KIT$ Le$forme$invisibili$...
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KIT$Le$forme$invisibili$
La$cristallizzazione$del$lisozima
!"3"provette"da"1,5"ml"contenenti"la"proteina"del"lisozima"purificata"(da"conservare"in"freezer)"!"6"piastre"multiwell"!una"scatola"contenente"vetrini"copri"oggetti"!una"scatola"contenente"vetrini"porta"oggetti"!"soluzioni"per"ottenere"il"cristallo"(acqua"distillata,"NaCl"20%,"tampone"sodio"acetato"1M"pH4.6)"!3"micropipette"da"20"microlitri"!3"micropipette"da"200"microlitri"!3"micropipette"da"1000"microlitri"!3"scatole"di"puntali"per"micropipette"(per"micropipette"da"20!200"microlitri)"!3"scatole"di"puntali"per"micropipette"da"20"microlitri"e""per"micropipette"da"1000"microlitri"
MATERIALE$NEL$KIT
! laboratorio"o"aula"con"tavoli/banconi"""! aula"informatica"! microscopi"ottici"con"obiettivi"4x"e10x""!""""videoproiettore"! contenitori"per"rifiuti""! pennarelli
MATERIALE$NECESSARIO$A$SCUOLA
TEMPO$RICHIESTO$
circa"1,5!2"ore
Allestimento$del$materialeDisporre"sul"banco"da"lavoro"il"materiale"in"modo"che"gli"studenti"lavorino"in"tre"gruppi."Ogni"postazione"deve"essere"così"costituita:"
•"2"piaster"multiwell"
•"1"vetrino"coprioggetti"per"studente"
•"1"micropipetta"da"20"microlitri"
•"1"micropipetta"da"200"microlitri"
•"1"micropipetta"da"1000"microlitri"
•"1"provette"contenente"il"lisozima"
•"1"falcon"per"ogni"soluzione"
•"microscopi"ottici"o"stereomicroscopi"
•"inoltre"sul"banco"di"lavoro"dovranno"essere"presenti"un"contenitore"dei"rifiuti,"una"scatola"di"puntali"per"tipo"e"pennarelli
Procedimento$$Uso$micropipetta
• Illustrare"la"portata"massima"di"e"minima"delle"micropipetta;"oltre"questi"valori"la"micropipetta"si"rompe"
• Mostrare"ai"ragazzi"come"si"imposta"il"volume"girando"la"rotella"in"alto,"se"si"ruota"verso"sinistra"il"volume"aumenta,"al"contrario"se"si"ruota"a"destra"il"volume"diminuisce."
• Impostare"lo"strumento"su"i"microlitri"necessari,"stando"molto"attenti"al"decimale"dopo"la"virgola"
• Mostrare"ai"ragazzi"come"si"inserisce"il"puntale"sulla"punta"della"micropipetta""semplicemente"appoggiando"lo"strumento"sul"puntale"e"facendo"una"leggera"pressione"
• Spiegare"come"si"preleva"un"volume."Fare"una"leggera"pressione"sulla"rotella"usata"per"l’impostazione"del"volume"fino"a"quando"non"si"percepisce"una"resistenza,"mantenendo"abbassata"la"rotella"inserire"la"punta"del"puntale"dentro"il"volume"da"prelevare"("per"esempio"si"può"usare"la"provetta"contenente"acqua)"e"a"questo"punto"lasciare"andare"il"dito"accompagnando"la"rotella"verso"l’alto.""
• Espellere"il"puntale"nel"contenitore"dei"rifiuti"usando"l’apposito"pulsante"""""""""""""""situato"in"alto"sullo"strumento
LE$FASI$DELLA$ATTIVITA’• Ogni"studente"pipetterà"all’interno"del"singolo"pozzetto"una"soluzione"di"
cristallizzazione"così"composta:"250"microlitri"di"acqua;"225"microlitri"di"NaCl"20%;"25"microlitri"di"tampone"sodio"acetato"1M"pH4.6"
• Risospendere"la"soluzione"con"il"puntale"• Prendere"un"vetrino"coprioggetti"e"disegnare"un"cerchio"al"centro"con"il"pennarello"• Prelevare"2"microlitri"di"soluzione"di"cristallizzazione"dal"pozzetto"e"metterli"al"centro"
del"cerchio"colorato"• Prelevare"2"microlitri"di"lisozima"(precedentemente"estratto"dal"freezer"e"risospeso"
accuratamente"picchiettando"sul"fondo"della"provetta)"e"metterlo"al"centro"del"vetrino"coprioggetto"all’interno"della"goccia"appena"depositata"
• Capovolgere"il"vetrino"mantenendo"la"goccia"pendente"al"centro"• Coprire"la"piastra"di"cristallizzazione"con"il"coperchio"trasparente"per"prevenire"
l’evaporazione"della"goccia"e"per"garantire"il"corretto"raggiungimento"dell’equilibrio"di"vapore"necessario"per"la"cristallizzazione"della"proteina"
• Attendere"circa"30"minuti;"aprire"la"piastra"e"prelevare"il"coprioggetti"girandolo;"posizionare"il"coprioggetti"sul"portaoggetti"mantenendo"la"goccia"rivolta"verso"l’alto"senza"schiacciarla"tra"i"due"vetrini"
• Osservare"al"microscopio"al"4x"e"10x"
""
Ingrandimento"10x
Biocristallografia$
La"cristallografia"a"raggi"X"è"una"tecnica"che"consente"di"determinare" la"posizione"degli"atomi"delle"molecole"che"compongono"un"cristallo"sulla"base"del"modo"con"cui"i"raggi"X"vengono"diffratti"dal"cristallo"stesso."
In"particolare," la"cristallografia"a" raggi"X"misura" la"“densità$elettronica”"cioè"come"gli"elettroni"(e,"conseguentemente,"gli"atomi)"sono"distribuiti"nello"spazio"del"cristallo
Scopo:$determinazione"della"struttura"3D"di"macromolecole"biologiche"a"risoluzione$atomica$
Oggetto:$sistema$reale$DNA,$RNA,$proteine,$e$loro$complessi$(virus,$ribosoma,$…)$
Le"proteine"più"piccole"hanno"anche""più$di$1000$atomi"mentre"le"più"grandi"possono"avere"fra$10000$e$100000$atomi
Applicazioni$della$Biocristallografia$
le" strutture" 3D" delle" macromolecole" biologiche" permettono" di"capire"come"avvengono"i"processi$biologici"e"le"interazioni$a$livello$atomico" (cioè" come" una" particolare"macromolecola" esegue" la" sua"funzione)"
➢"interazioni"macromolecola!macromolecola"
➢"interazioni"macromolecola"!"piccola"molecola""""""(substrato,"cofattore,"inibitore,"ione"…)"➢"progettazione"razionale"di"farmaci"
➢"relazione"struttura!funzione"negli"enzimi"
➢"applicazioni"biotecnologiche
molecolaunità$di$cella
cristallounità$asimmetrica$
simmetria$cristallografica
Perché$i$cristalli?
Perché$i$raggi$X$?$
la" lunghezza" d’onda"dei" raggi" X" è" di" circa" 1"Å," che" è"dell’ordine$di$grandezza$delle$distanze$interatomiche"e" permette" quindi" di" identificare" la" posizione" dei"singoli"atomi.
La" cristallografia" a" raggi" X" richiede" un" cristallo" per"amplificare$ il$segnale"di"diffrazione"(1015!1016"molecole"identiche)
Costruzione$del$modello$molecolare