Laboratorio di Citologia e Istologia

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Laboratorio di Citologia e Istologia Dott. ssa A. Mauro Università degli Studi di Teramo CdL Biotecnologie

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Laboratorio di Citologia e IstologiaDott. ssa A. Mauro

Università degli Studi di Teramo

CdL Biotecnologie

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ISTOCHIMICA: SCIENZA CHE COMBINA LE TECNICHE DI BIOCHIMICA E ISTOLOGIA

NELLO STUDIO DELLA COSTITUZIONE CHIMICA DEL TESSUTO E DELLE CELLULE.

IMMUNOLOGIA: SCIENZA CHE STUDIA IL SISTEMA IMMUNITARIO, GLI ASPETTI

MEDIATI DALLE CELLULE UMORALI DELL'IMMUNITÀ E LE RISPOSTE IMMUNITARIE.

IMMUNOISTOCHIMICA (IHC): TECNICA PER LA LOCALIZZAZIONE DI UN ANTIGENE

CONOSCIUTO NEL TESSUTO UTILIZZANDO UN ANTICORPO SPECIFICO DIRETTO

CONTRO L’ANTIGENE

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Il principio dell‘ IHC è di localizzare gli antigeni nella coltura cellulare o nella sezione

di tessuto mediante l'uso di anticorpi marcati attraverso interazioni antigene-

anticorpo che sono visualizzati da un marcatore come un colorante fluorescente,

enzima o oro colloidale.

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IMMUNOISTOCHIMICA- STEPS

Colture cellulari

Sezioni tissutali

Preparazione delle sezioni

Smascheramento dei siti dell’Antigene

Bloccaggio

Incubazione con Anticorpo (Ab)

Lavaggio

Rilevamento legame Antigene-Ab

Lavaggio

Contrasto dei nuclei

Montaggio

Osservazione Microscopia

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Preparazione delle sezioni

FISSAZIONE FISICA PER CONGELAMENTO:

Gli antigeni sono inalterati ma la morfologia delle

sezioni potrebbe essere alterata durante la

procedura.

FISSAZIONE CHIMICA (Paraformaldeide) e INCLUSIONE:

La struttura del tessuto viene preservata ma nelle procedure di inclusione l’alcool può estrarre

i lipidi.

SPARAFFINATURASolvente organico = XYLENE .

REIDRATAZIONEalcooli discendenti (100%, 70% , 50% e poi H₂O)

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PROTOCOLLO IHC

per Sezioni Incluse

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Le sezioni sparaffinate e reidratate devono essere trattateper esporre gli epitopi antigenici attraverso la reversioneparziale della fissazione aumentando l'accessibilitàdell'anticorpo.

Smascheramento dell’Antigene

Heat Induced Epitope Retrieval (HIER)

Citrate Buffer (pH 6)Tris-EDTA Method (pH 9)

in

Water bathAutoclaveMicrowave ovenPressure cooker

for

15-60 min

Proteolytic Induced Epitope Retrieval (PIER)

Proteinase KTrypsinPepsinPronaseProtease

at 37°C

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Preparazione delle sezioni

Smascheramento dei siti dell’Antigene

Bloccaggio

Incubazione con Anticorpo (Ab)

Lavaggio

Rilevamento legame Antigene-Ab

Lavaggio

Contrasto dei nuclei

Montaggio

Osservazione Microscopia

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Bloccaggio dei siti non specifici

Prima di utilizzare gli anticorpi per rilevare le proteine mediante immunoistochimica, tutti gli epitopi sul campione di tessuto devono essere

bloccati per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.

Blocking è effettuato con:Normal serum Bovine Serum AlbuminMilk

Attenzione!

È importante non utilizzare il siero normale proveniente dalla fonte primaria di anticorpi, poiché le proteine sieriche provenienti da questa fonte saranno riconosciute dal tuo anticorpo secondario, peggiorando la colorazione di fondo, non meglio.

Un blocco insufficiente comporterà un forte rumore di fondo e un blocco eccessivo può mascherare il segnale.

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Preparazione delle sezioni

Smascheramento dei siti dell’Antigene

Bloccaggio dei siti non specifici

Incubazione con Anticorpo (Ab)

Lavaggio

Rilevamento legame Antigene-Ab

Lavaggio

Contrasto dei nuclei

Montaggio

Osservazione Microscopia

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Incubazione con Anticorpo Primario (I Ab)

1-2 ore a T. ambienteOvernight at 4°C

Ab Policlonali Ab Monoclonali

Polyclonal antibodiesAntigeni complessi di grandi dimensioni possono avere più EPITOPI e generare diversi tipi di

anticorpi. Le miscela di anticorpi diversi per un singolo antigene sono chiamati anticorpi policlonali.

Monoclonal antibodies: Anticorpi specifici per un singolo EPITOPO e prodottida un singolo clone sono chiamati anticorpi monoclonali.

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Policlonali vs MonoclonaliPolyclonal antibodies:

Economico da produrreLe competenze richieste per la produzione sono basseRelativamente veloce da produrre

Genera associazione non specifica

Monoclonal antibodies:

Costoso da produrreLa formazione è necessaria per la tecnologia utilizzataGli ibridomi impiegano molto tempo per essere prodotti

Genera associazione specifica Una volta creato un ibridoma, è una fonte costante e rinnovabile

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Preparazione delle sezioni

Smascheramento dei siti dell’Antigene

Bloccaggio dei siti non specifici

Incubazione con Anticorpo (Ab)

Lavaggio

Rilevamento legame Antigene-Ab

Lavaggio

Contrasto dei nuclei

Montaggio

Osservazione Microscopia

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30-60 min at T.a.

L'anticorpo secondario deve essere diretto contro la regione costante dell'anticorpo primario. Così …

…COME VIENE PRODOTTO?

Rilevamento del legame Antigene-I Ab

INCUBAZIONE CON ANTICORPO SECONDARIO (II Ab)

Preparazione delle sezioni

Smascheramento dei siti dell’Antigene

Bloccaggio dei siti non specifici

Incubazione con Anticorpo Primario (I Ab)

Lavaggio

Rilevamento legame Antigene-IAb

Lavaggio

Contrasto dei nuclei

Montaggio

Osservazione Microscopia

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Marcatore Fluorescente:•Fluorescein•Texas Red

marcatore Enzimatico:• Horseradish peroxisade (HRP)

Colloidal gold

Texas Red

HRP-DAB (3,3'-Diaminobenzidine)

Colloidal gold

One step method Two step method Visualizzazione del legame anticorpo-antigene

Incubazione with DAB + H₂O₂ per 5 min at RT

Rilevamento del legame Antigene-I Ab

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IMMUNOISTOCHIMICA - STEPS

Incubation with 3% H₂O₂for 45 min at RT

Preparazione delle sezioni

Smascheramento dei siti dell’Antigene

Bloccaggio dei siti non specifici

Incubazione con Anticorpo Primario (I Ab)

Lavaggio

Rilevamento legame Antigene-IAb

Lavaggio

Contrasto dei nuclei

Montaggio

Osservazione Microscopia

Block endogenous peroxidase

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Incubation with secondary biotynilatedantibody for 30-60 min at RT

Washing

Incubation with ABC complex for 30 min at RT

Washing

Incubation with DAB + H₂O₂ for 5 min at RT

Avidin-Biotin Complex (ABC)

Direct method:

Short and quickInsensitive due to little signalamplification

Indirect method:

More sensitiveSingle secondary antibody can be usedagainst multiple antigens of the samespeciesMore time and reagents

La scelta del rilevamento diretto o indiretto è spesso prescritta dal livello di espressione dell'antigene bersaglio

Rilevamento del legame Antigene-I Ab

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Contrasto dei nuclei e montaggio

Incubazione con DAPI for 1-5 min at RTMontaggio conAqueous Mounting Medium

Incubazione con ENTELLAN per 1-5 min at RT disidrataz. in Alcol (50%, 70% , 100% e Xylene)Montaggio con Non-Aqueous Mounting Medium

Osservazione Microscopio Ottico

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Wet room

…Più DettagliPositive control:Cellule o tessuti che sono noti per contenere antigeni specificiRileva falsi negativi a causa di fissazione ed elaborazioneViene utilizzato per convalidare il protocollo o la procedura utilizzata

Negative control:Omissione dell'anticorpo primario con lo stesso tessuto e proceduraRileva falsi positivi a causa del legame aspecifico

Choise of antibodies dilutions?

DATASHEET