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L’ Anemia falciforme

A cura di Dott.ssa Marianna Raimo

Dipartimento di Biochimica e Biofisica “F. Cedrangolo”

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Le varianti mutanti dell’emoglobina

Mutazioni che interessano la superficie della molecola di Hb(es: HbS)

Mutazioni che interessano il sito attivo (es: sostituzione dell’Hys prossimle o distale con una Tyr)

Mutazioni che interessano la struttura terziaria (folding)

Mutazioni che interessano la struttura quaternaria (modificazioni allosteriche)

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Qualche caso in particolare…Hb Hammersmith: (mutazioni puntiformi: UUC in UCC

o UUU in CUU).Sostituzione di una Phe adiacente all’eme con una

Ser.

Destabilizzazione del legame con l’eme e produzione di Hb instabili (Hb Ginevra; Hb Colonia)

Rivelazione: elettroforesi dell’Hb e test di stabilitàall’isopropanoloscaricato da www.sunhope.it

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Sindrome da Hb iperinstabile: stato similtalassemico ereditato come carattere

dominante.

L’Hb instabile danneggia gravemente gli eritrociti in modo da provocare grave

anemia !!

Rivelazione: analisi del DNA !!

Qualche caso in particolare…

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Qualche caso in particolare…

Hb Zurigo ed Hb Yakima: Hb ad alta affinità per l’ossigeno

Massiva liberazione di Epo

Aumentata massa di RBC (policitemia)

Periodici salassi

Hb Kansas: Hb a ridotta affinità per l’ossigeno

Lieve anemia asintomatica

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Anemia Falciforme - Cenni storici:Le popolazioni del Ghana conoscono la malattia da molti secoli e già nel 1600, riferendosi alle crisi dolorose caratteristiche della patologia, le avevano dato nomi

che ne sintetizzano magistralmente le caratteristiche: corpo tormentato, battuto, morsicato.

Ma ovviamente nulla sapevano della falcizzazionedegli eritrociti !!

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Nel 1904 James Herrick esaminò uno studente negro di 20 anni, che presentava debolezza, vertigini, mal di testa, febbre,tosse,palpitazioni e difficoltà respiratorie. Il bianco degli occhi era

giallo, le mucose pallide ed il cuore ingrossato. Era presente una severa anemia.

“ La forma dei globuli rossi era molto irregolare, ma ciò che attirava l’attenzione erano cellule sottili, allungate a forma di

falce o di mezza luna “

( “Peculiari corpuscoli rossi del sangue a forma allungata e di falce in un caso di anemia grave” . James Herrick – 1904)

Anemia Falciforme - Cenni storici:

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La prima osservazione italiana è stata fatta nel 1936 da Maggiore.

Nel 1944 Silvestroni e Bianco descrissero il primo caso al mondo di associazione con la talassemia che chiamarono "microdrepanocitosi" in una ragazza del Lazio, la quale presentava febbre, dolori ed un aumento di volume del fegato e della milza. La diagnosi fu fattacon il semplice test di falcizzazione, poiché in quegli anni non si

conosceva ancora la tecnica elettroforetica.

In questa forma uno dei genitori è portatore sano di talassemia e l'altro di drepanocitosi. Nel figlio le due anomalie si sommano e

danno malattia.

Anemia Falciforme - Cenni storici:

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Negli anni successivi furono definite le basi genetiche dell'anemia drepanocitica: Silvestroni e Gatto in Italia e Neel negli Stati Uniti evidenziarono le modalità di trasmissione ereditaria, dimostrando così che la malattia non è contagiosa, né secondaria a malattie

infettive o a carenze alimentari ma solo ereditaria.

Nel 1949 Pauling dimostrò che l'Hb S sotto l'azione di un campo elettrico (elettroforesi) si sposta più lentamente dell'Hb A, dalla quale quindi si può facilmente distinguere. I soggetti ammalati

hanno quasi esclusivamente Hb S, mentre i loro genitori, chiamati portatori, hanno per metà Hb A e per metà Hb S. Questa

scoperta gli valse il premio Nobel, che fu assegnato anche a VernonIngram dell’Università di Cambridge, che nel 1959 dimostrò che dei 534 amminoacidi che costituiscono l’Hb A uno solo è diverso nelle

catene ß dell’Hb S.

Anemia Falciforme - Cenni storici:

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Anemia Falciforme o Drepanocitosi

- Non è una malattia rara: l’incidenza è molto alta

soprattutto tra i negri dove ècirca 4 per 1000

- Le cellule a forma di falce contengono un’emoglobina anomala,

l’HbS, responsabile della falcizzazione.

- E’ trasmessa geneticamente

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I globuli rossi tendono ad assumere la forma a falce in vitro quando viene ridotta la concentrazione di ossigeno. Quando ciò accade l’HbS è prevalentemente deossigenata, la sua solubilità èenormemente ridotta e viene prodotto un precipitato fibroso che induce la falcizzazione.

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L’HbS è generata da una mutazione puntiforme del gene β globinico in cui una A è sostituita con una T (GTG/GAG) e quindi ècodificata una Val al posto di un Glu, in

posizione 6 della catena globinica.

I legami patologici avvengono tra il residuo di Val anomalo ed una tasca idrofobica tra i

residui di Ala70, Phe85, Leu88 della catena βglobinica adiacente.

Questo accade quando l’Hb è in forma deossigenata.

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I pazienti con anemia falciforme sono omozigoti per la mutazione.La prole che riceve un gene selvatico da un genitore ed il suo allele

mutato dall’altro genitore è un eterozigote che avrà il tratto a cellule falciformi e sarà di norma asintomatico (se non è esposto ad

ipossia di grado elevato non presenta né emolisi né anemia).Solo l’1% degli RBC degli eterozigoti è a forma di falce, mentre

negli omozigoti si hanno valori di circa il 50%scaricato da www.sunhope.it

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Individuo normale

Individuo con “tratto falciforme”

Individuo falciforme

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La formazione di HbS ha 2 principali conseguenze:

1) Anemia emolitica cronica2) Occlusione dei piccoli vasi

che determina un danno tissutale ischemico

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Le fibre che precipitano all’interno dei globuli

rossi prendono il nome di TACTOIDI ed hanno un diametro di 21.5nm.

La sezione trasversale della fibra contiene 14

molecole di HbS

La cinetica della polimerizzazione prevede

una fase lenta e reversibile ed una fase di reazione rapida ed

irreversibile.

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Il ripetersi di episodi di

falcizzazione e di ritorno allo stato normale induce un danno di membrana a livello degli RBC e la lroo falcizzazione irreversibile (CIF), anche se esposti a forti concentrazioni

di ossigeno e nonostante la

depolimerizzazione dell’HbS

Le CIF presentano membrane cellulari molto rigide ed indeformabili e per tanto incontrano difficoltà

nell’attraversamento dei sinusoidi splenici.

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Le CIF sono sequestrate dalla milza, dove vengono eliminate dal sistema fagocitico mononucleato.

Si può anche verificare emolisi intravascolare, dovuta all’aumentata fragilità meccanica delle CIF. La vita media degli RBC è correlata al numero delle CIF in circolo ed è ridotta di

circa 20 giorni rispetto agli RBC normali.scaricato da www.sunhope.it

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Il decorso clinico della patologia ècronico ma intervallato da crisi di

dolore acuto.L’emolisi cronica conduce ad anemie

gravi con Ht=18-30%.Le crisi vaso-occlusive, dette anche

crisi dolorose, rappresentano episodi di danno ipossico ed infarto.

Il dolore è intenso ed interessa l’addome, il torace o le

articolazioni, a seconda del territorio in cui si verifica l’insufficienza vascolare.

Criteri diagnostici: osservazione degli strisci di sangue periferico (comparsa dei corpi di Howell-

Jolly); mescolamento del sangue con reagenti che consumano ossigeno (metabisolfito); elettroforesi

dell’Hb.scaricato da www.sunhope.it

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Alterazioni anatomiche !!Aumentata distruzione degli RBC a falce con sviluppo di anemia:

- pallore della cute- sovraccarico sistemico di ferro- midollo iperplastico per espansione dei normoblasti- all’esame radiologico si osserva la formazione del “cranio a spazzola”- AUTOSPLENECTOMIA

Liberazione di Hb e formazione di bilirubina:

- calcoli biliari di pigmento- marcata iperbilirubinemia, soprattutto durante i periodi di emolisi attiva

Stasi capillare e trombosi:

- infarti secondari all’occlusione vascolare e all’anossia a carico di ossa, encefalo, rene, fegato, retina

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E LA DIAGNOSI PRENATALE???

- Consulenza genetica - Campioni di liquido amniotico.- Prelievi bioptici di villi corionici, dopo circa 8 settimane di gestazione.

Digestione con l’enzima di restrizione MstII che taglia nella palindrome CCTNAGG presente nel gene della β-globina

dell’HbA ma non in quello dell’HbS.scaricato da www.sunhope.it

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Correlazione fra la frequenza di HbS e la presenza di malaria endemica

Polimorfismo bilanciato: un allele altamente deleterio in un omozigote persiste perché lo stato eterozigote è vantaggioso. La malaria, in questo caso, rappresenta un fattore di pressione selettivo positivo.La frequenza del gene per l’HbS è circa dal 40% in alcune parti

dell’Africa !!scaricato da www.sunhope.it

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La condizione di eterozigosi rende i

soggetti infettati dal Plasmodim falciparum meno

sensibili all’azione patogena del parassita

malarico, in quanto gli RBC infetti tendono a

falcizzare maggiormente e questo interferisce

negativamente con il ciclo di replicazione del protozoo. Gli RBC deformati vengono

rapidamente eliminati.

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Tra gli americani di origine africana, circa uno su dieci portatore dell’allele per l’anemia falciforme.

La probabilità di un matrimonio (tra afro-americani) tra due portatori è quindi di 1 su 100

1/10 x 1/10 = 1/100

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Gli individui eterozigoti non mostrano sintomi in condizioni normali. Tuttavia essi possono rivelare la

loro condizione se sottoposti ad una sensibile riduzione nella concentrazione dell’ossigeno (ad

esempio in alta montagna). Questo avviene perchénegli eterozigoti c’è codominanza a livello molecolare.

Se due eterozigoti hanno figli…

Aa x Aa -> ¼ aa ½ Aa ¼ AA

…un quarto dei loro figli sarà affetto !!

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INTERVENTI TERAPEUTICI

Non esistono farmaci antifalcizzanti.Le emotrasfusioni sono utilizzate solo nelle anemie gravi (durante le crisi aplastiche).Il trattamento delle crisi dolorose, che possono durare anche 5 giorni, prevede abbondanti somministrazioni di liquidi e analgesici, compresi i narcotici.

L’obiettivo terapeutico è mantenere il valore di HbA > 50%

CELLULE STAMINALI E TERAPIA GENICA !!!!!!!!!!!!!

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22/03/2005

RIUSCITO IL TRAPIANTO DI STAMINALI PER SCONFIGGERE L'ANEMIA FALCIFORME

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29/04/2005

Trapianto guarisce bimba con anemia falciforme

IL TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI PRELEVATE DAL CORDONE OMBELICALE DELLA

SORELLINA, L'HA GUARITA !!

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Speranze di Guarigione - Terapia Genica dell'Anemia Falciforme

(Aprile 2006)

La collaborazione tra il gruppo di lavoro “Unità di ricerca Piera Cutino” e quello diretto dal Prof. Michel Sadelain del MemorialSloan-Kettering Cancer Center di New York ha prodotto un

risultato importante per la Terapia Genica della anemia falciforme.

I risultati di questo studio sono stati pubblicati a Gennaio dalla prestigiosa rivista internazionale Nature Biotechnology in un

articolo dal titolo “Una strategia genetica per trattare l’anemia falciforme regolando in maniera sinergica l’espressione del

transgene e quella di un RNA interferente.”

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ELETTROFORESI

• L'elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche attraverso una soluzione, sotto l'influenza di un

campo elettrico

L'elettroforesi è un metodo di separazione eccellente per

macromolecole ed in particolare per proteine e frammenti di DNA; per questo è molto

utliizzato in biochimica e in biologia molecolare

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MOBILITÀ ELETTROFORETICA DELLE MACROMOLECOLE

Forza elettrica : Fel = q · E

Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6π r η)

Quando le forze si bilanciano:

q ·E = f ·v v = Eq/f

v = velocità della molecolaE = voltaggio applicatoq = carica netta della molecolaf = coefficente frizionale

v qmobilita’ elettroforetica : µ = — = —

E f

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APPLICAZIONI ANALITICHE

Proteine1. Determinazione del peso molecolare2. Criteri di purezza3. Quantizzazione

Acidi nucleici1. Determinazione del peso molecolare2. Analisi di sequenza3. Quantizzazione

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APPARECCHIATURA PER L'ELETTROFORESI

un alimentatore elettrico in CC

2 elettrodi

2 vaschette contenenti un elettrolita (tampone)

un supporto

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ALIMENTATORE

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CELLA ELETTROFORETICA

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SUPPORTI

Supporti comunemente usati per l'elettroforesi:

Cellulosa (carta)Acetato di cellulosaSilice (gel)Amido (gel)Agarosio (gel) Poliacrilamide (gel)Sephadex (gel)

Le proteine e gli acidi nucleici, vengono separati su supporti di gel di agarosio o poliacrilamide

I gel si preparano subito prima dell'uso partendo da solidi in polvere quali amido, agar, acrilamide

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Elettroforesi su gel di Poliacrilamide

• Utilizzato prevalentemente per la separazione di proteine.

• I gel sono preparati facendo polimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N’metilenbisacrilammide.

• La polimerizzazione inizia con l’aggiunta di ammonio persolfato (APS) e N,N,N’,N’-tetrametiletilenediamine(TEMED).

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ELETTROFORESI SU GEL

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Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione

persolfato:si producono radicali liberi che

attaccano i monomeri diacrilammide e ne avviano la

polimerizzazione.

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Elettroforesi delle proteine in gel di poliacrilammide in SDS (SDS-PAGE)

I gel denaturanti contengono SDS, un detergente anionico che denatura le proteine e determina la

formazione di un peptide lineare con una netta carica negativa

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La velocità di migrazione diminuisceall’aumentare della massa

v = Eq/f

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Rilevamento delle Proteine dopo Elettroforesi

Coomassie blue stain

Coomassie brilliant blue R-250: metanolo: acqua

Rivela 0,1 mg di proteina

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Rilevamento delle Proteine dopo Elettroforesi

Silver stain:

Riduzione sulla proteina degli ioni Ag+ ad argento metallico.

Colorazione più sensibile del CB , rivela ≥ 0.3 ng di proteina.

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Vantaggi dei gel di poliacrilamide

• Buona risoluzione di proteine di piccola e media grandezza (30,000 a 300,000 Da)

• Scarsa interazione delle proteine con la matrice• Buona stabiltà della matrice

• La dimensione dei pori dipende dalla percentualedi bis crilamide presente

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PROSSIMA LEZIONE…… ???scaricato da www.sunhope.it