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L’ Anemia falciforme
A cura di Dott.ssa Marianna Raimo
Dipartimento di Biochimica e Biofisica “F. Cedrangolo”
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Le varianti mutanti dell’emoglobina
Mutazioni che interessano la superficie della molecola di Hb(es: HbS)
Mutazioni che interessano il sito attivo (es: sostituzione dell’Hys prossimle o distale con una Tyr)
Mutazioni che interessano la struttura terziaria (folding)
Mutazioni che interessano la struttura quaternaria (modificazioni allosteriche)
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Qualche caso in particolare…Hb Hammersmith: (mutazioni puntiformi: UUC in UCC
o UUU in CUU).Sostituzione di una Phe adiacente all’eme con una
Ser.
Destabilizzazione del legame con l’eme e produzione di Hb instabili (Hb Ginevra; Hb Colonia)
Rivelazione: elettroforesi dell’Hb e test di stabilitàall’isopropanoloscaricato da www.sunhope.it
Sindrome da Hb iperinstabile: stato similtalassemico ereditato come carattere
dominante.
L’Hb instabile danneggia gravemente gli eritrociti in modo da provocare grave
anemia !!
Rivelazione: analisi del DNA !!
Qualche caso in particolare…
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Qualche caso in particolare…
Hb Zurigo ed Hb Yakima: Hb ad alta affinità per l’ossigeno
Massiva liberazione di Epo
Aumentata massa di RBC (policitemia)
Periodici salassi
Hb Kansas: Hb a ridotta affinità per l’ossigeno
Lieve anemia asintomatica
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Anemia Falciforme - Cenni storici:Le popolazioni del Ghana conoscono la malattia da molti secoli e già nel 1600, riferendosi alle crisi dolorose caratteristiche della patologia, le avevano dato nomi
che ne sintetizzano magistralmente le caratteristiche: corpo tormentato, battuto, morsicato.
Ma ovviamente nulla sapevano della falcizzazionedegli eritrociti !!
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Nel 1904 James Herrick esaminò uno studente negro di 20 anni, che presentava debolezza, vertigini, mal di testa, febbre,tosse,palpitazioni e difficoltà respiratorie. Il bianco degli occhi era
giallo, le mucose pallide ed il cuore ingrossato. Era presente una severa anemia.
“ La forma dei globuli rossi era molto irregolare, ma ciò che attirava l’attenzione erano cellule sottili, allungate a forma di
falce o di mezza luna “
( “Peculiari corpuscoli rossi del sangue a forma allungata e di falce in un caso di anemia grave” . James Herrick – 1904)
Anemia Falciforme - Cenni storici:
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La prima osservazione italiana è stata fatta nel 1936 da Maggiore.
Nel 1944 Silvestroni e Bianco descrissero il primo caso al mondo di associazione con la talassemia che chiamarono "microdrepanocitosi" in una ragazza del Lazio, la quale presentava febbre, dolori ed un aumento di volume del fegato e della milza. La diagnosi fu fattacon il semplice test di falcizzazione, poiché in quegli anni non si
conosceva ancora la tecnica elettroforetica.
In questa forma uno dei genitori è portatore sano di talassemia e l'altro di drepanocitosi. Nel figlio le due anomalie si sommano e
danno malattia.
Anemia Falciforme - Cenni storici:
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Negli anni successivi furono definite le basi genetiche dell'anemia drepanocitica: Silvestroni e Gatto in Italia e Neel negli Stati Uniti evidenziarono le modalità di trasmissione ereditaria, dimostrando così che la malattia non è contagiosa, né secondaria a malattie
infettive o a carenze alimentari ma solo ereditaria.
Nel 1949 Pauling dimostrò che l'Hb S sotto l'azione di un campo elettrico (elettroforesi) si sposta più lentamente dell'Hb A, dalla quale quindi si può facilmente distinguere. I soggetti ammalati
hanno quasi esclusivamente Hb S, mentre i loro genitori, chiamati portatori, hanno per metà Hb A e per metà Hb S. Questa
scoperta gli valse il premio Nobel, che fu assegnato anche a VernonIngram dell’Università di Cambridge, che nel 1959 dimostrò che dei 534 amminoacidi che costituiscono l’Hb A uno solo è diverso nelle
catene ß dell’Hb S.
Anemia Falciforme - Cenni storici:
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Anemia Falciforme o Drepanocitosi
- Non è una malattia rara: l’incidenza è molto alta
soprattutto tra i negri dove ècirca 4 per 1000
- Le cellule a forma di falce contengono un’emoglobina anomala,
l’HbS, responsabile della falcizzazione.
- E’ trasmessa geneticamente
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I globuli rossi tendono ad assumere la forma a falce in vitro quando viene ridotta la concentrazione di ossigeno. Quando ciò accade l’HbS è prevalentemente deossigenata, la sua solubilità èenormemente ridotta e viene prodotto un precipitato fibroso che induce la falcizzazione.
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L’HbS è generata da una mutazione puntiforme del gene β globinico in cui una A è sostituita con una T (GTG/GAG) e quindi ècodificata una Val al posto di un Glu, in
posizione 6 della catena globinica.
I legami patologici avvengono tra il residuo di Val anomalo ed una tasca idrofobica tra i
residui di Ala70, Phe85, Leu88 della catena βglobinica adiacente.
Questo accade quando l’Hb è in forma deossigenata.
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I pazienti con anemia falciforme sono omozigoti per la mutazione.La prole che riceve un gene selvatico da un genitore ed il suo allele
mutato dall’altro genitore è un eterozigote che avrà il tratto a cellule falciformi e sarà di norma asintomatico (se non è esposto ad
ipossia di grado elevato non presenta né emolisi né anemia).Solo l’1% degli RBC degli eterozigoti è a forma di falce, mentre
negli omozigoti si hanno valori di circa il 50%scaricato da www.sunhope.it
Individuo normale
Individuo con “tratto falciforme”
Individuo falciforme
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La formazione di HbS ha 2 principali conseguenze:
1) Anemia emolitica cronica2) Occlusione dei piccoli vasi
che determina un danno tissutale ischemico
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Le fibre che precipitano all’interno dei globuli
rossi prendono il nome di TACTOIDI ed hanno un diametro di 21.5nm.
La sezione trasversale della fibra contiene 14
molecole di HbS
La cinetica della polimerizzazione prevede
una fase lenta e reversibile ed una fase di reazione rapida ed
irreversibile.
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Il ripetersi di episodi di
falcizzazione e di ritorno allo stato normale induce un danno di membrana a livello degli RBC e la lroo falcizzazione irreversibile (CIF), anche se esposti a forti concentrazioni
di ossigeno e nonostante la
depolimerizzazione dell’HbS
Le CIF presentano membrane cellulari molto rigide ed indeformabili e per tanto incontrano difficoltà
nell’attraversamento dei sinusoidi splenici.
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Le CIF sono sequestrate dalla milza, dove vengono eliminate dal sistema fagocitico mononucleato.
Si può anche verificare emolisi intravascolare, dovuta all’aumentata fragilità meccanica delle CIF. La vita media degli RBC è correlata al numero delle CIF in circolo ed è ridotta di
circa 20 giorni rispetto agli RBC normali.scaricato da www.sunhope.it
Il decorso clinico della patologia ècronico ma intervallato da crisi di
dolore acuto.L’emolisi cronica conduce ad anemie
gravi con Ht=18-30%.Le crisi vaso-occlusive, dette anche
crisi dolorose, rappresentano episodi di danno ipossico ed infarto.
Il dolore è intenso ed interessa l’addome, il torace o le
articolazioni, a seconda del territorio in cui si verifica l’insufficienza vascolare.
Criteri diagnostici: osservazione degli strisci di sangue periferico (comparsa dei corpi di Howell-
Jolly); mescolamento del sangue con reagenti che consumano ossigeno (metabisolfito); elettroforesi
dell’Hb.scaricato da www.sunhope.it
Alterazioni anatomiche !!Aumentata distruzione degli RBC a falce con sviluppo di anemia:
- pallore della cute- sovraccarico sistemico di ferro- midollo iperplastico per espansione dei normoblasti- all’esame radiologico si osserva la formazione del “cranio a spazzola”- AUTOSPLENECTOMIA
Liberazione di Hb e formazione di bilirubina:
- calcoli biliari di pigmento- marcata iperbilirubinemia, soprattutto durante i periodi di emolisi attiva
Stasi capillare e trombosi:
- infarti secondari all’occlusione vascolare e all’anossia a carico di ossa, encefalo, rene, fegato, retina
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E LA DIAGNOSI PRENATALE???
- Consulenza genetica - Campioni di liquido amniotico.- Prelievi bioptici di villi corionici, dopo circa 8 settimane di gestazione.
Digestione con l’enzima di restrizione MstII che taglia nella palindrome CCTNAGG presente nel gene della β-globina
dell’HbA ma non in quello dell’HbS.scaricato da www.sunhope.it
Correlazione fra la frequenza di HbS e la presenza di malaria endemica
Polimorfismo bilanciato: un allele altamente deleterio in un omozigote persiste perché lo stato eterozigote è vantaggioso. La malaria, in questo caso, rappresenta un fattore di pressione selettivo positivo.La frequenza del gene per l’HbS è circa dal 40% in alcune parti
dell’Africa !!scaricato da www.sunhope.it
La condizione di eterozigosi rende i
soggetti infettati dal Plasmodim falciparum meno
sensibili all’azione patogena del parassita
malarico, in quanto gli RBC infetti tendono a
falcizzare maggiormente e questo interferisce
negativamente con il ciclo di replicazione del protozoo. Gli RBC deformati vengono
rapidamente eliminati.
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Tra gli americani di origine africana, circa uno su dieci portatore dell’allele per l’anemia falciforme.
La probabilità di un matrimonio (tra afro-americani) tra due portatori è quindi di 1 su 100
1/10 x 1/10 = 1/100
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Gli individui eterozigoti non mostrano sintomi in condizioni normali. Tuttavia essi possono rivelare la
loro condizione se sottoposti ad una sensibile riduzione nella concentrazione dell’ossigeno (ad
esempio in alta montagna). Questo avviene perchénegli eterozigoti c’è codominanza a livello molecolare.
Se due eterozigoti hanno figli…
Aa x Aa -> ¼ aa ½ Aa ¼ AA
…un quarto dei loro figli sarà affetto !!
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INTERVENTI TERAPEUTICI
Non esistono farmaci antifalcizzanti.Le emotrasfusioni sono utilizzate solo nelle anemie gravi (durante le crisi aplastiche).Il trattamento delle crisi dolorose, che possono durare anche 5 giorni, prevede abbondanti somministrazioni di liquidi e analgesici, compresi i narcotici.
L’obiettivo terapeutico è mantenere il valore di HbA > 50%
CELLULE STAMINALI E TERAPIA GENICA !!!!!!!!!!!!!
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22/03/2005
RIUSCITO IL TRAPIANTO DI STAMINALI PER SCONFIGGERE L'ANEMIA FALCIFORME
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29/04/2005
Trapianto guarisce bimba con anemia falciforme
IL TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI PRELEVATE DAL CORDONE OMBELICALE DELLA
SORELLINA, L'HA GUARITA !!
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Speranze di Guarigione - Terapia Genica dell'Anemia Falciforme
(Aprile 2006)
La collaborazione tra il gruppo di lavoro “Unità di ricerca Piera Cutino” e quello diretto dal Prof. Michel Sadelain del MemorialSloan-Kettering Cancer Center di New York ha prodotto un
risultato importante per la Terapia Genica della anemia falciforme.
I risultati di questo studio sono stati pubblicati a Gennaio dalla prestigiosa rivista internazionale Nature Biotechnology in un
articolo dal titolo “Una strategia genetica per trattare l’anemia falciforme regolando in maniera sinergica l’espressione del
transgene e quella di un RNA interferente.”
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ELETTROFORESI
• L'elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche attraverso una soluzione, sotto l'influenza di un
campo elettrico
L'elettroforesi è un metodo di separazione eccellente per
macromolecole ed in particolare per proteine e frammenti di DNA; per questo è molto
utliizzato in biochimica e in biologia molecolare
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MOBILITÀ ELETTROFORETICA DELLE MACROMOLECOLE
Forza elettrica : Fel = q · E
Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6π r η)
Quando le forze si bilanciano:
q ·E = f ·v v = Eq/f
v = velocità della molecolaE = voltaggio applicatoq = carica netta della molecolaf = coefficente frizionale
v qmobilita’ elettroforetica : µ = — = —
E f
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APPLICAZIONI ANALITICHE
Proteine1. Determinazione del peso molecolare2. Criteri di purezza3. Quantizzazione
Acidi nucleici1. Determinazione del peso molecolare2. Analisi di sequenza3. Quantizzazione
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APPARECCHIATURA PER L'ELETTROFORESI
un alimentatore elettrico in CC
2 elettrodi
2 vaschette contenenti un elettrolita (tampone)
un supporto
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ALIMENTATORE
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CELLA ELETTROFORETICA
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SUPPORTI
Supporti comunemente usati per l'elettroforesi:
Cellulosa (carta)Acetato di cellulosaSilice (gel)Amido (gel)Agarosio (gel) Poliacrilamide (gel)Sephadex (gel)
Le proteine e gli acidi nucleici, vengono separati su supporti di gel di agarosio o poliacrilamide
I gel si preparano subito prima dell'uso partendo da solidi in polvere quali amido, agar, acrilamide
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Elettroforesi su gel di Poliacrilamide
• Utilizzato prevalentemente per la separazione di proteine.
• I gel sono preparati facendo polimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N’metilenbisacrilammide.
• La polimerizzazione inizia con l’aggiunta di ammonio persolfato (APS) e N,N,N’,N’-tetrametiletilenediamine(TEMED).
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ELETTROFORESI SU GEL
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Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione
persolfato:si producono radicali liberi che
attaccano i monomeri diacrilammide e ne avviano la
polimerizzazione.
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Elettroforesi delle proteine in gel di poliacrilammide in SDS (SDS-PAGE)
I gel denaturanti contengono SDS, un detergente anionico che denatura le proteine e determina la
formazione di un peptide lineare con una netta carica negativa
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La velocità di migrazione diminuisceall’aumentare della massa
v = Eq/f
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Rilevamento delle Proteine dopo Elettroforesi
Coomassie blue stain
Coomassie brilliant blue R-250: metanolo: acqua
Rivela 0,1 mg di proteina
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Rilevamento delle Proteine dopo Elettroforesi
Silver stain:
Riduzione sulla proteina degli ioni Ag+ ad argento metallico.
Colorazione più sensibile del CB , rivela ≥ 0.3 ng di proteina.
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Vantaggi dei gel di poliacrilamide
• Buona risoluzione di proteine di piccola e media grandezza (30,000 a 300,000 Da)
• Scarsa interazione delle proteine con la matrice• Buona stabiltà della matrice
• La dimensione dei pori dipende dalla percentualedi bis crilamide presente
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PROSSIMA LEZIONE…… ???scaricato da www.sunhope.it