Laboratorio di Citologia e Istologia

Click here to load reader

  • date post

    16-Oct-2021
  • Category

    Documents

  • view

    1
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of Laboratorio di Citologia e Istologia

Diapositiva 1Università degli Studi di Teramo
CdL Biotecnologie
ISTOCHIMICA: SCIENZA CHE COMBINA LE TECNICHE DI BIOCHIMICA E ISTOLOGIA
NELLO STUDIO DELLA COSTITUZIONE CHIMICA DEL TESSUTO E DELLE CELLULE.
IMMUNOLOGIA: SCIENZA CHE STUDIA IL SISTEMA IMMUNITARIO, GLI ASPETTI
MEDIATI DALLE CELLULE UMORALI DELL'IMMUNITÀ E LE RISPOSTE IMMUNITARIE.
IMMUNOISTOCHIMICA (IHC): TECNICA PER LA LOCALIZZAZIONE DI UN ANTIGENE
CONOSCIUTO NEL TESSUTO UTILIZZANDO UN ANTICORPO SPECIFICO DIRETTO
CONTRO L’ANTIGENE
Il principio dell‘ IHC è di localizzare gli antigeni nella coltura cellulare o nella sezione
di tessuto mediante l'uso di anticorpi marcati attraverso interazioni antigene-
anticorpo che sono visualizzati da un marcatore come un colorante fluorescente,
enzima o oro colloidale.
Bloccaggio
sezioni potrebbe essere alterata durante la
procedura.
FISSAZIONE CHIMICA (Paraformaldeide) e INCLUSIONE:
La struttura del tessuto viene preservata ma nelle procedure di inclusione l’alcool può estrarre
i lipidi.
SPARAFFINATURA Solvente organico = XYLENE .
REIDRATAZIONE alcooli discendenti (100%, 70% , 50% e poi HO)
PROTOCOLLO IHC
Le sezioni sparaffinate e reidratate devono essere trattate per esporre gli epitopi antigenici attraverso la reversione parziale della fissazione aumentando l'accessibilità dell'anticorpo.
Smascheramento dell’Antigene
Citrate Buffer (pH 6) Tris-EDTA Method (pH 9)
in
for
Proteinase K Trypsin Pepsin Pronase Protease
at 37°C
Preparazione delle sezioni
Bloccaggio
Prima di utilizzare gli anticorpi per rilevare le proteine mediante immunoistochimica, tutti gli epitopi sul campione di tessuto devono essere
bloccati per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.
Blocking è effettuato con: Normal serum Bovine Serum Albumin Milk
Attenzione!
È importante non utilizzare il siero normale proveniente dalla fonte primaria di anticorpi, poiché le proteine sieriche provenienti da questa fonte saranno riconosciute dal tuo anticorpo secondario, peggiorando la colorazione di fondo, non meglio.
Un blocco insufficiente comporterà un forte rumore di fondo e un blocco eccessivo può mascherare il segnale.
Preparazione delle sezioni
Incubazione con Anticorpo (Ab)
1-2 ore a T. ambiente Overnight at 4°C
Ab Policlonali Ab Monoclonali
Polyclonal antibodies Antigeni complessi di grandi dimensioni possono avere più EPITOPI e generare diversi tipi di
anticorpi. Le miscela di anticorpi diversi per un singolo antigene sono chiamati anticorpi policlonali.
Monoclonal antibodies: Anticorpi specifici per un singolo EPITOPO e prodotti da un singolo clone sono chiamati anticorpi monoclonali.
Policlonali vs Monoclonali Polyclonal antibodies:
Economico da produrre Le competenze richieste per la produzione sono basse Relativamente veloce da produrre
Genera associazione non specifica
Monoclonal antibodies:
Costoso da produrre La formazione è necessaria per la tecnologia utilizzata Gli ibridomi impiegano molto tempo per essere prodotti
Genera associazione specifica Una volta creato un ibridoma, è una fonte costante e rinnovabile
Preparazione delle sezioni
Incubazione con Anticorpo (Ab)
…COME VIENE PRODOTTO?
INCUBAZIONE CON ANTICORPO SECONDARIO (II Ab)
Preparazione delle sezioni
Incubazione con Anticorpo Primario (I Ab)
Lavaggio
Colloidal gold
Texas Red
HRP-DAB (3,3'-Diaminobenzidine)
Colloidal gold
One step method Two step method Visualizzazione del legame anticorpo-antigene
Incubazione with DAB + HO per 5 min at RT
Rilevamento del legame Antigene-I Ab
IMMUNOISTOCHIMICA - STEPS
Incubation with 3% HOfor 45 min at RT
Preparazione delle sezioni
Incubazione con Anticorpo Primario (I Ab)
Lavaggio
Incubation with secondary biotynilated antibody for 30-60 min at RT
Washing
Washing
Incubation with DAB + HO for 5 min at RT
Avidin-Biotin Complex (ABC)
Indirect method:
More sensitive Single secondary antibody can be used against multiple antigens of the same species More time and reagents
La scelta del rilevamento diretto o indiretto è spesso prescritta dal livello di espressione dell'antigene bersaglio
Rilevamento del legame Antigene-I Ab
Contrasto dei nuclei e montaggio
Incubazione con DAPI for 1-5 min at RT Montaggio conAqueous Mounting Medium
Incubazione con ENTELLAN per 1-5 min at RT disidrataz. in Alcol (50%, 70% , 100% e Xylene) Montaggio con Non-Aqueous Mounting Medium
Osservazione Microscopio Ottico
Wet room
…Più Dettagli Positive control: Cellule o tessuti che sono noti per contenere antigeni specifici Rileva falsi negativi a causa di fissazione ed elaborazione Viene utilizzato per convalidare il protocollo o la procedura utilizzata
Negative control: Omissione dell'anticorpo primario con lo stesso tessuto e procedura Rileva falsi positivi a causa del legame aspecifico
Choise of antibodies dilutions?