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IV RELAZIONE ULTIMI 15 MESI DI PROROGA FIRB RBPR05JH2P ITALNANONET Unità di Claudio Nicolini UniGe

10/09/2012 - 16/12/2013

1. Sintesi delle attività scientifiche e risultati raggiunti per le varie tematiche

oggetto dell’unità UdR Genova – Prof. C. Nicolini Numerose attività sono state condotte a vasto raggio dall’Unità con significativi e sinergici pertinenti risultati in varie tematiche:

Lb Nanotemplate-Induced Crystallization Combined To Laser-Induced Microfragmentation Emerge As Unique Technique To Characterize Single Domains Of Proteins Crystals La microframmentazione indotta da laser, su cristalli di proteine indotti da nano stampi LB, si traduce in distinti domini coerenti di diffrazione . Solo i cristalli prodotti secondo il Langmuir - Blodgett ( LB ) rivelano, in tutte e quattro le proteine ( lisozima , insulina , taumatina e ribonucleasi ), domini di grande resistenza alle radiazioni, cosa che non è possibile per i cristalli prodotti dal metodo di cristallizzazione classico. In realtà, la stessa esposizione del laser provoca la scomparsa di questi cristalli "classici" di proteine, sotto le stesse condizioni temporali di esposizione di 40 minuti per il taglio laser in tutte e quattro le proteine. Il metodo LB combinato a tecnologie laser è in grado di emergere, dato che non solo il lisozima, proteina particolarmente robusta, sopravvive al processo , ma anche le altre tre proteine modello, come finora testato, le proteine testate sono l'insulina , la taumatina e ribonucleasi . La struttura dei due domini tipici basati su LB è stata determinata con risoluzione atomica usando radiazione di sincrotrone e nanocrystallografia, le mappe di densità elettronica ben definite non mostrano alcuna evidenza di danni da radiazioni dei gruppi sensibili. I risultati forniscono una nuova finestra per la caratterizzazione fino alla scala submicron dei domini di cristalli proteici della loro organizzazione , indicando una nuova tecnica biofisica emergente. In Situ Monitoring By Raman Spectroscopy of Lysozyme Conformation for Nanotemplate Induced Crystallization Utilizzando la spettroscopia Raman e il lisozima come sistema modello, indaghiamo la differenze di conformazione proteica prima e dopo la nucleazione indotta, tramite nano templato LB, e crescita del relativo cristallo. Si è constatato che la differenza principale è nella conformazione del lisozima associata alla maggiore quantità di legami SS nei cristalli LB, probabilmente nel C terminale delle proteine, con conseguente maggiore rigidezza delle molecole di lisozima e del cristallo LB associato. La crescita in termini di dimensioni del cristallo LB nel tempo è anche accompagnata dalla formazione di legami SS. La struttura atomica determinata, dalla diffrazione a raggi X correlata a quanto sopra, indica che la principale differenza tra cristalli LB e classici, in termini di molecole di acqua, è associata alla maggiore stabilità da radiazione dei cristalli LB. SNAP Nanoarrays for Structural and Functional Nanoproteomics. Negli ultimi anni, lo studio delle interazioni proteina-proteina e dei network proteici si è notevolmente accelerato, facendo giganteschi passi in avanti, grazie anche agli avanzamenti e ultimi sviluppi nel campo della proteomica funzionale. Le interazioni proteiche possono venir indagate mediante array NAPPA (Nucleic Acid Programmable Protein Array) e a sua volta la tecnologia NAPPA può venir accoppiata ad altri approcci label-free. Le tecnologie label-free NAPPA e SNAP, in combinazione con la nanobiocristallografia di proteine e sviluppi futuri e successivi utilizzando

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Alluminio Poroso Anodizzato (APA), assieme a sistemi di espressione cell-free, appaiono convergenti verso un singolo approccio unitario capace di rispondere in modo efficace ai numerosi problemi ancora aperti nel campo della diagnosi e terapia medica. I futuri microarray basati su APA faranno uso del sistema di espressione cell-free PURExpress, per la nanobiocristallografia basata su nanobiotemplato Langmuir-Blodgett (LB), dove i pozzetti APA possono essere usati per la nanocristalizzazione di proteine e soluzioni precipitate, laddove tutto il sistema è immerso nella soluzione precipitante. Questo rappresenta lo sviluppo promettente dell'APA nell'area della nanobiocristallografia di proteine facendo uso dell'APA come di un sistema a pozzetti per l'espressione cell-free e nell'area della proteomica funzionale usando l'APA come nanoarray per indagare le interazioni proteina-proteina in condizioni di flusso, così come utile piattaforma per lo screening e il test di immunogenicità di diversi antigeni, nel contesto del disegno e sviluppo di nuovi preparati antigenici.

Add sample proteins

Avidin

Target DNA

Capture antibodyTarget protein

Add cell-free expression system Add sample proteins

Avidin

Target DNA

Capture antibodyTarget protein

Add cell-free expression system Figura_ Tecnologia NAPPA NAPPA technology for vaccine design. Nelle ultime decadi, la vaccinologia è emersa come scienza complessa e interdisciplinare, specialmente a causa dei contributi delle nuove discipline omiche, come la bioinformatica applicata alla vaccinologia (in particolare la reverse vaccinology di Rino Rappuoli), l'immunogenomica (di cui Gregory Poland rappresenta il pioniere), e la vaccinomica (un nuovo approccio integrato elaborato da Özdemir). Lo studio delle interazioni proteina-proteina e dei network proteici ha subito avanzamenti e accelerazioni grazie agli ultimi sviluppi nel campo della proteomica funzionale. L'immunoproteomica infatti rappresenta una disciplina cruciale per la scoperta e il disegno di nuovi vaccini e preparati antigenici. Le interazioni proteina-proteina possono venir ora indagate mediante la tecnologia Nucleic Acid Programmable Protein Array (NAPPA), e questa può a sua volta venir accoppiata ad altri approcci e tecnologie label-free nel contesto della scoperta e disegno di vaccini personalizzati. Nanogenomics and nanoproteomics enabling personalized, predictive and preventive nanomedicine. Negli ultimi anni, la tecnologia Nucleic Acid Programmable Protein Arrays (NAPPA) è emersa come strumento promettente in quanto facente uso di un complesso sistema di espressione cell-free di provenienza eucariotica (IVTT), in modo da produrre proteine direttamente in situ, in questo modo superando le difficoltà di spottare, purificare e conservare le proteine investigate. Diversamente dai tradizionali approcci basati sul labeling e sulla fluorescenza, questo nuovo metodo label-free, emergente dalla utilizzazione combinata di tre approcci nanobiotecnologici indipendenti ma combinati, appare capace di analizzare le funzioni di proteine e interazioni proteina-proteina in studi promettenti per realizzare una medicina personalizzata, predittiva e preventiva. La nanogravimetria a cristalli di quarzo (QCM), basata sul monitoraggio della frequenza (QCM-F) e del fattore D di dissipazione (QCM-D), la spettrometria di massa (MS) e l'alluminio poroso anodizzato (APA) permettono infatti di superare i limiti di una detezione basata sulla fluorescenza, dove il problema del background permane e persiste anche dopo estensivi lavaggi. Questo potrebbe venir ulteriormente ottimizzato mediante l'uso di un sistema di espressione cell-free ben omogeneo, definito e di origine batterica (chiamato SNAP e sviluppato dal New England Biolabs), capace di realizzare l'obiettivo ambizioso di quantificare i network regolatori proteici nell'uomo. Vengono discusse le implicazioni e le applicazioni per una medicina personalizzata dei

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sopramenzionati array proteici label-free, usando differenti geni e proteine test, dalla diagnosi e trattamento del rigetto del trapianto di rene, alle patologie orali di interesse odontoiatrico e al cancro. Conductometric Monitoring Of Protein-Protein Interactions. Abbiamo dimostrato la fattibilità del monitoraggio conduttimetrico di interazioni proteina-proteina e proteina-steroli accoppiando la Nanogravimetria a Cristalli di Quarzo con monitoraggio del fattore di Dissipazione (QCM_D) e gli array di proteine NAPPA (Nucleic Acid Programmable Protein Array). L’analisi delle curve di conduttanza misurate per microarray NAPPA stampati sulla superficie del quarzo hanno permesso l'individuazione di eventi di legame tra le proteine immobilizzate e quelle del campione. La tecnologia NAPPA permette l'immobilizzazione sulla superficie del quarzo di una vasta gamma di proteine e può essere facilmente adattata per realizzare innumerevoli tipi di biosensori. Infatti sono state sperimentate piu’ proteine immobilizzate sullo stesso cristallo di quarzo dimostrando la possibilità di analizzare lo stesso array per diverse interazioni distinte. Nel presente articolo sono riportati due esempi di applicazioni conduttimetriche di rilevanza clinica, basate sulla tecnologia NAPPA, l'interazione tra fattori di trascrizione Jun e ATF2 e l'interazione tra Citocromo P540scc e colesterolo.

Figure_Jun&CDK2&p53 QC curve di condttanza. Correlation Of Changes Of Cho–K1 Cells Metabolism To Changes In Protein Expression In Camp Differentiation. E’ stata eseguita un’indagine correlata, tramite risonanza magnetica nucleare (1H-NMR), spettrometria di massa (MS) e saggi biochimici, del metabolismo cellulare e dell'espressione proteica in cellule ovariche di criceto cinese (CHO-K1) in diverse condizioni di crescita. I fibroblasti CHO hanno prodotto diversi prodotti metabolici se coltivate in diversi mezzi di coltura e quando la differenziazione è stimolato da adenosina 3 ', 5' monofosfato ciclico (cAMP). In particolare, mentre l'aggiunta di Fetal Calf Serum provoca un aumento del metabolismo del glucosio correlato ai cambiamenti nella composizione lipidica della membrana, osservata mediante 1H-NMR, il differenziamento indotto da cAMP provoca differenze biochimiche nel metabolismo glucidico e lipidico correlati univocamente sia ai cambiamenti specifici nella composizione di proteine nucleari, rivelati mediante spettrometria di massa, che differenze nel metabolismo, determinata via NMR. Genes Expression On Anodic Porous Alumina Microarray.

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Questo lavoro analizza l'applicazione dell’Allumina Porosa Anodica (APA) come innovazione di chip di laboratorio per l’espressione genica. La superficie è stata preparata mediante un processo elettrolitico idoneo ad ottenere una distribuzione di profondità regolare dei fori micrometrici ed e’ stata stampata mediante puntali robotizzati in condizioni standard. L'espressione genica dei Nucleic Acid Programmable Protein Array (NAPPA) è stata realizzata in un ambiente confinato di 16 spots, contenenti plasmidi circolari di DNA, mediante l’aggiunta di lisato di reticolociti di coniglio. Gli autori hanno dimostrato l'utilità dell’APA nel trattenere l’espressione proteica rilevando con un microscopio CCD il segnale fotoluminescenza emesso dal complesso dell’anticorpo secondario ancorato al Cy3 e confinato nei pori. Esperimenti di attrito hanno dimostrato la resistenza meccanica sotto sollecitazioni esterne da parte delle punte robotizzate. Finora non sono stati effettuati tentativi di confrontare direttamente l’APA con qualsiasi altra superficie / substrato; il potenziale rivestimento della superficie con l’APA fornisce vantaggi rispetto alla semplice funzionalizzazione di un vetrino, superando le preoccupazioni legate alla stampa e alla sua capacità di generare matrici vitali.

Mass Spectrometry And Florescence Analysis Of Snap Arrays Presentiamo l'analisi di un innovativo microarray di proteine auto-assemblante, il " Nucleic Acid Programmable Array Protein " (NAPPA), espresso con una coda SNAP in un sistema espressione cell-free da E.coli. L'obiettivo è quello di sviluppare una procedura standardizzata per analizzare le interazioni proteina-proteina che si verificano su array NAPPA combinando l’analisi labell-free di spettrometria di massa (MS) e quella in fluorescenza per microarray di proteine. Ci avvaliamo nel processo di sintesi delle proteine ricombinanti del sistema PURE. Per la prima volta questa versione migliorata del NAPPA, che permette la sintesi in situ di proteine funzionali - con un tag SNAP - direttamente da cDNA stampati al momento del test , è stata espressa in un sistema di trascrizione / traduzione cell-free ricostituito dai componenti purificati da Escherichia coli necessari per la traduzione - il sistema PURE - e analizzati in maniera label-free attraverso tre diversi spettrometri di massa , vale a dire due spettrometri Matrix Assisted laser Desoprtion Ionization Time-of - Flight

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(MALDI – TOF), come mostrato nella figura sottostante per una proteina immobilizzata su NAPPA micorarrai noti (sopra) o meno (sotto) a priori ,

un Voyager e un Bruker Ultraflex, e uno spettrometro Liquid Chromatography-Electrospray Ionization ( LC-ESI-MS/MS ). A causa della elevata complessità del sistema, i risultati ottenuti sono molto complessi ed è stato necessario sviluppare uno strumento bioinformatico ad hoc per la loro analisi. E’ stata contemporaneamente eseguita un'analisi in fluorescenza dei NAPPA espressi mediante il sistema PURE, al fine di caratterizzare pienamente questo nuovo sistema NAPPA e correlarlo ai risultati di spettrometria di massa. Synchrotron Diffraction of Multilayered LS PGA Films After Heating And Cooling” Il drammatico aumento dell’ordine a lungo raggio nei film multistrato LB di enzimi dopo il riscaldamento e il raffreddamento, evidenziato in precedenza tramite dispersione di raggi X grazing incidence small angle con il microfascio dell’ID13 [1], viene qui confermato dai presenti studi di diffrazione di luce di sincrotrone presso la beamline ID11, aprendo la strada alla tecnologia LB come mezzo per per bypassare l’ostacolo della cristallizzazione delle proteine al fine di determinarne la struttura, ostacolo che lascia ancora irrisolta la struttura di gran parte delle proteine piu’ importanti, come quelle di membrana. Realizzazione di nuova tecnologia e nuova strumentazione scientifica e/o di

dispositivi avanzati, prototipi UdR Genova – Prof. C. Nicolini

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Sono stati ottimizzati nel quarto anno prototipi di dispositivi avanzati basati sulle attività scientifiche e sulle tematiche affrontate dall’Unità. Nappa Based Nanogravimetric Biosensor Presentiamo i nostri risultati riguardo all’implementazione di un nuovo biosensore nanogravimetrico realizzato combinando la Nanogravimetria a cristalli di quarzo con monitoraggio del fattore di dissipazione e un innovativo sistema di espressione proteica cell-free di nome Nucleic Acid Programmable Protein Array (NAPPA) che ci ha permesso di immobilizzare sulla superficie del quarzo, come molecola di rilevamento, le proteine espresse a partire dal plasmide. Presentiamo risultati sulla caratterizzazione del biosensore nanogravimetrico, sulla sua sensibilità e selettività.

Figura_Nanobiosensore QCM_D Inoltre abbiamo dimostrato come la misura simultanea della variazione della frequenza di risonanza e della dissipazione dell'energia sia fondamentale per interpretare correttamente il comportamento di un sistema complesso come quello NAPPA. Atomic Force Microscopy And Anodic Porous Allumina Of Nucleic Acid Programmable Protein Arrays. Vi presentiamo gli aspetti metodologici per la caratterizzazione dei NAPPA (Nucleic Acid Programmable Protein Array) mediante microscopia a forza atomica e la sua applicazione in combinazione con l’allumina Porosa Anodica. L’Allumina Porosa Anodica rappresenta un avanzato laboratorio su chip per l'espressione genica di in un plasmide ingegnerizzato. Sono presentati i risultati ottenuti con i geni di Cdk2, CDKN1A, p53 e Jun espressi mediante i NAPPA e sono discussi gli sviluppi futuri delle tecnologie applicate in termini di nostri recenti brevetti e delle loro possibilità di superare alcuni limiti della presente analisi in fluorescenza per sondare le interazioni proteina-proteina, sia in ricerca di base che in studi clinici. NAPPA-SNAP and APA technologies for genomics detection. Negli ultimi anni, le tecnologie label-free NAPPA e SNAP in combinazione alla tecnologia APA (alluminio poroso anodizzato), assieme a sistemi di espressione cell-free, appaiono convergere in unico singolo, integrato e ambizioso approccio capace di dare risposta a problemi ancora aperti nell'ambito della biomedicina e delle scienze della vita, includendo una piattaforma utile per l'espressione e la detezione di geni test, lo screening di nuovi preparati antigenici, nel contesto dello sviluppo e disegno di nuovi vaccini e della medicina personalizzata. Le prove di principio preliminari appaiono incoraggianti per il monitoraggio dei geni e della risposta immunitaria all'esposizione antigenica. La tecnologia NAPPA appare infatti promettente nel framework della nuova sanità pubblica basata sulle scienze omiche. Solo recentemente, array proteici sono stati costruiti e utilizzati per scoprire nuovi determinanti antigenici per lo sviluppo di vaccini. I sensori basati sulla tecnologia NAPPA possono essere utili per lo screening di affinità tra le proteine identificate e la sinapsi immunologica (complesso CD4, TCR, MHC). Le cinetiche di affinità possono venir altrettanto valutate mediante Microscopia a Forza Atomica (AFM) e Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR).

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Laser-Microdissection Of Protein Crystals Down To Submicron Dimensions Abbiamo studiato la microdissezione al laser di cristalli di proteine, in soluzione di glicerolo, "standard" e Langmuir-Blodgett (LB). Il tempo richiesto per la microdissezione era significativamente più lungo per cristalli LB rispetto ai normali cristalli che si dissolvono più rapidamente. La microframmentazione di cristalli di lisozima è stata osservata dopo un'esposizione prolungata al laser. La mappatura, tramite radiazione di sincrotrone con un fascio nanofocus, ha permesso la localizzazione e l'allineamento di microframmenti di lisozima in condizioni criogeniche. Gli insiemi 3D di dati ottenuti da due microframmenti sono stati raffinati a risoluzione atomica.

Le mappe di densità elettronica ben definiti non hanno mostrato alcuna evidenza di danni delle radiazioni dei gruppi sensibili. I nostri risultati suggeriscono l'applicazioni delle tecniche laser di microdissezione a studi strutturali su cristalli con un alta mosaicità. Essi forniscono inoltre una nuova metodica per la caratterizzazione di proteine fino alla scala del micron, indicando una nuova tecnica biofisica emergente.

SpADS: An R Package for Mass Spectrometry Data Preprocessing before Data Mining La recente applicazione della spettrometria di massa al metodo NAPPA per l'identificazione dei composti con metodi “non classici” porta come consguenza la necessità di un algoritmo più sofisticato per il riconoscimento di picco . Questa tecnica non convenzionale permette di sintetizzare proteine direttamente in situ da cDNA stampati , ma deve affrontare il problema degli spettri di background del “master mix” e delle molecole di lisato . Una vasta gamma di strumenti sono disponibili per identificare le proteine dai loro spettri di massa , ma sono ottimizzati per analisi MS convenzionale e devono essere composti da poche specie molecolari . Nessuna di loro è ottimizzata per la sottrazione del fondo. Inoltre , l'identificazione dei picchi principali viene effettuata mediante analisi statistica sui picchi caratteristici e, quindi , la sottrazione del fondo, può alterare il risultato cancellando picchi caratteristici . Un primo tentativo di superare i problemi finora discussi sono qui analizzati. Il risultato di questo sforzo è lo sviluppo di “Spectrum Analyzer and DataSet manager” - uno script in R per la pre elaborazione dei dati MS - che è qui discusso . SpADS offre funzioni di pre-elaborazione utili, come binning e l'estrazione , fornisce funzioni di sottrazione del background e di gestione dataset. SpADS è'interamente sviluppato in R , e quindi gratuito. Un'implementazione dell'algoritmo di cluster Kmeans è qui utilizzata per testare i risultati di prepocessing SPAD su insiemi di dati di test e NAPPA.

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Pubblicazioni scientifiche; UdR Genova – Prof. C. Nicolini

2013 Full Length Papers 2013_ SCI with Impact Factor

1. Claudio Nicolini, Debora Bruzzese, Cambria Maria Teresa , Nicola Bragazzi and Eugenia Pechkova, Recombinant Laccase : I. Enzyme Cloning And Biophysical Characterization , Journal Cellular Biochemistry, 2013, 114(3):599-605 (IF=3,6)

2. R. Spera, Bezerra Correia Terencio T. and C. Nicolini, Nappa Based Nanogravimetric Biosensor: Preliminary Characterization, Sensors Actuators B ,182 (2013) 682– 688 (IF 3,4)

3. P. Cossari, V. Bavastrello, C. Nicolini. Influence of Different Multi-Walled Carbon Nanotubes Content on Properties of Nanocomposytes with Poly(o-ethoxyaniline). Synthetic Metals 2013 ,176, 1-7 (I.F=2.1)

4. Orlando,B., Bragazzi,N. and C: Nicolini , Bioinformatics and systems biology analysis of genes network involved in OLP (Oral Lichen Planus) pathogenesis, Archieves Oral Biology 2013, 2930, 1-10 (IF=3)

5. R. Spera, F. Festa, N. Bragazzi, E. Pechkova, J. LaBaer and C. Nicolini, Conductimetric Biosensor For Monitoring Protein-Protein Interaction, Journal Proteome Research , 2013 , accepted (IF=5.11)

6. Pechkova E, Bragazzi NL, Belmonte L, Nicolini C, LB Nanotechnology And Space Appear To Yield The Best Protein Crystals By Clustering And Alignment, CREGE (IF=2.5) accepted

7. Marine Bozdaganyan, Nicola Bragazzi, Eugenia Pechkova, Kostanti Shaitan and Claudio Nicolini , Identification Of Best Protein Crystallization Methods By Molecular Dynamics, CREGE 2013 (IF=2.5) , accepted

8. Claudio Nicolini, Tercio Bezerra Correia ,Enrico Stura, Claudio Larosa, Rosanna Spera and Eugenia Pechkova, Atomic Force Microscopy And Anodic Porous Allumina Of Nucleic Acid Programmable Protein Arrays, “Recent Patents on Biotechnology” Vol. 07, No.2, 7, 111-121, 2013.

9. Claudio Nicolini , Manju Singh , Rosanna Spera, Genes Expression On Anodic Porous Alumina Microarray. Bioengineered 2013, 4:5, 1-6

10. R. Spera, F. Vasile, E. Pechkova and C. Nicolini. ,Correlation Of Changes Of Cho–K1 Cells Metabolism To Changes In Protein Expression In Camp Differentiation, Alternative & Integrative Medicine , 2013, 2, 1, 1-6

11. Bragazzi and Nicolini , Journal Computer Science & System Biology , A Leader Genes approach-based tool for molecular genomics: from gene-ranking to gene-network systems biology and biotargets predictions, 2013 Volume 6(3): 165-176 , (UIF =3.11)

12. Claudio Nicolini, Rosanna Spera, Fernanda Festa, Luca Belmonte, Shaorong Chong, Joshua Labaer and Eugenia Pechkova, Mass Spectrometry And Florescence Analysis Of Snap Arrays, Journal Nanomedicine and Nanotechnology 2013 accepted (UIF=5.7)

13. Eugenia Pechkovaab, Luca Belmontea, Christian Riekelc, Dmitri Popovd, Christian Koenige and Claudio Nicolini, Laser-microdissection of protein crystals down

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to submicron dimensions , Journal Nanomedicine and Nanotechnology, 2013 accepted (UIF=5.7)

14. Luca Belmonte, Rosanna Spera and Claudio Nicolini, SpADS: An R Script for Mass Spectrometry Data Preprocessing before Data Mining, Journal Computer Science & Sysem Biology , 2013 6(5) 298-304 (UIF =3.11),

15. Claudio Nicolini, Nicola Bragazzi and Eugenia Pechkova. From Nanobiotechnology To Organic And Biological Monitoring Of Health And Environment For Biosafety, Journal of Bioanalysis and Biomedicine 2013 5(4), 108-117 (UIF=2.49).

16. Nicola Luigi Bragazzi , Rosanna Spera , Eugenia Pechkova and Claudio Nicolini , NAPPA-Based Nanobiosensor for the Detection of Proteins and Proteoin-Protein Interactions Relevant to Cancer , 2013 Journal Carcinogenesis and Mutagenesis , submitted upon invitation (UIF 2.8 )

17. Claudio Nicolini, Luca Belmonte, Christian Koenig Christian Riekel and Eugenia Pechkova,Langmuir-Blodgett Nanotemplate-Induced Crystallization Combined With Laser-Induced Microfragmentation Allows Unique Characterization Of Proteins Crystals At High Dose, Am Jour Biochem Biotech 2013 , submitted upon invitation (IF=1.6)

18. Nicola Bragazzi and Claudio Nicolini, A biomolecular data-mining strategy for predicting human diseases-related microRNAs, based on Leader Genes algorithm: an application to Oral Lichen Planus (OLP) and PHA-stimulated Human Lymphocytes, Archieve Oral Biology (IF 3) submitted

19. Cossari, Bavastrello, Bezzerra and Nicolini. Development of QCM sensors based on Multi-Walled Carbon Nanotubes -Poly(o-ethoxyaniline) Nanocomposites for the Detection of Volatile Organic Compounds, Sensors Actuators B (IF 3.66), submitted

20. Claudio Nicolini, Luca Belmonte , George Maximov, Nadejsda Brage and Eugenia Pechkova ,,In Situ Monitoring Of Lysozyme Concentration During Crystallization In A “Nanotemplate” Hanging Drop By Raman Spectroscopy, Journal Microbial Biochemical Technology (UIF 2.61) submitted

21. Nicola Bragazzi and Claudio Nicolini Nanogenomics Enabling Personalized Medicine: An Application To Kidney Transplantation, Cell and Molecular Biology (IF 0.8) submitte

22. Claudio Nicolini, Nicola Bragazzi ,Eugenia Pechkova and Remo Lazzari, Ab initio Quantitative Analysis of Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering during Protein Crystal Nucleation and Growth, Journal Proteome Bioinformatics (UIF 2.8 ) submitted

23. Eugenia Pechkova, Nicola Bragazzi and Claudio Nicolini, Protein Crystallization By Anodic Porous Alumina (Apa) Template Crystal Growth Design 2013 (IF 4.8) submitted

Full Length Papers 2013_ Thomson ISI Web of Science

24. C. Nicolini , Present challenges and future solutions , in Nanobiotechnology In Enenergy, Environment and Electronics: Methods and Applications, C. Nicolini Ed, Vol.4 Nanobiotechnology Series, Ed C. Nicolini, Pan Stanford Publishing , Singapore-NY , 2013, Thomson ISI Web of Science, pp

25. Pechkova E:, M. Ostrowoski, A. , Oxana, Kirpichnikov M. and C. Nicolini, Recombinant versus wild-type Octapus Rodopsin for Bioelectronics, in Nanobiotechnology In Enenergy, Environment and Electronics: Methods and Applications, C. Nicolini Ed, Vol.4 Nanobiotechnology Series, Ed C. Nicolini, Pan Stanford Publishing , Singapore-NY , 2013, Thomson ISI Web of Science, pp

26. P. Cossari, V. Bavastrello and C. Nicolini, Multi-Walled Carbon Nanotubes and Poly(o-ethoxyaniline) Nanostructured Films for Sensor Development ,. in Nanobiotechnology In Enenergy, Environment and Electronics: Methods and Applications, C. Nicolini Ed,

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Vol.4 Nanobiotechnology Series, Ed C. Nicolini, Pan Stanford Publishing , Singapore-NY , 2013, Thomson ISI Web of Science, pp

27. L. Belmonte and C. Nicolini, Modeling and Software Development For Sensor Technology, in Nanobiotechnology In Enenergy, Environment and Electronics: Methods and Applications, C. Nicolini Ed, Vol.4 Nanobiotechnology Series, Ed C. Nicolini, Pan Stanford Publishing , Singapore-NY , 2013, Thomson ISI Web of Science, pp

28. Narizzano R. and C. Nicolini, Nanocomposites for Electronic Materials, in Nanobiotechnology In Enenergy, Environment and Electronics: Methods and Applications, C. Nicolini Ed, Vol.4 Nanobiotechnology Series, Ed C. Nicolini, Pan Stanford Publishing , Singapore-NY , 2013, Thomson ISI Web of Science, pp

29. E. Stura and C. Nicolini, Nanotechnology for energy devices: Photovoltaic Cells and Batteries, in Nanobiotechnology In Enenergy, Environment and Electronics: Methods and Applications, C. Nicolini Ed, Vol.4 Nanobiotechnology Series, Ed C. Nicolini, Pan Stanford Publishing , Singapore-NY , 2013, Thomson ISI Web of Science, pp

30. N. Bragazzi, M. Bozdaganyan ; E. Pechkova and C. Nicolini, Molecular Dynamics Towards Nanodevices for Drug Screening and Vaccines, in Nanobiotechnology In Enenergy, Environment and Electronics: Methods and Applications, C. Nicolini Ed, Vol.4 Nanobiotechnology Series, Ed C. Nicolini, Pan Stanford Publishing , Singapore-NY , 2013, Thomson ISI Web of Science, pp

31. R. Spera, A. Salina, E. Stura, C. Nicolini, Fungal lipases catalyzing hydrolysis of Olive oil for Biodiesl ,in Nanobiotechnology In Enenergy, Environment and Electronics: Methods and Applications, C. Nicolini Ed, Vol.4 Nanobiotechnology Series, Ed C. Nicolini, Pan Stanford Publishing , Singapore-NY , 2013, Thomson ISI Web of Science, pp

Full Length Papers 2013_Book Chapters

Nicolini C. , Pechkova E. Biochimica delle Biomolecole nell’uomo: Struttura Atomica e Funzione, in Biochimica Umana , Eds. F. Salvatore et al, Capitolo 24, pp. 1-27, Casa Editrice Idelson Gnocchi,. ISBN 978-88-7947-556-3 , 2013 V. Bavastrello, C. Nicolini , Polyaniline derivates and carbon nanotubes and their characterization , in Nanocomposites. Materials, Manufacturing and Engineering, J. Paulo Davim and Constantinos A. Charitidis Eds., Vol. 1, chapter 6, De Gruyter. ISBN 978-3-11-026644-3, 2013.

Contributi orali in congress 1. Pechkova E, Bragazzi NL, Nicolini C. SNAP Nanoarrays for Structural and Functional Nanoproteomics. BioNanoMed2013, 4th International Congress Nanotechnology, Medicine and Biology. Krems, Austria. 13-15 March 2013. 2. Bragazzi NL, Pechkova E., Nicolini C. NAPPA technology for vaccine design. 2nd International Congress on Pathogens at the Human-Animal Interface (ICOPHAI): One Health for Sustainable Development. Summerville Beach Resort, Porto de Galinhas, Brazil. August 14 – 17 2013. \3. Nicolini C, Bragazzi NL, Pechkova E. NAPPA-SNAP and APA technologies for genomics detection. 2nd International Congress on Pathogens at the Human-Animal Interface (ICOPHAI): One Health for Sustainable Development. Summerville Beach Resort, Porto de Galinhas, Brazil. August 14 – 17 2013. 4. Nicolini, C. Nanoproteomics UNITÀ FIRB NANOITALNET Milano, 22-23 Gennaio 2013

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5. C. Nicolini , Spera, R. and E. Pechkova From Label Free Mass Spectrometry Of Nappa And Snap Generated Proteins To Qmc_D Sensor Of New Conception ,International Conference on Biodefense & Natural Disasters, August 21-23, 2013 , Orlando-FL, USA 6. Pechkova,E. and Nicolini,C. Organic And Biological Nanosensors For Envronment, International Conference on Biodefense & Natural Disasters, August 21-23, 2013 , Orlando-FL, USA 7. Claudio Nicolini, Rosanna Spera, Belmonte Luca, ,Fernanda Festa, Shaorong Chong, Eugenia Pechkova and Joshua Labaer ,Mass Spectrometry And Florescence Analysis Of Snap Nappa Arrays Nanotek 4 December 2013 Las Vegas 8. Eugenia Pechkova, Luca Belmonte, Christian Riekel, Dmitri Popov, Christian Koenig

and Claudio Nicolini, Laser-Microdissection Of Protein Crystals Down To Submicron Dimensions Nanotek 4 December 2013 Las Vegas 9. Pierluigi Cossaria*, Tercio Terencioa, Valter Bavastrelloa and Claudio Nicolinia,

Development of QCM sensors based on Multi-Walled Carbon Nanotubes - Poly(o-ethoxyaniline)Nanocomposites for the Detection of Volatile Organic Compo Accademia Dei Lincei Roma 5 Novembre 2013 10. Bragazzi NL, Nicolini C, Pechkova E, Lazzari R. New insights on protein crystal growth from ab initio study of MICROGISAXS experiments with and without LB. FisMat2013, Milan, Italy. September 9-13, 2013. 11. Bragazzi NL, Pechkova E, Nicolini C. Nanogenomics and nanoproteomics enabling personalized, predictive and preventive nanomedicine. The 6th China Medicinal Biotech Forum (CMBF-2013), Shenzhen, China. September 25-26 2013. 12. Bragazzi NL, Pechkova E, Nicolini C. Labeled and label-free sensors for early detection of lung cancer. BIT’s 2nd Lung Cancer Summit-2013 (LCS-2013), Rome, Italy. 4-5 December 2013.

PDB structures stored in 2012

PDB ID

Authors Structure Title Journal

(Pechkova et al 2012) Eugenia Pechkova, Dora Scudieri, Luca Belmonte and Claudio Nicolini “Oxygen-Bound Hell's Gate Globin I By Classical Versus LB Nanotemplate Method”, Journal of Cellular Biochemistry, 113:2543-2548 (2012) DOI: 10.1002/jcb.24131 ISSN: 07302312 (IF=3.6)

3UBC Belmonte, L., Scudieri, D., Nicolini, C., Pechkova, E.

Oxygen-bound hell's gate globin I by LB nanotemplate method

Pechkova et al 2012°

3UBV Scudieri, D., Belmonte, L., Saito, J.A., Alam, M., Nicolini, C., Pechkova, E.

Oxygen-bound hell's gate globin I by classical hanging drop

Pechkova et al 2012°

[Pechkova et al 2012b] Eugenia Pechkova, Victor Sivozhelezov, Luca Belmonte, And Claudio Nicolini “Unique water distribution of Langmuir-Blodgett versus classical crystals” Journal of Structural Biology 180: 57–64 (2012) DOI: 10.1016/j.jsb.2012.05.021 ISSN: 10478477 (IF=3.805)

12

4DIY Pechkova, E., Sivozhelezov, V., Belmonte, L., Nicolini, C.

Thaumatin I by Classical Hanging Drop Method at 1.98A resolution for Unique Water Distribution

Pechkova et al 2012b

4DIZ Pechkova, E., Sivozhelezov, V., Belmonte, L., Nicolini, C.

Thaumatin I by Classical Hanging Drop Method at 1.98A resolution for Unique Water Distribution

Pechkova et al 2012b

4DJ0 Pechkova, E., Sivozhelezov, V., Belmonte, L., Nicolini, C.

Thaumatin I by Langmuir-Blodgett Hanging Drop Method at 1.98A resolution for Unique Water Distribution

Pechkova et al 2012b

4DJ1 Pechkova, E., Sivozhelezov, V., Belmonte, L., Nicolini, C.

Thaumatin I by Langmuir-Blodgett Hanging Drop Method at 1.98A resolution for Unique Water Distribution

Pechkova et al 2012b

4DJ5 Pechkova, E., Sivozhelezov, V., Belmonte, L., Nicolini, C.

Proteinase K by Langmuir-Blodgett Hanging Drop Method at 1.8A resolution for Unique Water Distribution

Pechkova et al 2012b

[Belmonte et al 2012] Luca Belmonte, Eugenia Pechkova, Shailesh Tripathi, Dora Scudieri, and Claudio Nicolini “Langmuir-Blodgett Nanotemplate and Radiation Resistance in Protein Crystals:State of the Art”, Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, 22(3):219-232 (2012) DOI: 10.1615/CritRevEukarGeneExpr.v22.i3.50 ISSN: 10454403 (IF=4.111)

3V7V Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by Classical Hanging Drop Vapour Diffusion after 1.81 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Best Case)

Belmonte et al 2012

3VCH Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by Classical Hanging Drop Vapour Diffusion after 18.1 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Best Case)

Belmonte et al 2012

3V82 Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by LB based Hanging Drop Vapour Diffusion after 1.81 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Best Case)

Belmonte et al 2012

3VCJ Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by LB Hanging Drop Vapour Diffusion after 18.1 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Best Case)

Belmonte et al 2012

3V84 Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by LB based Hanging Drop Vapour Diffusion after 1.81 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Worst Case)

Belmonte et al 2012

13

3V88 Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by Classical Hanging Drop Vapour Diffusion after 18.1 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Best Case)

Belmonte et al 2012

3V8A Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by Classical Hanging Drop Vapour Diffusion after 18.1 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Worst Case)

Belmonte et al 2012

3V87 Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by Classical Hanging Drop Vapour Diffusion after 1.81 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Worst Case)

Belmonte et al 2012

3VCG Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by LB based Hanging Drop Vapour Diffusion after 18.1 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Worst Case)

Belmonte et al 2012

3VCK Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by LB Hanging Drop Vapour Diffusion after 9.05 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Worst Case)

Belmonte et al 2012

3VCI Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by Classical Hanging Drop Vapour Diffusion after 9.05 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Worst Case)

Belmonte et al 2012

3VCE Belmonte, L., Scudieri, D., Tripathi, S., Pechkova, E., Nicolini, C.

Thaumatin by LB based Hanging Drop Vapour Diffusion after 18.1 MGy X-Ray dose at ESRF ID29 beamline (Best Case)

Belmonte et al 2012

PDB structures stored in 2013 [Pechkova et al2013a] Eugenia Pechkova, Luca Belmonte, Christian Riekel, Dmitri Popov, Christian Koenig and Claudio Nicolini “Laser - microdissection of protein crystals down to submicron dimensions” Journal Nanomedicine and Nanotechnology (Estimed I.F. 5.72)

4HV1 E.Pechkova, L.Belmonte, C.Riekel, D.Popov, C.Koenig, C.Nicolini

Laser-induced microfragmentation of lysozyme crystals allows X-ray nanodiffraction characterization of individual domains (lb4)

Pechkova et al2013a

4HV2 E.Pechkova, L.Belmonte, C.Riekel, D.Popov, C.Koenig, C.Nicolini

Laser-induced microfragmentation of lysozyme crystals allows X-ray nanodiffraction characterization

Pechkova et al2013a

14

of individual domains (lb5)

[Nicolini et al 2013]Claudio Nicolini , Luca Belmonte, Christian Koenig, Christian Riekel and Eugenia Pechkova “Langmuir-blodgett nanotemplate-induced crystallization combined with laser-induced microfragmentation allows unique characterization of proteins crystals at high dose” 4IAS Belmonte, L., Pechkova, E., Riekel, C.,

Scudieri, D., Nicolini, C. HEW Lysozyme by langmuir- blodgett modified vapour diffusion

Nicolini et al2013

4IAT Belmonte, L., Pechkova, E., Riekel, C., Scudieri, D., Nicolini, C.

HEW Lysozyme by langmuir- blodgett modified vapour diffusion

Nicolini et al2013

[Pechkova et al2013b] Eugenia Pechkova, Nicola Bragazzi, Luca Belmonte, Claudio Nicolini "Optimal Protein Crystallization: I. Clustering and Protein Alignment " Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression (Accepted) (I.F. 4.111)

4I5Z Belmonte, L., Pechkova, E., Bragazzi, N., Nicolini, C.

Insulin protein crystallization via langmuir-blodgett

Pechkova et al2013

4I5Y L.Belmonte, E.Pechkova, N.Bragazzi, C.Nicolini

Insulin protein crystallization via langmuir-blodgett

Pechkova et al2013b

4I8S L.Belmonte, E.Pechkova, N.Bragazzi, D.Scudieri, C.Nicolini

Hen Lysozyme protein crystallization via standard hanging drop vapor diffusion

Pechkova et al2013b

4IHN L.Belmonte, E.Pechkova, N.Bragazzi, C.Nicolini

High Resolution Insulin by Langmuir-Blodgett Modified Hanging Drop Vapour Diffusion

Pechkova et al2013b