Perjanjian nomor: I1I/LPPM/2016-02/67-P

LAPORAN PENELITIAN

INTEGRASI PROSES PEMISAHAN STEVIOSIDE DARI DAUN STEVIAREBAUDIANA

Disusun Oleh:Dr. Ir. Judy Retti B. Witono, M.App.Sc

Andy Chandra, S.T., M.M.

Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada MasyarakatUniversitas Katolik Parahyangan

2016

ABSTRAK

Salah satu dari 9 jenis kebutuhan pokok masyarakat Indonesia yang sering menimbulkan banyakpermasalahan adalah gula pasir. Tanaman andalan sebagai penghasil gula pasir adalah tebu,padahal dengan kondisi saat ini perluasan areal dan peningkatan produksi tebu sudah sulitdilakukan. Akibatnya nilai impor Indonesia untuk gula pasir meningkat terns. Disatu sisiIndonesia dengan kekayaan sumber alamnya mempunyai peluang untuk menggunakan bahanbaku lain sebagai sumber pemanis. Potensi Stevia rebaudiana yang dapat tumbuh juga didaerahtropis akan dieksplorasi dalam penelitian ini. Kandungan steviosida (glikosida steviol) dalamdaun keringnya sekitar 5-10% schingga stevia mcmpunyai potensi untuk dikembangkan sebagaipemanis/gula. Selain itu karena tingkat kemanisannya cukup tinggi (250 .... 300 x kcmanisan gula

tebu), mempunyai kandungan vitamin, mineral dan anti oksidan membuat gula yangdihasilkannya juga mempunyai fungsi teurapetik. Proses pemisahan steviosida dilakukan seearaekstraksi dengan pelarut air panas dan perlakuan pendahuluan terhadap daun menggunakanmicrowave. Pemekatan akan dilakukan menggunakan variasi penguapan vakum, membrannanofilrrasi, mikrofiltrasi dan ultrafiltrasi. Analisa akan dilakukan terhadap perolehan steviosidadan rebaudiosida A menggunakan HPLC dan FTIR.

1

Bab I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Produk gula di Indonesia selama ini dipenuhi dari tanaman tebu dengan produk dalam

bentuk granular yang biasa dikenal dengan nama gula pasir. Seiring dengan bertambahnya

jumlah penduduk dan juga berkembangnya berbagai jenis industri makanan dan minuman,

konsumsi gula dari tahun ke tahun meningkat terus. Sayangnya hal ini tidak diiringi dengan

peningkatan produksi dalam negeri. Impor gula yang dilakukan oleh pemerintah sering

menimbulakan dilematis bagi masyarakat khususnya petani. Karena sering kali gula impor lebih

murah dari gula produksi dalam negeri. Disatu sisi kebutuhan akan gula harus dipenuhi, sedang

disisi lain biaya produksi dalam negeri semakin tinggi. Kondisi produksi dan pengadaan gula diIndonesia antara tahun 2008 - 2012 dapat dilihat dalam table I.l. dibawah ini.

Tabcl I.1. Konsumsi. Produksi dan Defisit Gula Nasional, 2008 ····2012 [1]--_.~".. ~--"-

_..._._-_...--_. .........~.. .._------_._--

TahunKonsumsi Produksi Defisit

r---'c-'~'---~.~"..__.- ..." ..~...._. -_._._.

~•.._._---..- .. (OOO_tcJ.J1L__ (000 ton) (000 ton) (!Io....•..• .._._.- ...0....__-_.---... .....0_.-__-

2008 3.521 2.668 853 31,96......•- -------"._...~ ._------_.--~ ..._--_..~. ._._-----~ .."._..- ..__00._._-. 0.······_·2009 4.302 2.517 1.785 70,93. ..

2010 4.091 2.290 1.801o-f---. 78,66

o __~~_"_.__• __

----~--- .. 02011 4.503 2.228 2.275 102.11

'---- ..~ 0.. 0- --- 02012 5.335 2.60] 2.734 __195,11" . .---c--- .__._- o.___··.·~__" • ._--_.__.-

Laju (%/thn) 8,77 01,73 25,73 17,75Keterangan.) Terdiri dari konsumsi rumah tangga, penggunaan untuk industri pengolahan (makanan dan

minuman) dan tercecer (diolah dari NBM, BKP)

Bahan baku gula di Indonesia selama ini hanya mengandalkan tebu. Peremajaan tanaman

tebu dan perluasan area penanamannya perlu dilakukan. Tetapi hal ini merupakan sesuatu yang

sulit dilakukan karena selama ini konsentrasi penanaman tebu berpusat di pulau Jawa, dimana

jumlah penduduk dan okupansi lahannya semakin meningkat terus dari tahu ke tahun. Oleh

scbab itu pcrlu dilakukan pcngcmbangan divcrsifikasi bahan baku produk gula di Indonesia yangproses penanamannya tidak sulit, masa panen singkat, dapat tumbuh dalam kondisi tanah dan

cuaca yang bervariasi. Salah satunya adalah tanaman stevia.

Bagian daun dari tanaman Stevia rebaudiana tidak hanya mcngandung pemanis

stcvioside tetapi juga bcrbagai anti oksidan dan vitamin [2]. Hal inilah yang membuat bahan

baku ini cocok untuk dikembangakan sebagai pemanis karcna juga mempunyai unsur terapetik.

2

1.2. Urgensl Penelitian

Masalah ketahanan pangan di Indonesia bukan hanya merupakan masalah pemerintahsaja tetapi juga merupakan tanggung jawab kita bersama untuk memikirkannya:Banyak sumberbahan alam yang belum dikeIoIa dengan benar dan baik sehingga sebenarnya masalah imporbahan pangan bisa dicegah. Teknologi pengolahan bahan pangan tsb. biasanya tidak perlumenggunakan teknolgi yang sophisticated tetapi membutuhkan kondisi operasi dan perancanganproses yang tepat. Untuk mendapatkan data yang akurat inilah perlu dilakukan penelitianmenggunakan teori teori yang sudah ada dan mencari temuan temuan baru dari proses yang lebihefisien dan ekonomis.

1.3. Tujuan Penelitian

Mengembangkan proses pemisahan stevioside (senyawa pemanis) melalui beberaparangkaian proses dari daun Stevia rebaudiana sehingga diperoleh pemanis cair berbasis steviadengan kemurnian tinggi.

Tujuan khusus:

I. Memperoleh kondisi operasi optimal (rasio pelarut, temperatur ekstraksi, metoda ekstraksi)dalam proses pemisahan daun Stevia rebaudiana terhadap perolehan stevioside.

2. Eksplorasi pemurnian stevioside.

1.4. Target Pencapaian

Dengan memanfaatkan perolehan kondisi optimal pada proses ekstraksi daun stevia makadapat dilakukan scale-up untuk proses pengolahan dalam skala komersial. Mengembangkanteknologi pemumian stevioside yang paling efisien.

1.5. Luaran Penelitlan

• Makalah ilmiah yang akan dipublikasikan dalam seminar nasionallinternasional untukmendapat masukan bagi publikasi berikutnya dalam journal terakreditasi.

• Publikasi dalam jurnal nasional.

3

BAB II

TIN.JAUAN PUSTAKA

Berdasarkan Surat Keputusan Menteri Perinndustrian dan Perdagangan No.115/MPP/KEP/2/1998 tanggal 27 Februari 1998 ada sembilan jenis kebutuhan pokok masyarakat(sembako) yang pengadaannya menjadi prioritas utama pemerintah. Kesembilan bahan pokok

tersebut adalah:

I. Beras2. Gula Pasir3. Minyak goreng dan mentega4. Daging sapi dan ayam5. Telur ayam

6. Susu7. Jagung8. Minyak tanah9. Garam beryodium

Gula pasir/pemanis adalah salah satu bah an yang penting dalam produk pangan.Kebanyakan pemanis yang dikenal dengan sebutan umum gula diproduksi dari tebu, aren,kelapa, jenis umbi umbian seperti bit. Untuk Indonesia, tanaman andaJan sebagai bahan bakugula selama ini adalah tebu. Padahal perluasan area penanaman tebu sudah sulit dilakukan dipulau Jawa. Hal itulah yang menyebabkan sejak beberapa tahun ini impor Indonesia untuk gulameningkat terus. Apalagi ditambah dengan berkembangnya industri pangan di Indonesia,kebutuhan akan gula/pemanis akan meningkat terus (lihat gambar 1.1.).

Berdasarkan kandungan nutrisinya, pemanis dapat dibagi menjadi dua yaitu pemanis

nutritif dan pemanis non nutritif Pemanis nutritif adalah pemanis yang dapat menghasilkanenergi serta mengandung beberapa zat gizi lain seperti viarnin dan mineral. Pemanis nutritif yangsering digunakan selain gula pasir (sukrosa) antara lain adalah madu, dckstrosa, levulosa, danhigh-fructose corn syrup. Sedangkan pemanis non-nutritif adalah pemanis yang hanya sedikitmcngandung energi dan tidak mengandung gizi lainnya. Pemanis non-nutritif ini banyakdigunakan untuk kebutuhan diet karena tingkat kemanisannya sangat tinggi sehingga energi yangdihasilkan karena pengunaannya scdikit. Jenis pemanis non-nutritif antara lain adalah sakarindan aspartam.

11.1. Stevia

Stevia rebaudiana Bertoni (bentuk !anaman dapat dilihat pada gambar 11.1.) adalahtananam asli Paraguay yang saat ini sudah mcnycbar kebanyak tempat termasuk Asia Tenggara

termasuk Indonesia. Taksonomi tumbuhan Stevia ini dapat diklasifikasikan sebagai berikut [3]:

4

KingdomSubkingdomDivisiSubdivisiKelasSubkelasOrdoFamiliGenusSpesies

: Plantae (tumbuhan); Tracheobionta

; Spermatophyta (menghasilkan biji); Magnoliophyta - Angiospermae (tumbuhan berbunga); Magnoliopsida - Dicotyledonae (berkeping dualdikotil); Asteridae

; Campanuiatae (Asterales)

; Compositae (Asteraceae)

; Stevia Cav.

; Stevia rebaudiana Bertoni M.

Dari 230 jenis tumbuhan yang memiliki genus Stevia, hanya jenis rebaudiana dan phlebophylla

sajalah yang memproduksi steviosida.

Gambar II.I. Tanaman Stevia rebaudiana Bertoni [2]

WHO [4] mendiskripsikan steviosida sebagai kumpulan senyawa senyawa alamiah

glikosida steviol. Daun S. rebaudiana Bertoni mengandung 8 steviol glikosida yang berbeda.Komponen utama penyusun steviosida adalah triglucosylated steviol (5-10% dalam daun kering)sedang lainnya adalah rebaudiosida A (tetraglucosylated steviol), rebaudiosida C, dan dulcosidaA. Stevioside tingkat kcmanisannya dapat mencapai hingga 250 - 300 kali Iipat dari sukrosa.

5

Komponen ini relatif stabil pada suhu tinggi (termostabil) hingga 2000 C. Steviosida memilikirange pH yang cukup luas yaitu sekitar 3-9, selain itu steviosida tidak menimbulkan warna gelapkctika dipanaskan sehingga ini merupakan suatu keuntungan secara estetika.

Daun stevia telah lama digunakan oleh manusia tidak hanya sebagai pemanis tetapi jugadalam sistim pengobatan Ayurvedic untuk pengobatan penyakit baik kronis maupun tidak,seperti diabetes mellitus, obesitas, hipertensi, kanker, diare, inflamasi, diuretik serta pencegahankaries gigi [5]. Selain itu, steviosida tidak menyebabkan efek mutagenic, teratogenik, maupunkarsinogenik.

n.2. Kandungan Biokimia Daun Stevia

Daun Stevia mengandung komponcn-komponen biokimia serta fitokimia. Contoh dari

komponen biokimia yang dikandung oleh Stevia adalah karbohidrat, protein, mineral, lemak, danvitamin. Tabel II.!. menunjukkan analisa proksimat daJam 100 gram daun Stevia yang telahdikcringkan (basis kering).

Tabelll.l Analisa proksimal daun stevia (basis kcring) pcr 100g) [6]

ReferenceComponent Tadhaniand Goyal et al. Kaushik at a!. Mishra at al. Serio Abou-Arab et al. Atteh et at,

Subhash (2006) (2010) (2010) (2010) (20101 (2010) (2011)

Moisture NO 4.65 7/ 7 NO 5.37 NOProtein 20,4 11.2 12 10 11.2 11,40 16.0Fat 4.34 1.9 2.7 3 5.6 3/3 2.6Ash 13.1 6.3 8,4 11 ND 7,41 15.5Carbohydrate 35.2 NO NO 52 53 61.9 NOCrude fibre NO 15.2 NO 18 15 15.5 6.8

Sedangkan untuk komposisi glikosida yang ada dalam daun kering stevia hasil analisa daribeberapa peneliti ditunjukkan dalam tabel II.2. Untuk vitamin dan mineral yang terkandungdidalamnya ditunjukkan dalam tabel II.3.

6

Tabel 11.2. Jumlah pemanis glikosida dalam daun kering stevia (% - berat kering) [6J

Reference

Glycoside Kinghorn andCrammer and Kolb et al. Gardana Goyal Atleh et Jaworska

SoejartoIkan (1987)

et at, et at, al. et al,(1985) (2001)

(2010) (2010) (2011) (2012)

Stevioside 5-10 3-10 3.78-9.75 5.8 9.1 6.5 2.0stevio! ND ND ND ND ND ND 0.70Steviolbioside ND ND ND ND ND ND 1.2

Rcbaudioside A 2-4 1.0 1.62-7.27 1.8 3.8 2.3 5.0RebaudiosideB ND ND ND ND ND ND 0.50Rebaudioside C 1-2 ND ND 1.3 0.6 ND 2.0Rebaudioside D ND NO NO ND NO NO 3.3DulcosideA 04-0.7 02 NO ND 0.3 ND 1.0

Tabel 11.3. Vitamin yang larut dalam air yang terdapat dalam daun kering stevia [7J

Vitamins

Vitamin CVitamin 82Vitamin 86Folic acidNiacinThiamine

mg/100 g dry base of extract

14.970.43000

52.18

0.000.00

Selain senyawa-senyawa biokimia yang telah disebutkan di atas, daun Stevia juga mengandungmineral, anti oksidan, minyak dan asam asam amino.

II.2.t. Glikosida

Glikosida adalah senyawa yang rncngandung molekul karbohidrat (gula) yang terikatpada molekul non-karbohidrat. Senyawa ini biasanya ditemukan pada tumbuhan dan dapatdikonversi menjadi komponen gula (glikon) dan non-gula (aglikon). Senyawa-senyawa inidinamakan secara spesifik berdasarkan tipe gula yang dikandungnya, seperti glukosida untukglikon yang berupa glukosa, pentosida untuk glikon yang bcrupa pentosa, fruktosida untukglikon yang berupa fruktosa, dan sebagainya. Dengan kata lain, glikosida merupakan senyawa

gabungan antara komponen gula dan non-gula yang dihubungkan oleh suatu ikatan.Berdasarkan ikatan yang menghubungkan glikon dan aglikon terse but, glikosida dapat dibagimenjadi berikut:

7

I. Glikosida dengan jembatan oksigen: O-glikosida, seperti dioscin,

Gambar II.2. Struktur dioscin

2. Glikosida dengan jembatan nitrogen (N-glikosida, seperti adenosine),

H0 N-glycosiclil: Linkage0-----..

H HH I

OHH

OH

Adenosine

Gambar II.3. Struktur adenosine

3. Glikosida denganjembatan sulfur S-glioksida, sinigrin,

OH

# O"K+

HO 0 S N ~""HO 1 '0/\\ 0

OH 0

IGambar II.4. Struktur sinigrin

8

4. Glikosida dengan jembatan karbon C-glikosida, barbaloin.

HO 0 OHI

-::/ ~

:::::..... / CHpHCH,oH

H

H OHAloin (or Barbaloin)

Gambar II.5. Struktur barbaloin

II.2.2. Glikosida dalam daun stevia

Komponen glikosida yang terdapat dalam daun stevia terutama adalah steviosida, steviol,rebaudiosida A, B, C, D, E, F dan dulkosida (lihat gambar 11.6.)

110, \, Ii

'. H,C (--0

G-~ ,0

:,~~-:e '~'~o00

uo H

U

"0,,-- ",ero

OH

Stevioside Rebaudfcside A

ou

H,C }_oSteviol

Gambar II. 6. Glikosida dalam daun kering stevia [8]

9

Tabel 1r.7. menyajikan data tentang perbandingan kemanisan glikosida steviol terhadap

sukrosa dan table II.8. menyajikanjenis jenis glikosida dalam stevia beserta kualitas rasanya.

Tabel 11.7 Perbandingan kemanisan glikosida dengan sukrosa

Glikosida Tingkat kemanisan (dibandingkanSteviol sukrosa)

1--- . ._.._--_..• .•..., -~.. _..- - --~-_.--..." ...',........__._ ..

Dulkosida 50-120 kali

A._--~•..- -- ...... _.._.-

Rebaudios 250-450 kali

ida A_ .. _..._-~ ...__.,-_......_~ _ ..•..._-~-

Rebaudios 300-350 kali

ida B._._---~-.-----.- .---.-_.._.-._,--,-,-....~_. .__.

Rebaudios 50-120 kali

ida C.',..._-

Rebaudios 240-450 kali

ida D

RebaudiosI'

150-300 kali

ida E....._- ._---------

Steviolbio 100-125 kali

sida

Steviosida 300 kali

Tabel 11.8. Glikosida dalam Stevia--_._.... ---~--_.._-_....-

Rumus Berat molekul (gr/mol) Kualitas rasaempiris-------...,~.._.- ... ._._,-_._------"-- -- ---_..- ..- ._. --_..---_.•• - .',... _..~.._----_._--------

C3sHr,oOJ8 804.88 Sangat pahit.__._~ •..._'"-_.._•.._-~_. ....•."._- .. _..'------- _.__._..._._-~.._..._-_._--_._._._----

C44H7002j 967.01 Tidak terlalu

-- --pahit

------_.. .........'"'"._---- ------ ---,-,-,- -_.- _._- . -_._..._...- ..~_....~....,.~

C3sH60O'8 804.88 Pahit-------._--,..,,--_.~. -----_.- --------.._~._"_..__._-----_ ..".~,~"...__. _._-------_..._-C44H7oOn 951.01 Pahit

CSOHgOO28 1129.15...•_--'--.'S . sukrosa, cpcrti

...._~~._-~ ..

C44H70023 967.01 Seperti sukrosa..,

---~."

C43H680n 936.99 -C38H600J7 788.87 Sangat pahit

._ ..~ _. ..•---------CdlsoOJ3 642.73 Tidak enak

-

Glikosida

.~----,

Steviosida..__.._._--_.._-- ..

Rebaudiosida A

Steviolbiosida

DulkosidaA

Rebaudiosida B-_. .._...-Reballdiosida C

Rebaudiosida D+---­

Rebaudiosida ERebaudiosida-cI;:c,-t--

10

II.3. Proses Ekstraksi Steviosida dari daun kering stevia

Teknik ektraksi steviosida yang paling sederhana dan biasa dilakukan adalah ekstraksidengan pelaru!. Pelarut air (panas) merupakan medium untuk ekstraksi yang banyak diminati, halini disebabkan karena rebaudiosida A (yang memiliki rasa lebih baik dibandingkan steviosida)lebih mudah larut dalam air panas. Beberapa peneliti menyatakan bahwa pelarut pelarut organicseperti etanol, methanollkloroform, gliserin, sorbitol atau propilen glikol memberikan perolehanyang lebih besar dibandingkan menggunakan air. Namun bila dipandang dari sudut produkmakanan yang layak konsumsi (food grade) dan teknologi bersih maka air tetap menjadi pilihan.

Proses pemisahan steviosida dari daun kering stevia selain ekstraksi dengan pelarut,mulai dikembangkan juga proses proses seperti adsorpsi kromatografis, pertukaran ion,

presipitasi selektif, proses membran [9J, dan superkritik CO2 [IOJ.

Beberapa teknik untuk ekstraksi dengan pelarut adalah:

I. MaserasiMetode ini melibatkan perendaman dan pengadukan (agitasi) pelarut dan bahan tumbuhan.Pelarut kemudian dikuras. Miscella yang tersisa kemudian diambil dan disentrifugasi ataudapat juga disaring. Kelemahan dari metode ini adalah tidak dapat secara total mengekstraktumbuhan, atau dengan kata lain hasil ekstraksi kurang sempurna. Maserasi yang dilakukandengan pengadukan secara terus-rnenerus disebut maserasi kinetik sedangkan rnaserasi yangdilakukan dengan panambahan pelarut seeara berulang setelah dilakukan penyaringanterhadap miscella pertama dan seterusnya disebut remaserasi.

2. PerkolasiDalam metode ini, tumbuhan dibasahi dan dialirkan oleh pelarut dan dibiarkan sebelumtumbuhan tersebut ditempatkan dalam beberapa bilik perkolasi. Tumbuhan ini terus dibilasdengan pelarut sampai terjadi ekstraksi sempuma. Pelarut digunakan terus menerus hinggajenuh. Pelarut yang baru digunakan untuk tumbuhan yang hampir terekstrak habis dankemudian digunakan untnk tumbuhan yang belum terekstrak. Proses ini lebih efektif daripadamaserasl.

3. Perkolasi dinginMetode ekstraksi tradisional yang sangat sederhana. Sebuah tabung kerueut digantungkanterbalik di atas gelas kimia. Dasar dari tabung terdapat lubang yang berfungsi untuk menahanpadatan. Pelarut dituangkan dari atas tabung yang kemudian akan jatuh membasahi padatandi dalam tabung, mengekstrak padatan tersebut, lalu mengalir ke dasar tabung dan akhirnyajatuh ke dalam gelas yang terletak di bawah tabung tersebut. Tabung perkolasi dapatdibungkus dengan heating tape yang dapat memberikan kondisi ekstraksi yang lebihdiinginkan.

4. Ekstraksi lawan arahProses ini sangat efektif, pelarut rnengalir di arah yang berlawanan dengan bahan tumbuhan.Tidak seperti rnaserasi dan perkolasi yang rnerupakan proses batch, metode ini merupakan

11

proses kontinu. Contoh alat yang digunakan untuk ekstraksi lawan arah adalah ekstraktorsekrup (screw extractor) dan carousel extractor.

5. DigestiMetode ekstraksi ini dilakukan secara maserasi yang disertai pemanasan. Pemanasandilakukan pada suhu 40-50 "C. Metode ini tidak cocok untuk bahan aktif yang tidak tahanpada panas.

6. Ekstraktor soklct

Ekstraktor soklet pertama kali dikembangkan oleh Franz Von Soxhlet, seorang ahli kimiaagrikultural yang berasal dari Jerman pada awal abad ini. Dalam ekstraktor soklet ini,tcrdapat kondcnsor terbalik yang dipasang di atas scbuah labu tcrtutup. Di bawah kondcnsorterdapat alat yang disebut soklet. Terdapat air yang bersirkulasi dalam kondensor yangberfungsi untuk menjaga kondensor dingin. Pclarut terdapat dalam labu. Untuk melakukanproses ekstraksi, padatan dimasukkan ke dalam soklet yang memiliki sisi dan dasar yangberlubang agar cairan dapat mengalir melalui lubang tersebut. Ketika wadah dipanaskan,pelarut akan menguap. Uap pelarut akan menuju ke kondensor yang berada dalam kondisidingin, sehingga pelarut akan dikondensasikan kembali menjadi cairan dan akan jatuhmenetes ke bawah kondensor di mana berada soklet yang berisi padatan yang akan diekstrak.Pelarut kemudian mengalir kembali melewati lubang yang terdapat di dasar soklet, kembalike labu di mana pelarut mula-mula ditampung. Pelarut yang mengandung banyak ekstrakyang mengalir dari soklet ini memiliki warna yang Iebih gelap. Ketika proses ekstraksiselesai, kita dapat:

• Menghentikan operasi dan menuang pelarut yang mengandung ekstrak dari labu,dengan demikian proses ekstraksi telah selesai,

• atau mengganti alat soklet dengan bcjana penampungn yang berfungsi untukmenampung pclarut, kctika uap pclarut dikondensasikan olch kondcnsor, tctcsanpelarut akan tertampung dalam bcjana ini. Dengan dcmikian pelarut dapatdipisahkan dari ckstrak dengan scndirinya schingga hasil ekstrak akan bcrbentukpasta,

• atau mengganti padatan yang bcrada dalam soklet dengan padatan baru danmelanjutkan proses ckstraksi menggunakan pclarut yang sama.

Metode sokletasi ini kurang cocok untuk bahan aktif yang tidak tahan panas.7. Rcfluks

Refluks adalah mctode ekstraksi yang menggunakan alat pada tcmpcratur titik didihnya,selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanyapendingin balik.

8. Infudasi

Infudasi adalah metode ekstraksi yang menggunakan pelarut air pada temperatur 90°Cselama 15 menit.

9. Dekoktasi

12

Dekoktasi adalah metode ekstraksi yang menggunakan pelarut air pada temperatur 90°Cselama 30 mcnit.

11.4 Proses Pemisahan dengan Membran

Membran merupakan alat pemisah berupa penghalang yang bersifat selektif yang dapatmemisahkan dua fase dari berbagai campuran. Campuran terscbut dapat bersifat homogen atauheterogen dan dapat berupa padatan, cairan atau gas. Transportasi pada membran terjadi karenaadanya driving force yang dapat berupa konvcksi atau difusi dari masing-masing molekul,adanya tarik menarik antar muatan komponen atau konsentrasi larutan, dan perbedaan suhu atautekanan [II].

Berdasarkan ukuran pori, mcmbran dapat dibcdakan dibagi menjadi 2 yaitu:

1. Mcmbran bcrpori (porous membrane)

Prinsip pemisahan membran berpori didasarkan pada perbedaan ukuran partikel denganukuran pori membran. Membran jenis ini biasanya digunakan untuk proses mikrofiltrasi(melewatkan air, menahan mikroba) dan ultrafiltrasi (melewatkan air menahan garammineral). Dan berdasarkan besarnya pori, membran dapat dibedakan sbb. [12]

Sodium Ions

Aque ous Sult s

Dc t cr qent s

Havon oids

An tlbio tics

Vtrus e s

Emulsified Oils

Colloida l Sttfces

Pclype pude s

2. Membran non pori (non-porous membrane)

Prinsip pemisahannya didasarkan pada perbedaan kelarutan dan kemampuan berdifusi.Membran dengan jenis ini digunakan untuk proses penneasi gas, pervaporasi dan dialisis.

13

Pemisahan dengan membran dilakukan dengan mengalirkan feed ke dalam membran

kemudian akan terpisah sesuai driving force yang digunakan. Proses pemisahan dengan

membran menghasilkan dua aliran yaitu permeate dan retentate. Permeate merupakan hasil

pemisahan yang diinginkan sedangkan retentate merupakan hasil sisa. Driving force pada

pemisahan menggunakan membran ada 4 macam. Kinerja (performance) instalasi mernbran

tergantung pada jenis driving force yang digunakan. Macarn - maeam aplikasi pemisahan

dengan membran berdasarkan drivingforce dan kinerja instalasinya antara lain:

1. Drivingforce gradien tekanan (AP)

Aplikasi penggunaan antara lain: mikrofiltrasi, ultrafiltrasi, nanofiltrasi, reverse osmosis.

Besarnya fluks dihitung dari besarnya laju alir yang melewati setiap luas permukaan

membran. Semakin besar laju alir permeate dan semakin keeilluas permukaan membrane,

maka fluks yang dihasilkan semakin besar. Rejeksi merupakan ukuran perbandingankonsentrasi permeate dan retentate yang berhasil dipisahkan

2. Drivingforce gradien Konsentrasi (Ae)

Aplikasi penggunaan: pervaporasi, permeasi gas, permeasi uap, dialisis, dial isis .- difusi.

3. Drivingforce gradien Temperatur (/\'1')

Aplikasi penggunaan: thermo-osmosis, distilasi membran. Kinerja instalasi berupa fluks (1)

dan selektivitas (a).

4. Drivingforce gradien Potensial Listrik (/\E)

Aplikasi penggunaan: elektrodialisis, elektro-osmosis, membran-elektrolisis. Kinerja

instalasi berupa fluks (1) dan selektivitas (a).

Penelitian yang mulai memanfaatkan membran dalam pemekatan dan pemurnian steviose

hasil ekstraksi dengan pelarut sudah mulai dilakukan, seperti oleh Rao et al. [9J yang

menggunakan seeara simultan ultrafiltrasi dan nanofiltrasi. Hanya sampai saat ini pemanfaatan

membran yang dapat menghasilkan kemurnian tinggi - 100% dengan proses yang lebih efisien

belum berhasil dilakukan,

11.5 Metode Analisis

Ada beberapa metode yang dapat dilakukan untuk menentukan komposisi glikosida

dalam tumbuhan. Nishiyama et al. [13J menyatakan bahwa analisa dengan menggunakan High­Performance Liquid Chromatography (HPLC) dan NIR spectroscopy [I3} eukup memberikan

hasil yang memuaskan untuk mengukur komposisi steviosida dan rebaudiosida A dalam daun

Stevia. Sedangkan Shirwaikar et al. [14J menggabungkanjuga analisa dengan High Performance

Thin Layer Chromatography (HPTLC).

14

Bah III

METODE PENELITIAN

Penelitian yang akan dilakukan mengikuti roadmap penelitian tentang teknologi pengolahan gulastevia dari daun Stevia rebaudiana seperti yang ditunjukkan oleh gambar ilL I.

- PenukarIOn

- Membran

~- ....JPemurnian__~""~'~'~'_M

- PelarutPenukarIOn

- Chelatingagent

- Adsorpsi

Pembesaran -~

Granulasiimprcgnasi

- Evaporasi- Pengeringan- Membran

Gambar Hl.L Skema alur penelitian pengolahan guia Stevia

Tahapan dalam penelitian ini adalah sbb.:

I. Sortikasi dan pembersihan daun Stevia rebaudiana kering.2. Ekstraksi steviosida menggunakan metoda pelarut dan microwave dengan vanasi kondisi

operasi sesuai prcmis-premis.3. Penentuan kondisi optimum dalam aplikasi kedua metoda yang digunakan.

111.1 Bahan-Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bahan baku utama dan bahananalisis.

III.].] Bahan Baku lJtama

Bahan baku utama yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:

15

1. Daun Stevia rebaudiana kering (diperoleh dari PT Tigapilar Argo Utama)2. Aquadest

111.1.2 Bahan Analisis

Stevioside hydrate >98% (HPLC) dari SIGMA.

111.2 Peralatan Penelitian

Peralatan-peralatan yang digunakan dalam penelitian ini dibagi menjadi:

1. Peralatan ekstraksiPeralatan yang digunakan untuk mengekstraksi daun Stevia kering, yaitu:a. Ekstraktor batch dengan kapasitas volume sebesar 1 liter, beserta alat-alat pendukung

untuk ekstraktor seperti: waterbath, kondensor, motor pengaduk, impeller,thermostat, thermometer, dan pengambil sampel. Ekstraktor ini adalah alat yangdigunakan untuk melakukan ekstraksi.

"--~-_••lo-Air [lcndinginmasuk

1__0 .." .. kondcnsor

__ ...." ..__ Air pcndiug!nkcluar

_ •._"... waterhath

I--_L::s=±=:t---+penguduk

pcngambiJ~---Asampcl

tcnuostat .. 1__

Gambar 111.2. Ekstraktor batch

b. Microwave oven rumah tangga merk Panasonie seri NN-MX21 WF dengan power =

800W.

16

Gambar 111.3. Microwave oven

c. Rotary Vacuum Evaporator

Rotary Vacuum Evaporator adalah alat yang digunakan untuk memisahkan antaraekstrak dengan pelarnt.

Gambar IlIA. Rotary vacuum evaporator

2. Peralatan analisisPeralatan analisis yang digunakan untuk menganalisa hasil dari penelitian ini antara laincolorimeter, turbiditymeter, Moisture Analyzer, HPLC, dan FTIR.

3. Peralatan pendukungPeralatan pendukung yang digunakan dalam penelitian Ill] antara lain adalah oven,blender, neraca analitik, dan pompa vakum.

17

III.3. Prosednr Percobaan

III.3.t. Persiapan Bahan Baku dan Pertakuan Awal

Dann stcvia yang dipcrolch dari penjual dibcrsihkan dari pcngotor scpcrti ranting-ranting,daun yang sudah busuk, dan pcngotor lainnya. Kcmudian stevia dikcringkan dalam oven untukmcngurangi kadar air yang ada dalam daun tsb. Sclanjutnya, ukuran daun diperkecil dcngan caradiblcndcr rnenjadi serbuk halus dan dilakukan pcnycragaman ukuran dcngan mesh -20+30.Sedang, kadar air yang tersisa dalam daun tcvia dianalisis dcngan moisture analyzer. Di bawahini disajikan diagram alir dari tahap persiapan bahan baku dan pcrlakuan awal daun stcvia.

Daun Stcvia dibcrsihkan dan pcngotor

iii'Daun Stevia dikeringkan dalam oven vakum pada suhu 40 'C sclama 24 jam I

.iff·

Daun Stcvia diblcndcr mcnjadi ukuran yang Icbih kecil

Wi!'

Daun Stcvia diayak dcngan mesh bcrukuran -20+30

'iii'Kadar air daun Stcvia dianalisis dcngan moisture analyzer hingga kadar air yang

tersisa di bawah 10%

Daun Stcvia siap untuk diekstraksi1-- ,

Gambar III.S. Diagram alir perlakuan awal daun stcvia

III.3.2. Ekstraksi Daun Stcvia

Proses ekstraksi daun Stcvia dalam pcnclitian ini dilakukan dengan menggunakan kondisioptimum dari pcnclitian yang tcrdahulu [15]. Pengadukan dilakukan dcngan bantuan microwave.Mula-mula daun Stevia yang telah diayak dcngan mesh berukuran -20+30 dicampurkan kc dalamaquadcst dcngan pcrbandingan F:S tertentu, Campuran terscbut dickstraksi dengan menggunakanekstraktor batch dan dengan mcnggunakan microwave. Ekstrak kcmudian diambil untukdianalisa dalam tiga waktu bcrbcda yaitu I jam, 90 mcnit, dan 2 jam. Ekstrak ini dipisahkandengan rafinat mcnggunakan filtrasi vakum agar filtrasi berjalan dcngan Icbih cepat. Ekstrakdaun Stcvia yang dihasilkan kcmudian dianalisa mcnggunakan Fourier Transfor Infra-Red(FTIR). Proscdur yang dilakukan dalam pcnclitian tcrdahulu dapat dilihat dalam gambar IIl.6.

18

Daun Stevia yang telah siap diekstraksi dicampurkan dalam aquadest dengan variasiperbandingan F:S tertentu yaitu 1:10, 1:15, dan 1:20

X4'!

Proses ekstraksi dilakukan dalam ekstraktor batch dan microwave dengan variasi suhu sebesar45 "C, 50 "C, dan 55 "C dengan kecepatan pengadukan sebesar 250 rpm (untuk ekstraksi

dengan pengaduk)

44)!

Ekstrak di-sampling pada menit ke120

740i,

Ekstrak dipisahkan dari rafinat dengan cara filtrasi vakum menggunakan pompa vakum

-Y40~

Ekstrak daun Stevia diperoleh dan dianalisis

Gambar 111.6. Diagram alir proses ekstraksi dan analisis daun Stevia

IlL3 Analisa tcrhadap bahan baku, produk antara dan produk akhir

I. Kadar air menggunakan moisture analyzer dan oven.2. Jenis komponen kimia dan konsentrasinya menggunakan High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) dengan detector UV dan kolom Aminex C-18.3. Warna menggunakan colorimeter.4. Kekeruhan menggunakan turbiditymeter.5. Gugus organik menggunakan FTIR.

19

BabIV

JADWAL PELAKSANAAN

Penelitian dilakukan di Laboratoriurn Rekayasa Kirnia Universitas Katolik Parahyangan,Bandung.

Pengumpulan bahan baku penelitian berupa daun kering Stevia rebaudiana dilakukan di

derah daerah penghasil yang kebanyakan berlokasi disekitar Yogyakarta/ Tawangmangu.

Analisa HPLC akan dilakukan di FMIPA - lTB, karena yang dibutuhkan adalah HPLCdengan detektor UV sedangkan yang dimiliki oleh UNPAR adalah HPLC dengan detektor IR.Untuk analisa FTIR, kadar air dan kadar abu akan dilakukan di laboratorium Polimer - UNPAR.

Pelaksanaan penelitian direncanakan selama 10 bulan yaitu dari bulan Februari 2016sampai dengan bulan November 2016. Dimana bulan Januari 2015 digunakan sebagai surveyawal untuk penelitian dan tinjauan pustaka. Jadwal kerja penelitian secara terperinci disajikanpada tabel IV. I.

Tabel IV. Jadwal Kerja Penelitian tahun 2016-._-,---~~.. ..- ...•.•.

MeC=JUli'"TJii"I.:.· ~gs,= r.S~Jl-'..Ke~atall Feb. Mar. ~.£r. Okt. Nov... . ..._...._._-

Pcrsiapan alat danbahan

. .._- ...__._._.~.~ -------_.._-- .~-_ ...__._. •.......~

Ekstraksi

II. .

menggunakan pelarut& microwave --_._.

I. . . _._--- .

Pcngujian kadarstcvioside (I) ._.._.~•..._.. I

.•~ ._..._..._-~. .._---Penentuan koagulan !

.

---

terbaik-----~_. -'''-'----._..- .._,-, ..._.,..,~..• "U,•• __.• __ ...- ,. _._-----

Pengujian kadar.st~.\f~Cl.~ideiIIL_. ..u~._ . _---_. -_.__..__ . _._-_. . . .

Pengolahan data... _..~...•

. .Pcnyelesaian laporan I.. . •..... _.__ .. ...•...._.

20

BabY

HASIL DAN PEMBAHASAN

V.I. Persiapan Bahan BakuDaun Stevia yang digunakan adalah daun kering. Oleh sebab itu pcngotor berupa batu

dan ranting-ranting harus dipisahkan terlebih dahulu. Kemudian daun Stevia tsb, disamakan

kadar airnya sehingga ± 10%. Berikutnya adalah proses pengeeilan ukuran menggunakan blenderdan pengayak (laboratory test sieve) sehingga didapat ukuran mesh -20+30 dan mesh -40+60.Daun Stevia pada berbagai ukuran dapat dilihat pada Gambar V.I dibawah ini.

(a) (b) (e)

Gambar V.I (a) daun Stevia kering, (b) mesh -20+30, (e) mesh -40+60

V.2. Ekstraksi Daun Stevia

Pelarut yang selama ini dianggap eukup murah dan tidak beraeun adalah air. Sedangproses ekstraksi ekstraksi yang dilakukan dalam percobaan ini yaitu metode perendaman yangdisertai pemanasan dan pengadukan di dalam tangki. Variabel yang dianggap berpengaruh padaproses ekstraksi ini adalah perbandingan umpan dan pelarut, temperatur, waktu dan ukuranbahan baku.

Penelitian awal [16] dilakukan dalam ekstraktor batch (rangkaian ekstraktor dapat dilihatpada gambar V.2) dengan variasi perbandingan urnpan dan pelarut (F:S) = I: 10, I: 15 dan 1:20;temperatur ekstraksi 100°C dan keeepatan pengadukan 250 rpm. Sedangkan daun kering yangdigunakan lanpa melewati proses pengeeialan ukuran. Ekstraki dilakukan dengan variasi waktu60, 90 dan 120 menit. Hasil ekstraksi dapat dilihat pada gambar V.3. dibawah ini.

Proses pemisahan kemudian diikuti dengan filtrasi vakum untuk memisahkan rafinat dariresidu daun. Sedang ekstrak daun stevia dipisahkan dari pelarutnya dalam rotary vacuumevaporator pada suhu 50°C, keeepatan 50 rpm dan tekanan 7,2 mbar sampai tidak ada pelarut

21

yang menetes lagi kira-kira ±2,5-3,5 jam bergantung dari banyaknya pelarut yang digunakan.Untuk menentukan perolehan dari hasil ekstraksi, sample kering yang didapat kemudianditimbang dan dibandingkan terhadap berat daun kering stevia awal.

Gambar V.2. Set up peralatan ekstraksi

Gambar V.3. Hasil Ekstraksi Daun Stevia

Pemanis stevia yang diperoleh (seperti ditunjukkan dalam gambar VA) memperlihatkanbahwa semakin besar rasio F : S, maka berat pemanis yang diperoleh semakin tinggi dansemakin lama waktu ekstraksi, maka berat pemanis yang diperoleh semakin tinggi juga. Hal inimenunjukkan bahwa dengan rasio F:S yang semakin besar, maka semakin banyak juga pelarutyang digunakan pada jumlah umpan yang sarna sehingga semakin banyak pemanis yang dapatterekstrak dalam jangka waktu yang sama. Dan semakin lama waktu ekstraksi, maka waktu

22

kontak antara pelarut dengan umpan akan semakin lama juga sehingga produk yang dapatterekstraksi akan semakin banyak.

120110

__~<lw-F:5= 1:10

_-::o_"",- -flII-F:5 z 1:15

", ." F:5 z 1:20

8,26 "1--E 8,16 """""""" ., ,,',,'"

~ 8,06~ 7,96.~c: 7,86'"E 7,76OJ0. 7,66~

~ 7,56 +------=~-""".=----"'---..--­OJco 7,46 ~"""",-, ---

7,36 --,..............·_·-r-·--~-···_---,..............,··_-..,-----l

60 70 80 90 100waktu (menit)L- ~__.., ..

Gambar VA. Perolehan pemanis stevia (basis kering) terhadap rasio umpan dan pelarut dan

waktu ekstraksi

Dari penelitian awal dapat terlihat bahwa perolehan pemanis stevia masih menunjukkankcnaikan sampai pada ratio umpan dan pelarut yang tertinggi yang dipilih dalam penelitian ini.Hal ini menunjukkan bahwa perolehan pemanis tsb. masih dapat ditingkatkan denganmenggunakan ratio yang semakin bcsar. Dengan kata lain dengan ratio yang rcndah bclumsernua pemanis stevia yang ada dalam daun terekstraksi semua.

Untuk membuktikan adanya gugus stcviosida dan rebaudiosida-A dari sample hasilekstraksi maka dilakukan juga anal isis FTIR. Sampcl pemanis stevia yang dibandingkan adalahsample dengan kondisi F:S dan waktu (I) 1:10,60 menit, (2) 1:15,90 menit (3) 1:20, 120 menitdan sample pernanis stevia komcrsiaL

Dari hasil analisis FTIR pada gambar VS terlihat bahwa untuk sample (I), (2), (3) danpemanis komersial pada rentang 3200-3550 em'! terdapat puneak/peak yang menandakan

keberadaan gugus OH, Spektrum inframerah dari pernanis yang dianalisis juga menunjukkanadanya puneak/peak pada spektrurn 2850-3000 em'! yang menandakan terdeteksinya gugus CH,CHz, CH3 dan pada spektrum 1600-1700 em'! juga terdapat puneak/peak yang menunjukanterdcteksinya gugus C=O. Dengan adanya gugus yang sarna antara ketiga sampel dan juga pada

pemanis komersial, hal ini membuktikan bahwa kandungan stevioside dan rebaudioside Aditcmukan pada sample yang dihasilkan. Scdangkan adanya puncak puncak tarnbahan padasample yang dihasilkan diprediksi karena adanya tambahan zat lain yang disebabkan belumdilakukannya proses pemumian pada sample sample tsb.

23

M"llIPQI,,1 Bas"I1"",corroctlonM.,llIpolnl ea&olinocor,oclion -­I ,; i. ".·,>1,,,,",, , ._

75

a

90

60

~~

45 ~S!

30-

%T

15

105

I I I ..... T·l750 500

1Jcm

-r ·-(I...,..........--r-....r"'I~·'- , , I I i--T-,·~'--r-·T.. r..-r-r-r-.....-r-r-.,.·...."....,----r"..,·-r~.....,.....,...TT'O'~"~~4500 4000 3500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000

ks

Gambar V.S. Spektra FTIR sample (I) merah, (2) biru, (3) hijau dan pemanis stevia

komcrsial

Penelitian selanjutnya dilakukan dengan menggunakan dua buah variabel, yaitu variasi

ukuran daun Stevia kering (U) dan rasio umpan terhadap pelarut (F:S) [17]. Variasi ukuran daun

yang digunakan adalah ukuran mesh -20+30 dan -40+60, serta daun yang tanpa melewati prosespengeeilan ukuran. Sedangkan variasi rasio umpan terhadap pelarut lebih tinggi, yaitu I: I00,I: 150, dan 1:200.

Perolehan pemanis stevia (crude) pada berbagai perbandingan umpan terhadap pelarutyang dipiJih dan ukuran daun kering dapat dilihat pada gam bar V.6 dibawah ini. Dari grafik tsb.

dapat terlihat bahwa semakin besar ratio umpan terhadap pclarut (massa daun kering dalam

volume pelarut yang sarna makin keeil), perolehan produk semakin berkurang. Dapat

disimpulkan bahwa ratio I: I00 merupakan ratio yang optimal mengingat dari kemudahan proses

ekstraksi menggunakan daun kering dalam ukuran keeil dan perolehan pemanis. Juga semakinkeeil ukuran daun perolehan pemanis semakin tinggi.

24

-11II-~ !!lm!:MMesh ­40+60

-+-~!!lm!:MMe;h ­20~30

··~Mesh

250

200

1150

) 100

e•~

"'"....~

0 2 3 4 5 6MassaiWul stevlal\W:,iWalll.

volume R£!ml1)'ang~(gram)

Gambar V.6. Perolehan pemanis stevia cair terhadap ukuran daun kcring dan ratio F:S

Sclanjutnya untuk mcngctahui pcngaruh temperatur pada ekstraksi dan juga metodcekstraksi, penelitian dilanjutkan dengan menggunakan microwave oven (Low, Medium, Med­High, dan High) [IS]. Perkiraan temperatur yang dicapai pada setiap kondisi tsb. dapat dilihatdalam table V.1.

Perolehan pcmanis carr dari daun kering stcvia dengan menggunakan microwavemcnunjukan pcrolehan hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan ckstrasi maserasi, Hasildapat dilihat pada grafik Y.2 dibawah ini.

Berdasarkan penelitian yang sudah dilakukan sampai saat ini, maka dapat disimpulkanbahwa penggunaan microwave sangat membantu didalam proses ekstraksi pemanis stevia daridaun utuh. Sehingga dapat dikatakan proses ini juga dapat mereduksi proses pengecilan ukuransebagai pretreatment dalam proses ekstraksi secara maserasi. Hal ini sejalan dengan penelitianterhadap pemanfaatan microwave dalam teknologi pangan khususnya bahan yang berbentukfluida [19].

25

Tabel V.2. Konsentrasi pemanis pada berbagai variasi temperatur microwave menggunakandaun stcvia utuh

63°e +: noe =l10,4373 J__~__I~,3833 J5,7113

Konsentrasi gulaxI0-

2) %bera:o.t-"-------

V.3. Pemurnian Pemanis Stevia

Berhubung pemanis stcvia mengandung bcrbagai macam scnyawa glikosida yangmempunyai ukuran dan karakteristik molekul yang hampir sarna, proses separasi berbagaisenyawa glikosida khususnya stevioside dan Rabaudioside A mcnjadi faktor penting. Apalagiharga jual dari masing masing jenis glikosida tsb. berbeda. Untuk itu penelitian yang saat inimasih sedang berjalan difokuskan pada proses pemurniannya dengan menggunakan beberapametoda.

26

BABVI

KESIMPULAN DAN SARAN

1. Proses pemisahan senyawa glikosida dari daun stevia dapat dilakukan menggunakan metodayang sederhana dengan pelarut yang ramah lingkungan dan tidak bersifat toxic pada

makanan yaitu air.

2. Untuk mendapatkan perolehan yang lebih besar, penggunaan microwave oven sangat

mernbantu. Untuk itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut, agar dapat diperoleh kondisi

optimum untuk memperoleh hasil setinggi mungkin tanpa merusak senyawa glikosidanya.

3. Proses pemurnian rnasih rnemerlukan penelitian lebih jauh.

27

DAFTAR PUSTAKA

I. Rusono, N., Suanri, A., Candradijaya,A., Muharam, A., Martino, I., Tejaningsih,Hadi,P.U., Susilowati, Maulana Studi Pendahuluan - Rencana Pembangunan JangkaMenengah Nasional (RPJMN) Bidang Pangan dan Pertanian 2015 - 2019, 20 I3,Direktorat Pangan dan Pertanian Kementerian Pereneanaan PembangunanNasional/Badan Pereneanaan Pembangunan Nasional Jakarta.

2. De, S., Mondal, S., Banerjee, S., Stevioside - Technology, Applications and Health. 2013:John Wiley & Sons, Ltd.

3. Anomim.lnjormasi species Stevia. Data tumbuhan [cited 2016 Jan.31]; Available from:www.plantamor.com.

4. Safety Evaluation of Certain Food Additives, in Stevioside(2000), WHO - World HealthOrganisation. Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives.: Geneva.

5. Megeji, N.W., Kumar, J.K., Singh, V., Kaul, V.K., Ahuja, P.S., Introducing Steviarebaudiana, a natural zero - calorie sweetener. Research Communications, 2005. 88(5).

6. Gupta, E., Purwar, S., Sundaram, S., Rai, G.K., Nutritional and the therapeutic values ofStevia rebaudiana: A Review. Journal of Medicinal Plants Research, 2013. 7(46;: p.3343-3353.

7. Kim, I., Yang, M., Lee, 0., Kang, S., The antioxidant activity and the bioactivecompound content of Stevia rebaudiana water extracts. LWT - Food ScienceTechnology, 2011. 44: p. 1328-1332.

8. Carakostas, M.e., Curry, L. L., Boileau, A. c. Brusick, D. J., Overview: The history,technicalfunction and safety of rebaudioside A, a naturally occurring steviol glycoside,for use infood and beverages. Food and Chemical Toxicology, 2008. 46(7, Supplement):p. SI-S10.

9. Rao, A.B., et al., An improvised process of isolation, purification of steviosides fromStevia rebaudiana Bertoni leaves and its biological activity. International Journal of FoodScience & Technology, 2012.47(12): p. 2554-2560.

10. Pasquel, A, Meireles, M.A.A, Marques, M.O.M., Petenate, A.J., Extraction of steviaglycosides with C02 + water, C02 + ethanol, and C02 + water + ethanol. BrazilianJournal of Chemical Engineering, 2000.17: p. 271-282.

II. Pabby, A.K., Rizvi, S.S.H., Requena, A.M.S., Handbook of Membrane Separations:

Chemical, Pharmaceutical, Food, and Biotechnological Applications, ed. 2nd. 2009,USA.: CRC Press.

12. Pressure-driven membrane filtanion Processes. [cited 2016 Jan.31]; Available from:www.synderflltration.com.

28

13. Nishiyama, P., Alvarez, M., Vieira, L.G. , Quantitative analysis of stevioside in the

leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy. Journal of the

Science of Food and Agriculture, 1992.59: p. 277-281.

14. Shirwaikar, A., Parmar, V., Bhagat, J., Khan, S., Identification and estimation of

stevioside in the commercial samples of stevia lef and powder by HPTLC and HPLC.

International Journal of Pharmacy and Life Sciences, 2011. 2(9): p. 1050-1058.

15. Novalia, c., A., Studi Ekstraksi Batch Daun Stevia Rebaudiana Bertoni dengan Variabel

Jenis Pelarut dan Temperatur, 2014, Universitas Katolik Parahyangan: Bandung.

16. Chandra, A., Tirtobudi, K.R. Studi Awal Proses Ekstraksi Daun Stevia Rebaudiana

Dengan Variabel Perbandingan Umpan dengan Pelarut dan Waktu Ekstraksi in Seminar

Nasional Teknoin, 2014. Yogyakarla.

17. Jessica, Chandra, A., Pembuatan Gula Cair Stevia Dengan Variasi Daun Stevia

Terhadap Air Dan Ukuran Stevia Dengan Tangki Berpengaduk, 2016, Universitas

Kalolik Parahyangan.

18. Steffany, l.M., Chandra, A., Pengaruh Ukuran Daun Dan Temperatur Dalam Ekstraksi

Daun Stevia Dengan Microwave Terhadap Produk Gula Cair, 2016, Universitas Katolik

Parahyangan.

19. Rahman, M.S., Handbook ofFood Preservation. 2007: CRC Press.

29