Laboratorio e diagnostica nel carcinoma della mammellacarcinoma della mammella

Prof.ssa Daniela Cabibi

Università degli Studi di Palermo

Le risposte che il clinico si attende dall’Anatomia Patologica sono sempre più numerose, specie per quanto riguarda le neoplasie mammarie

IN PASSATO:IN PASSATO:

Diagnosi di neoplasia su basi morfologiche e stadiazione TNM

Immunoistochimica

Fattori prognostici Ibridazione in Situ

Markers predittivi di risposta alla terapia

Sottotipizzazione molecolare della neoplasia

All’ Anatomia Patologica si chiede sempre di più, fornendo sempre meno

Resecati chirurgiciResecati chirurgici

Core biopsy, microbiopsie in sede metastatica

Campioni citologici da agoaspirato ( FNA)

Era delle « Biopsie liquide »!?!

( ricerca di alleli mutati circolanti nel sangue)

Diagnosi di istotipo in base alla morfologia

talora difficile

Immunoistochimica:

e-caderina : carcinoma duttale = +

lobulare = –

Alcuni carcinomi lobulari possono essere +

Immunoistochimica nella diagnosi differenziale tra carcinoma invasivo e carcinoma in situ/proliferazioni non neoplastiche

actina ���� P63, CD10, CK5/6 :

evidenziano la persistenza dello strato di cellule basali nelle proliferazioni non neoplastiche e nel basali nelle proliferazioni non neoplastiche e nel carcinoma in situ

A

Carcinoma tubulare Adenosi florida

CK5/6

P63

Fattori prognostici e predittivi di risposta alla

terapia

Recettori ormonali per estrogeni e progesterone

Ki67

HER2

Importanza di una corretta fase pre-analitica:

tempo di “ischemia fredda”

Molti Ag si distruggono in circa 20 min. se non fissati

immediatamente� implementare la tecnica del sottovuoto

estrog-estrog+

Core biopsy mammella Stessa pz: resecato chirurgico fissato tardivamente

Sottotipi molecolari

breast cancer derived from two main cell types: ���� NSG

1) luminal-like cell compartment.� Non-basal-like cancers

luminal A ( 73%) : ER/ PR+ HER2 neg. Ki67 ≤14%.

luminal B(10%): positivo per ER e/o PR, HER2 + o - Ki67 ≥14%

HER2 type (5%) : ER / PR neg, HER2. +

2) compartimento basale/myoepiteliale� carcinomi basal-like2) compartimento basale/myoepiteliale� carcinomi basal-like

Triplo negativo (12%): ER/PR/HER2 neg, CK5/6 o EGFR= spesso +→ basal-like

HER2 (HER2/neu o c-erb2)

proto-oncogene situato nel braccio lungo del cromosoma 17

che codifica una proteina della famiglia dei “Recettori deiche codifica una proteina della famiglia dei “Recettori dei

Fattori di crescita epidermici ( Epidermal Grown Factor

Receptors =EGFR) con attività tirosin-kinasica

dimerizzazione� attivazione

AA BB

SrcP

P+

Meccanismi di attivazione di recettori della famiglia di ErbB

P Src

P

P

P

P

P

P P P P

MEK1 MEK2

-

P P

+

PTEN RAF

+

P

RAS

SOS

GBR2PI3K

AKt PP

+

PIP3 P

P

ERH 3

ERH 1ERH 2

Proliferazione

P

sopravvivenza

MEK1 MEK2

PP

P P

P P

+

mTOR

+

HER 2 risulta amplificato/ iperespresso in 15-20% di carcinomi della mammella

targeted HER2 therapy= terapia personalizzata

-> evidente miglioramento delle curve di sopravvivenza in donne-> evidente miglioramento delle curve di sopravvivenza in donne

con cancro HER2+

Linea guide ASCO-CAP 2013

raccomandazioni per migliorare l'accuratezza dei test per HER2

per far sì che nessun donna venga esclusa da questa “potential per far sì che nessun donna venga esclusa da questa “potential

life-saving therapy” con farmaci per HER2

Tutti i carcinomi infiltranti della mammella devono essere

sottoposti a test per HER2sottoposti a test per HER2

Un anno di trattamento negli USA= $70,000

Necessità di identificare le donne HER2 negative per evitare un trattamento inutile, potenzialmente tossico e evitare un trattamento inutile, potenzialmente tossico e COSTOSO

HER2:HER2:

metodi attualmente impiegatimetodi attualmente impiegati

IPERESPRESSIONE PROTEICA

IMMUNOISTOCHIMICAIMMUNOISTOCHIMICA

AMPLIFICAZIONE GENICA

IBRIDIZZAZIONE IN SITU (FISH/CISH/SISH)IBRIDIZZAZIONE IN SITU (FISH/CISH/SISH)IBRIDIZZAZIONE IN SITU (FISH/CISH/SISH)IBRIDIZZAZIONE IN SITU (FISH/CISH/SISH)

Score immunoistochimico ASCO-CAP2013

HER2 negativi (0-1+): positività di membrana, assente o

incompleta, appena percettibile in <10% delle cellule

HER2 positivi ( score 3+): positività forte e completa in

> 10% delle cellule

Casi 2+: modificati rispetto allo score FDA e ASCO-CAP 2007

a)positività debole/moderata anche se incompleta in>10%

b) positività forte e completa in<10% delle cellule

Nei casi 2+, ripetere il test con ISH

Nel valutare il risultato di HER2, bisogna sempre

tenere in mente il quadro clinico generaletenere in mente il quadro clinico generale

p.es: fare attenzione al tumore G1, positivo per

recettori ormonali, basso ki67 ma HER2+

O, viceversa, al tumore G3, negativo per recettoriO, viceversa, al tumore G3, negativo per recettori

ormonali, alto Ki67 ma HER2-

HER2-negative (1+) breast cancer with unfavorable prognostic features: to FISH or not to FISH? (Iorfida et al. Ann.Oncol. 2012)

Il 13% dei casi 1+ ma che presentano almeno un Il 13% dei casi 1+ ma che presentano almeno un ulteriore fattore di rischio risultano amplificati in ISH

Fattori di rischio

alto grado, alto Ki 67,

invasione vascolare estesa, invasione vascolare estesa,

LN+,

rec.ormonali assenti

CISH CISH Chromogenic In Situ Hybridization

Permette di individuare al microscopio ottico in in

campo chiaro campo chiaro specifiche sequenze geniche a

livello della singola cellula tramite la deposizione

di un cromogeno

Marcatura fluorescente/cromogenica

Definizione ibridizzazioneDefinizione ibridizzazione

Reazione specifica di una sonda Reazione specifica di una sonda con un acido nucleico targetcon un acido nucleico target

TT

TTA A A AC

CG G

T T T T TG G GGC CCCA A A A

Sonda

DNA Target

fluorescente/cromogenica

3’

3’

5’

5’

T T T T TG G GGC CCCA A A A

T T TA A A AC CG GT

Ibridazione

Ibrido

Marcatura fluorescente/cromogenica

CISH: la proceduraCISH: la procedura

Il pretrattamento

La dispensazione della sonda

La denaturazione

L’ibridizzazione

I lavaggi di stringenza

La rivelazione

La dispensazione della sonda

La rivelazione

La controcolorazione

L’interpretazione dei risultati

I controlli

HER2 cromosoma 17 cromosoma 17 (centromero)(centromero)

Le sondeLe sonde

(centromero)(centromero)

Sonde a DNA Sonde a DNA coniugate conconiugate con

Digossigenina Biotina/digossigeninaBiotina/digossigenina

Una copia del gene HER2 appare come un piccolo, singolo “dot” brunastro

Patterns riscontrabili (63xPatterns riscontrabili (63x--100x)100x)

Il segnaleIl segnale

Patterns riscontrabili (63xPatterns riscontrabili (63x--100x)100x)

Singoli “dot” Clusters

Risultati (ASCO/CAP 2013) Risultati (ASCO/CAP 2013) Da osservare in una popolazione omogenea e contiguaDa osservare in una popolazione omogenea e contigua

Risultato amplificato:

Single-probe: > = 6.0 segnali di HER2/cell in media

Dual-probe : HER2/CEP17 ratio > = 2.0 HER2/CEP17 ratio < 2.0 con numero medio di segnali HER2 HER2/CEP17 ratio < 2.0 con numero medio di segnali HER2 > = 6.0 segnali/cell

Risultato equivoco:

Single-probe: numero di segnali di HER2 compreso tra 4.0 e 6.0 /cell

Dual-probe: HER2/CEP17 ratio < 2.0 con numero medio di segnali HER2� compreso tra 4.0 and 6.0 segnali/cell.� compreso tra 4.0 and 6.0 segnali/cell.

Risultato negativo:

Single-probe; numero medio di segnali HER2 < 4.0 segnali/cell

Dual-probe HER2/CEP17 ratio < 2.0 con numero medio di segnali HER2 < 4.0 segnali/cell

Artefatti tecnici:

CDI diagnosticato come HER2 3+ su core biopsy nel 2008MTS epatica HER2 negativa dopo 2 anni

Falso positivo: aspecificità causata aspecificità causata dall’incompatibilità tra anticorpo e sistema di rivelazione

Carcinoma duttale infiltrante

ampia area centrale HER2 neg Linfonodo HER2 3+

focolai HER 2=3+ nel grasso peri-linfonodale

Eterogeneità tumorale ??

Falsa negatività del tumore primitivo per inadeguata fissazione??

Anno 2006: Donna di 65 anni:Carcinoma lobulare infiltrante (G3) metastatico al linfonodo sent.

Her 2 neg 1+ HER2 neg anche sul LNS

Dopo 6 anni mts cutanea addominale HER2 =3+

ripetendo Her2 sul tumore primitivo: rare cellule 3+

Possibili variazioni di HER2 tra mts e tumore primitivo ( 5-15% dei casi)

Ipotesi

Cause biologiche: Vero cambiamento della biologia del tumore?

Etereogeneità tumorale? Etereogeneità tumorale?

Cause tecniche: Casi 1+ con fattori di rischio ma non testati all’ISH?

Diverse modalità di esecuzione di HER2 nel corso degli anni?

Diversi criteri di lettura con le nuove linee guida ASCO-CAP 2013

Testare HER2 anche nelle recidive e nelle metastasi, specie se Testare HER2 anche nelle recidive e nelle metastasi, specie se il tumore primitivo era negativo (ESMO), (ASCO), (NCCN)

La re-biopsia ha portato ad un cambiamento della terapia nel 14% delle pazienti

"A bad test can be just as bad as a

bad drug."bad drug."

Non può esistere un buon patologo senza un

buon laboratorio di Anatomia Patologica

GRAZIE!

It is essential to ensure that time to fixation (cold ischemic time) and

time in fixativetime in fixative

(which has increased from 6 to 48 hours to 6 to 72 hours in this Update

on the basis of available data and to conform with the ASCO/CAP) are recorded and considered in defining the test result.

COMMENT: Fixation time and HER2/neu assessment.

Bohn OL, Sanchez-Sosa S (Am J Clin Pathol. 2011)

The authors evaluated only 3+ carcinomas and did not include 2+ equivocal cases,

Numerous studies have shown high concordance between FISH and ICH 3+tumors; Numerous studies have shown high concordance between FISH and ICH 3+tumors;

in contrast, 2+ cases are the most likely to be discordant by FISH.

Time and type of fixation and the postfixation treatment contribute to the quality of

ISH staining results

..

further studies on preanalytic factors including 2+ equivocal cases are necessary to demonstrate that formalin fixation time has little or no impact on HER2/neu

expression

ma anche le altre avrebbero avuto score 2+ secondo ASCO-CAP 2013 e amplificazione alla SISH

-> caso di etereogeneità tumorale

Etereogeneità tumorale:�

Efficacia della “targeted” terapia adiuvante per Her2 anche nei tumori luminal-type (positivi per Her2 anche nei tumori luminal-type (positivi per estrogeni e negativi per HER2 )

-->blocca la piccola popolazione di stem cells, HER2+ che pur costituendo solo 1-5% del HER2+ che pur costituendo solo 1-5% del tessuto tumorale, potrebbe essere responsabile della crescita tumorale e delle metastasi!

Hasan Korkaya , Max S. Wicha, Cancer Research 2013