LA DIFFRAZIONE IN BIOLOGIA

APPROFONDIMENTI

Qui di seguito puoi trovare materiale di approfondimento:

- per bambini e ragazzi della scuola primaria e scuola secondaria di primo grado:

Il misterioso mondo delle macromolecole. La magia dei cristalli di proteina.

https://drive.google.com/open?id=0B1324kzdornveFRfdVRYdUc3RlU

- Per studenti di scuola secondaria superiore e università:

Cos’è la Biologia Strutturale?

https://drive.google.com/open?id=0B1o7N_1nDW54R09LRmNaWTlxOVU

Per un approfondimento su come è fatto un sincrotrone, quali tecniche utilizza e quali ricerche vi

si svolgono, puoi consultare il sito web del sincrotrone Elettra di Trieste

https://www.elettra.trieste.it/it/index.html

oppure accedere al canale youtube LightforScience curato dalla European Synchrothron Radiation

Facility (ESRF) di Grenoble (Francia)

https://www.youtube.com/user/LightforScience

Se vuoi organizzare una visita al sincrotrone Elettra o ESRF clicca qui:

https://www.elettra.trieste.it/it/access-to-the-lab/visits/visite-guidate-per-il-pubblico.html

http://www.esrf.eu/home/about/visit.html

Cos'è la biologia strutturale?

Una branca della scienza che si adopera per ottenere unadescrizione atom

ica completa delle m

acchine molecolari

in tutti i loro stati funzionali e nel loro ambiente “nativo”

Spaccato di una cellula di E

scherichia coli: proteine transm

embrana e flagello in verde;

DN

A genom

ico e nucleosomi in giallo;

proteine regolatorie in arancione; ribosom

i in viola; proteine del citoplasm

a (metabolism

o) in azzurro; proteine nascenti in bianco.

© D

avid Goodsell, The S

cripps Research Insitute, La Jolla, C

A, U

SA

Ufficialm

ente è nata nel 1962 con larisoluzione delle strutture atom

iche delD

NA

e della mioglobina (la proteina dei

muscoli rossi).

Da allora il lavoro dei biologi strutturali è

stato riconosciuto con 45 premi N

obel perla Fisiologia e M

edicina o per la Chim

ica.

Scopi della biologia strutturale

●A

nalisi del dettaglio atomico delle com

ponentibiologiche di cellule e tessuti

●A

nalisi del dettaglio atomico delle reazioni

biologiche●

Com

prensione delle relazioni tra struttura efunzione

●C

omprensione dei processi biologici in sede

normale, pre-patologica e patologica

Metodi sperim

entali per determinare la struttura

delle macrom

olecole

Alta risoluzione

cristallografia a raggiX | N

MR

| cristallografia elettronica

Media risoluzione

microscopia elettronica | diffrazione di fibre | S

pettro-m

etria di massa | S

AX

S | M

icroscopia a Forza Atom

ica

Metodi Spettroscopici N

MR

| dicroismo circolare | A

ssorbanza | Fluorescenza | Fluorescenza anisotropa | diffusione della luce

Metodi C

himici

scambio H

-D | m

utagenesi sito specifica | modificazioni

chimiche | proteom

ica

Metodi term

odinamici

Equilibrio di (un)folding

Metodi com

putazionali predizione della struttura delle Proteine | D

ocking molecolare

Cristallografia a raggi X

raggi X

•A

ttualmente tecnica di elezione per la determ

inazionedi strutture 3D

a risoluzione atomica

•Tecnica indiretta: l’im

magine va ricostruita

•N

on ci sono limitazioni nelle dim

ensioni dellem

acromolecole

•S

vantaggi:•cristalli singoli•altam

ente ordinati•ragionevolm

ente grandi (80-100µm)

Perché i raggi X

?

Per poter visualizzare due oggetti com

e entitàseparate, la lunghezza d’onda della radiazioneelettrom

agnetica deve essere dello stesso ordinedi grandezza della distanza tra gli oggetti

distanza interatomica ≈1Å

λraggiX = 0.1÷2Å

⇒

con i raggiX “vedo” gli atom

i

Perché cristallografia

cristallografia e nonm

iscroscopia a raggiX?

Non esistono lenti in grado di focalizzare i raggiX

⇒

la matem

atica ci viene in aiuto

Vediam

o più da vicino i cristalli dim

acromolecole biologiche

• Dim

ensioni ridotte (40µm - 500µm

)• M

eccanicamente fragili

• Sensibili alla tem

peratura• S

ensibili al danno radiologico• A

lto contenuto di solvente (40%-60%

)• S

i fratturano se disidratati• D

eboli proprietà ottiche (basso potere diffrangente)

Com

e si preparano i cristalli

●M

etodi di cristallizzazione–

Param

etri che influenzano la cristallizzazione●

Agenti precipitanti

●S

trategie

Com

e si formano i cristalli

Per un processo di nucleazione che prevedeun’aggregazione lenta e ordinata dellem

acromolecole in un reticolo cristallino con

contemporanea esclusione del solvente

Param

etri che influenzano la cristallizzazione

●C

aratteristiche della macrom

olecola:–

Purezza (>98%

) ⇒ S

DS

-PA

GE

–O

mogeneità e m

onodispersione ⇒ M

S e/o Light S

cattering–

Conform

azione nativa ⇒ C

D●

Param

etri chimico-fisici

–S

tabilità alla degradazione proteolitica●

Param

etri biochimici e biofisici

–Tag di espressione

–P

arti flessibili●

Param

etri biologici–

Necessità o m

eno di cofattori e/o ligandi–

Necessità o m

eno di modificazioni post-traduzionali

●Term

odinamica

Termodinam

icaS

oluzionesovrasatur

Metodi di cristallizzazione: tipologie

●D

iffusione in fase di vapore

–G

occia capovolta (hanging drop)

–G

occia seduta (sitting drop)

●M

icrodialisi

●B

atch

Agenti precipitanti

●S

ali–

Disidratazione per com

petizione con H2 O

–E

s.: (NH

4 )2 SO

4 ; (Li)2 SO

4 ; NaC

l●

Polim

eri–

Segregazione entropica (esclusione di volum

e)–

Es.: P

EG

400 ÷ 8000●

Solventi organici

–R

iduzione delle proprietà elettriche–

Es.: M

PD

; Etilenglicole

Strategie

●P

reparazione della macrom

olecola:–

Concentrazione: 10-100m

g/ml

–A

ggiungere riducenti se ci sono Cys libere

–A

ggiungere Azide sodica se si usa P

EG

●D

ecidere uno screen iniziale–

Braod sparse m

atrix (si varia la temperatura, il pH

, gli agentiprecipitanti e la loro concentrazione in m

odo molto grossolano)

–K

it comm

erciali

Ottengo cristalli o

formazioni prom

ettentiN

on ottengo cristalli

Cam

bio condizioni,aggiungo additivi,aggiungo detergenti

Restringo la m

atrice dicondizioni perottim

izzare la crescita

Abbiam

o ottenuto cristalli … e poi?

●R

accolta dati di diffrazione–

Sorgente ad anodo rotante

–Luce di sincrotrone

●A

nalisi matem

atico-statistica dei dati (Am

piezza)–

Indicizzazione; scalaggio–

Grafico di W

ilson, coefficiente di Matthew

s●

Determ

inazione della fase–

MIR

/ MIR

AS

/ SIR

/ MA

D–

MR

●A

nalisi delle mappe di densità elettronica

–Trasform

ata di Fourier–

Costruzione del m

odello atomico

●A

ffinamento della struttura

–C

ontrollo qualità

Estrazione dell’inform

azionebiologica dai dati strutturali

⇒

Raccolta dati

Apparato sperim

entale:

- Cristallo m

ontato su un opportuno supporto- capillare- loop

- Sorgente di raggi X- Lunghezza d’onda fissa- Lunghezza d’onda variabile

- Rivelatore/registratore delle onde diffratte

Raccolta dati

Temperatura am

biente(293-298K

)Tem

perature criogeniche(50 - 100K

)

Il cristallo vienem

ontato in un capillaredi quarzo

Il cristallo, protetto con unanticongelante, viene m

ontatoin un loop di nylon e raffreddatosotto flusso di N

2 o He liquidi

Raccolta dati

Lunghezza d’onda fissaλ(C

ukα ) = 1.5486Å

Lunghezza d’onda fissa e/ovariabile

Anodo

rotante(m

acchinaradiologica)

Sincrotrone

• bassa del intensità raggio diretto• tem

pi di esposizione lunghi• basso danno radiologico (atem

perature criogeniche)

• intensità 100-1000 maggiore

• tempi di esposizione brevi

• alto danno radiologico• λ m

odulabile

Raccolta datiIm

aging plate conrivelatore C

harge Coupled

Device (C

CD

detector)

Imaging plate con

rivelatore di area (areadetector)

Tempo di lettura e im

magazzinam

ento dell’imm

agine di diffrazione:2-6 m

inuti1-5 secondi

… e la m

atematica?

Formazione di un’im

magine ottica

oggetto

Piano del-

l’imm

agine

Piano focale, contenente l’im

magine di diffrazione

Imm

aginedell’oggetto

L’imm

agine dell’oggetto el’im

magine di diffrazione

sono in relazione tra diloro tram

ite unatrasform

ata di Fourier

Ora, separiam

o la lente in due metà:

oggetto

Imm

aginedell’oggetto(diffrazione diunadiffrazione)

L1

L2

Piano focale, contenente

l’imm

agine di diffrazione

Trasformata

di Fourier“fisica”

Trasformata di

Fourier “matem

atica”

L’imm

aginedell’oggetto è unaTF della diffrazionee la diffrazione èuna TF dell’oggetto

Esem

pi di Trasformate di Fourier

⇒TF

⇒La Trasform

ata di Fourier (ossial’im

magine di diffrazione) di una serie di

linee è una serie di punti e viceversa

La Trasformata di Fourier di un

reticolo è sempre un reticolo le cui

dimensioni sono inversam

enteproporzionali a quelle del reticoloreale:

Reticolo reale

Reticolo reciproco

a*=1

a×sing

b*=1

b×sing

c*=1

c×sing

ab

a*b*

⇒TF

⇒

⇒TF

⇒

… e le m

olecole?

L’imm

agine didiffrazione di unam

olecola corrispondealla Trasform

ata diFourier della m

olecolastessa

… perché un cristallo?

L’imm

agine di diffrazione da una singola molecola

- è troppo debole (↓segnale/rumore)

inconfondibile dalla radiazione di fondo (aria + soluzione)⇒

impossibile ricostruire la m

olecolaa

bc

a

bc

In un cristallo, miliardi di

molecole sono disposte

in modo ripetuto e

ordinato nelle tredim

ensioni

Cristallo ⇒

amplificatore del segnale

⇒ buone im

magini di diffrazione (↑segnale/rum

ore)⇒

si può ricostruire la molecola

La ripetizione di ognuno di questim

oduli nello spazio, secondocom

binazioni di operazioni disim

metria, produce 65 gruppi spaziali

(reticoli cristallini)

Ogni m

olecola si può arrangiarenello spazio secondo 14 diversi tipidi reticoli di B

ravais (cella unitaria),appartenenti a 7 sistem

i cristallini:

a ≠ b ≠ c; α≠β≠γ Triclino

a ≠ b ≠ c; α=β=90°, γ≠90°

Monoclino

a = b ≠ c; α

=β=γ=90

Tetragonale

a ≠ b ≠ c; α=β=γ=90°

Ortorom

bico

a = b = c; α=β=γ=90°

Cubico

a = b ≠ c; α

=β=90°, γ=120°

Esagonale

Trigonale/R

omboedrico

a = b = c;α

=β=γ≠90°

Perché i cristalli di m

olecole diffrangono i raggi X?

●La radiazione elettrom

agnetica dei raggi X interagisce con gli elettroni

degli atomi

●L’intensità della radiazione diffratta da ciascun atom

o è direttamente

proporzionale al numero di elettroni (densità elettronica)

●Le onde diffratte da ciascun atom

o si rinforzano perché gli atomi sono in

fase tra loro●

Le molecole ordinate nel cristallo si com

portano come un reticolo

λ

Radiazione incidente

Radiazione diffratta

ϑ d

• Si ha diffrazione solo

se viene rispettata lalegge di B

ragg: nλ= 2dsinϑ

La risultante dell’onda diffratta da un cristallom

olecolare:

●È

proporzionale al numero di elettroni irradiati dal raggio

diretto (fattori di struttura)●

È la som

matoria delle onde diffratte da atom

i in fase traloro (interferenza costruttiva)

●È

una funzione discreta puntiforme (le onde diffratte da

atomi non in fase si elidono, interferenza distruttiva)

●C

ontiene informazioni sull’orientam

ento delle molecole nel

reticolo cristallino (gruppo spaziale)●

Contiene inform

azioni sulla disposizione degli atomi della

molecola nello spazio (struttura 3D

)●

È una grandezza vettoriale definita da un’intensità, una

direzione e un verso

L’imm

agine di diffrazione:

●È

la grandezza sperimentale che m

isuriamo

●È

la grandezza scalare (intensità) del vettore onda diffratta●

da 3D in 2D

⇒ perdiam

o la direzione del vettore ⇒

direzione in inglese “phase” ⇒ perdiam

o la fase, ossiacom

e è orientata la molecola nell’unità m

inima che si ripete nel

cristalloQ

uali dati diretti ricaviamo

dall’imm

agine 2D?

gruppo spaziale natura e dim

ensioni dellacella unitaria num

ero di molecole che si

ripetono nella cella risoluzione della m

olecola

Raggio diretto

schermato

Diffrazione

diffusa (H2 O

)

2.0Å

3.5-4.0Å

30Å

Formazione dell’im

magine di diffrazione

1.Il raggio che incide sul cristallo viene diffratto in tutte ledirezioni (360°) da tutti gli atom

i nel reticolo:

2.O

gni atomo nel reticolo reciproco genera un’onda che

contiene informazioni sul tipo di atom

o, la sua occupanza e ilfattore term

ico (B):

3.L’onda diffratta risultante viene visualizzata com

e imm

aginedi diffrazione dallo scherm

o fluorescente e registrata sulcom

puter

4.P

er raccogliere tutti i riflessi di ciascun piano il cristallo vienefatto oscillare intorno alla posizione di riposo di una quantità(Δϕ) proporzionale alle dim

ensioni della cella

5.P

er raccogliere le onde diffratte in tutte le direzioni il cristalloviene fatto ruotare lungo l’asse verticale di tanti gradi finché laraccolta è com

pleta

Analisi dei dati

I programm

i di indicizzazione:

analizzano tutte le imm

agini didiffrazione

misurano le intensità dei picchi (spot) m

isurano le posizioni dei picchi

• ricavano le dimensioni della cella

unitaria del reticolo reciproco e quindianche quelle del reticolo reale • ricavano il gruppo spaziale• scrivono in un output le I relative adogni posizione nello spazio reciproco(indici h, k, l)• indicano la bontà del datosperim

entale

⇓

Param

etri statistici dacontrollare: m

osaicità (disordine intrinseco) com

pletezza, ridondanza I/σ(I)

Analisi dei dati

I programm

i di scalaggio:

analizzano i dati indicizzati li norm

alizzano rispetto ad un’origine arbitraria trasform

ano le I misurate in fattori di struttura

(|F|)

• producono il grafico di Wilson, dalla cui

regressione lineare si ricava:• fattore di m

obilità termica (B

)• vero lim

ite di risoluzione dei dati

• calcolano il volume occupato da atom

inella cella (coefficiente di M

atthews):

• % solvente e %

macrom

olecola• n

o molecole nell’unità asim

metrica.

• NO

N indicano com

e è orientata lam

olecola nell’u.a.

⇓

Resolution

log<I>fi 2

å

h k l I

Posso calcolare la densità elettronica?

Am

piezza dei fattori di struttura (I = |F| 2)Fase dei fattori distruttura, persa durantel’esperim

ento• S

perimentalm

ente misuriam

o le intensità delle onde diffratte dagli atomi nel

reticolo cristallino.• La densità elettronica nel punto (xyz) è data dalla risultante di tutte le ondediffratte dal piano (hkl) nel cristallo, la cui am

piezza dipende dal numero di

elettroni presenti e la cui fase dipende dalla somm

a delle fasi.

NO

NO

Il problema della fase

1.L’equazione della densità elettronica (trasform

ata di Fourierdell’im

magine di diffrazione) è una funzione a tre variabili

con due incognite (α e ρ)2.

Non c’è una relazione form

ale tra la fase (α) e l’ampiezza

(|F|) dei fattori di struttura3.

α e |F| sono due variabili indipendenti4.

L’unica relazione passa attraverso la densità elettronica ρ5.

La fase (fisicamente) dipende in ultim

a analisi dall’origine,ossia da com

e e dove è orientata la molecola nell’u.a.

6.C

omunque scegliam

o l’origine, il valore numerico

dell’ampiezza non cam

bia

Una conoscenza a priori di qualche dettaglio della struttura

o della densità elettronica ci può aiutare a “scoprire” lafase

Com

e determino la fase?M

etodi direttiS

ostituzioneisom

orfa singola om

ultipla S

IR - M

IRS

ostituzionem

olecolareM

RS

ostituzione isomorfa

con diffrazioneanom

ala S

IRA

S - M

IRA

SD

iffrazioneanom

ala alunghezza d’ondasingola o m

ultipla S

AD

- MA

D

Metodi di

interferenza

Metodi di determ

inazione della fase

Metodo

Assunto (conoscenza a priori)

Metodi diretti

Pochi atom

i (max1000)

MR

Modello om

ologo

Sostituzione isom

orfa(S

IR, M

IR)

Pochi atom

i pesanti (e- > 30)

Diffrazione anom

ala(M

AD

, SIR

AS

, MIR

AS

)A

tomi che si com

portano dadiffusori anom

ali

Metodi diretti

Prem

esso che la trasformata di Fourier è una funzione

veloce da calcolare

Se la m

olecola è piccola (max. 1000 atom

i)S

e i dati raccolti hanno una risoluzione estremam

ente buona(<1.3Å

)

Posso provare tutte le possibili orientazioni (fasi) e calcolare

le rispettive densità elettroniche finché non trovo unasoluzione soddisfacente

Sostituzione m

olecolare (MR

)

1.La m

olecola incognita ha un omologia di sequenza con una

molecola a struttura nota (m

odello) ⇒ 3D

sarà conservato2.

L’identità di sequenza deve essere >30%

ATTE

NZIO

NE

: l’informazione insita nella fase è m

aggioredi quella depositata nell’am

piezza

FTFT

FT-1

Am

piezza

Fase

Sostituzione m

olecolare (MR

)

• C

ome si usa il m

odello?S

i risolve la seguente equazione:

R = m

atrice di rotazionex

new = coordinate della mol. incognita

T = matrice di traslazione

xm

od = coordinate del modello

xnew

=Rx

mod +

T

•Il m

odello viene prima orientato nella cella della m

olecolaincognita e poi viene traslato nel punto di origine

⇒ m

iglior R

⇒ m

iglior T•

Ogni volta il program

ma calcola la trasform

ata inversa eparagona |F

mod | con i dati sperim

entali e genera una mappa

iniziale•

Lo sperimentatore guarda la m

appa e giudica se può iniziare acostruire o m

eno la propria molecola

Metodi basati sull’interferenza

SIR

, MIR

, SIR

AS

, MIR

AS

, SA

D, M

AD

Principio di base:

se ad un’onda incognita aggiungo un’onda nota, l’onda risultante mi

permetterà di risalire all’incognita

Mezzi sperim

entali utilizzati: A

tomi pesanti (alto num

ero di elettroni) A

tomi che a λ diverse diffrangono in m

odo diverso (diffusori anomali)

Metodi com

putazionali utilizzati: Funzione di Patterson M

etodi diretti

Sostituzione isom

orfa: aspetti teorici

Storia:

1908 - Groth utilizza C

uSeO

4 per risolvere la struttura di CuS

O4

1956 - Perutz applica la tecnica per la prim

a volta alle proteine

Principi base: Il cristallo viene m

esso in contatto con una soluzione di un saledi atom

i pesanti P

ochi atomi si posizionano in punti discreti e uguali in tutte le

molecole

Questa aggiunta non varia in alcun m

odo (<0.5%) i param

etridella cella o l’orientazione della m

olecola nella stessa(isom

orfismo)

L’imm

agine di diffrazione non cambia, cam

bia solo l’intensità dialcuni riflessi

Sostituzione isom

orfa: aspetti pratici

Cos’è un atom

o pesante? In generale qualsiasi atom

o con abbastanza elettroni da poterdiffrangere un segnale >> C, N

, O, P

In particolare metalli (di transizione e non), lantanidi, gas nobili,

alogenuri

Com

e sceglierlo? biologia della m

olecola (sequenza primaria, funzione)

grandezza del segnale aspettato per no atom

i condizioni di crescita del cristallo (forza ionica, pH

, additivi)

Attenzione: la m

aggior parte dei composti è tossica!

Sostituzione isom

orfa: aspetti pratici

Classi di atom

i pesanti (H, heavy atom

s)

Ioni metallici legati elettrostaticam

ente alla molecola

Metalli endogeni che possono essere facilm

ente sostituiti (es. Sr 2+

per Ca

2+)S

elenio (es. Se-M

et)C

omposti m

etallici legati covalentemente (reazione chim

ica sucristallo)

Agglom

erati multim

etallici per molecole > 500K

Da (es. cluster di oro

o di tantalio)G

as nobili come X

e e Kr

Alogenuri (es. tri-ioduri e basi brom

inate)

I più usati: K2 P

tCl4 , K

Au(C

N)2 , K

2 HgIO

4 , UO

2 (OA

c)2 , HgC

l2 ,K

3 UO

2 F5 , P

HM

B, E

MTS

, (CH

3 )3 Pb(O

Ac)

Sostituzione isom

orfa: aspetti pratici

Criteri di scelta:

Se ci sono C

ys libere o His ⇒

Mercuriali

His, C

ys o Met ⇒

Pt

Se c’è 1M

et/100 aa ⇒ sostituzione con S

eMet (nuova

espressione e purificazione)S

e la macrom

olecola è molto grande ⇒

cluster e/o lantanidiS

e ci sono cavità idrofobiche ⇒ X

e e/o Kr

Se la m

acromolecola è nota legare fosfolipidi ⇒

tungsteno

Condizioni di lavoro: 0.1-10m

M per 10’÷1h

Sostituzione isom

orfa singola (SIR

)

Derivato

Misuro le intensità dei

dati del derivato: |FP

H |

•D

etermino la posizione degli atom

i aggiunti (H)

•C

alcolo l’onda vettoriale FH

•D

a regole trigonometriche ricavo il vettore F

P

•O

ttengo una stima iniziale di α

P

Diffrazion

e dacristallonativo

Misuro le intensità

dei dati nativi: |FP |

Sostituzione isom

orfa singola (SIR

)

•C

ome ricavo α

P ?

• Com

e localizzo gli atomi

pesanti?

Con l’equazione di P

atterson(ΔF ) 2= (|F

PH | - |F

P | ) 2= =[|F

H |cos(αH -α

P )] 2ΔF

Dall’isom

orfismo: ΔF = |F

PH | - |F

P |D

alla trigonometria: ΔF = |F

H |cos(αH -α

P )

2 possibli soluzioni:x e (π/2)-x

Sostituzione isom

orfa singola (SIR

)

ΔF

Costruzione di H

arkerC

ostruzione di Argand

Ottengo 2 soluzioni: com

e procedo?Le provo entram

be e vedo quale produce mappe interpretabili

Uso un valore interm

edio (≈αH ), posiziono gli atom

i pesanti ericostruisco le m

appe un passo alla volta

Sostituzione isom

orfa multipla (M

IR)

Si prende un altro cristallo nativo e si fa diffondere un

diverso metallo pesante

Assunti:

Affinità per gruppi diversi dal

primo m

etallo Isom

orfismo anche nel secondo

caso

Risultato:

1 sola soluzione

Sostituzione isom

orfa

Problem

i:I cristalli possono disintegrarsi nella soluzione con atom

ipesanti

Non isom

orfismo

Cambiam

enti nella cellaRi-orientazione delle m

olecole nella cellaCam

biamenti conform

azionaliM

odifiche nella composizione del solvente e dei sali

Dim

inuzione del segnale totale di diffrazioneA

umento del danno radiologico

Errori nella localizzazione di tutti gli atom

i pesantiE

rrori sperimentali nelle m

isure di intensità

Diffrazione anom

ala

Tutti gli atomi con e

-> 20, contenenti orbitali di tipo d e/o f, adopportune lunghezze d’onda, sono in grado di assorbireparte della radiazione incidente

⇒ l’intensità dell’onda diffratta cam

bia perché si comportano

come se fossero degli atom

i diversi

⇒ R

accogliendo i dati dallo stesso cristallo a due o più λ differenti ottengo lo stesso risultato di una sostituzioneisom

orfa-6 e

-+2 e

-

Diffrazione norm

aleLegge di Friedel:Tutti i riflessi sim

metrici rispetto all’origine

(correlati tra loro da 2π-α

) sono uguali in intensitàe opposti in fase

|Fhkl | = |F

-h-k-l ||F(+)| = |F(-)|α

(-h-k-l) = -α(hkl)

In generale f(ϑ,λ)=f0 (ϑ)+f’(λ)+if”(λ)

Il fattore di diffrazione (f(ϑ,λ)) di ciascun atom

o (onda diffratta) dipendedalla legge di B

ragg (posizione nel reticolo (ϑ)) e dalla λ (energia) delraggio incidente.

In condizioni “normali”:

f’(λ)=0 non c’è dissipazione di energia tra l’onda incidente e quelladiffratta (dispersione=0)f”(λ)=0 l’energia non viene assorbita ⇒

l’onda diffratta dipende solo dalla posizione nel reticolo e i riflessicorrispondenti sono uguali a coppie

Diffrazione anom

ala

- Quando λ è tale da eccitare un e

- da un orbitale più interno,il segnale dell’onda diffratta viene m

odificato.- In queste particolari λ (edges, cuspidi) i term

ini f’(λ) e f”(λ)m

ostrano, rispettivamente, un m

inimo ed un m

assimo

- Il termine dispersivo [f’(λ)] dim

inuisce il fattore di diffrazionenorm

ale perché parte dell’energia viene spesa per faravvenire la transizione- Il term

ine di assorbimento [f”(λ)] subisce una variazione di

fase di π/2 perché l’energia di eccitazione viene riemessa

(diffratta) con un certo ritardo La legge di Friedel viene rotta e i riflessi equivalenti nonsono più uguali ⇒

la differenza tra le coppie di Friedelprende il nom

e di differenza anomala o di B

ijvoet

Diffrazione anom

ala

f’ f”

La legge di Friedel viene rotta perché f” è sempre positivo

e quindi sia le ampiezze che le fasi cam

biano

Diffrazione anom

ala

|Fhkl | ≠ |F

-h-k-l ||F(+)| ≠ |F(-)|

⇓ΔF± = |F

PH (+)| - |F

PH (-)|

La differenza di Bijvoet (ΔF±) viene

usata per localizzare i diffrattorianom

ali e produrre delle mappe iniziali

SIR

AS

- MIR

AS

SIR

AS

: 1 solo derivato +segnale anom

alo dellostesso m

etallo ≡ MIR

⇒ elim

ino l’ambiguità

MIR

AS

: >1 derivato +segnale anom

alo di 1 opiù m

etalli

⇒ m

igliore stima iniziale

della densità elettronica

SA

D

Single wavelength

a nomalous diffraction:

Perfetto isomorfism

oStessa raccolta dati per

nativa e derivatoA

mbiguità

⇓Fasi iniziali e m

appeprelim

inari

MA

DM

ulti-wavelength anom

alous diffraction:1 unico cristallo

3 raccolte datiperfetto isom

orfismo

manca raccolta dati nativa ⇒

una delle λ diventa “nativa”

MA

DC

ome scelgo λ

!per le raccolte dati?

λ1 : m

ax segnale anomalo ≡ picco f” , [Δ(f’-f”)]=m

ax λ

2 : minim

o f’ ≡ flesso f”λ

3 : zona non anomala a ↑E

(cristallo “nativo”)λ

4 : zona non anomala a ↓E

(cristallo “nativo”)

Il cristallo deve resistereinalterato alm

eno a 3raccolte dati com

plete!

Considerazioni pratiche su S

AD

/MA

D

•C

ristallo necessariamente congelato (m

in. danno radiologico)•

Misure estrem

amente accurate:

•Completezza 100%

•Alta Ridondanza

•S

pettro di emissione della proteina prim

a di scegliere λ•

Indispensabile la Radiazione di sincrotrone:

•Raggio brillante•Stabile•M

odulabile•

Rivelatori accurati perché la differenza tra f' e f” è piccola

Statisticam

ente significative

Migliore raccolta dati possibile ⇒

migliori m

appe di densità

Posso calcolare la densità elettronica?

AM

PIE

ZZA dei fattori di struttura (I = |F| 2)

Fase dei fattori distruttura, persa durantel’esperim

ento, ma calcolata

con uno dei vari metodi

SI!SI!

Calcolo le prim

e mappe e inizio a costruire la m

olecola

Refinem

ent: affinamento della struttura

Le mappe di densità eletronica iniziali, ottenute con uno dei

metodi sperim

entali basati sull’interferenza, non sempre

sono ottimali

Com

e posso migliorarle?

Alcuni M

etodi: D

ensity Modification ⇒

elimino totalm

ente il segnale dovuto alsolvente (solo nei casi in cui solvente >50%

) A

rp-wA

rp o Solve/R

esolve o Buccaneer ⇒

Metodi autom

aticidi costruzione S

imm

etria non cristallografica (solo nei casi di oligomeri) ⇒

calcolo la media di tutte le m

olecole uguali

Refinem

ent: miglioram

ento della struttura

Di cosa ho bisogno per m

igliorare le mappe e costruire la

molecola?

Raccolta dati com

pleta del cristallo nativoR

accolta dati completa di tutti i derivati

Program

mi di costruzione della m

olecola (O, C

OO

T, Xfit,

Quanta):

Inseriscono nella densità elementi di struttura secondaria

Inseriscono le catene laterali di aa aromatici o le basi azotate

“Uniscono” i pezzi disgiunti e interpretano la direzione dellapolim

erizzazione della catena (evitando nodi!)

Refinem

ent: miglioram

ento della struttura

Cosa succede alla m

olecola in costruzione?

Cicli di TF inversa e paragone con i dati sperim

entali finché non siarriva a convergenza

Alla fine di ogni ciclo la struttura viene ispezionata e il “puzzle”

completato di volta in volta

Param

etri da controllare:R

: indice di disaccordo cristallografico tra i dati sperimentali e quelli

calcolati a partire dalle zone costruiteR

free : come R

ma solo su un cam

pione casuale di datiFO

M: (F igure of M

erit) completezza totale dei dati (am

piezze + fasi)e accuratezza del m

odello costruitoG

rafico di Ram

achandran: correttezza geometrica delle entità

chimiche inserite nella densità elettronica

Convalida della struttura

+=

Densità iniziale

InterpretazioneS

truttura 3D finale

Struttura 3D

finale

Controllo della validità geom

etrica della struttura (R

amachandran plot):

Lunghezze di legame

Angoli di legam

eP

lanarità e/o ibridazione

… e dopo tutto ciò, inizia il vero lavoro:

Interpretazione della struttura erazionalizzazione dei rapporti

struttura-funzione