DI GRAM

Classificazione secondo Gram

Forma delle cellule


LE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE DELLE CELLULE …...cromofori, cioè raggruppamenti atomici che...

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