Istologia 02 - Colorazioni Istologiche

4
  Istologia 02  Colorazioni istologiche 1 Istologia 02  Colorazioni istologiche Preparazione di un campione La preparazione di un campione (preparato istologico) da osservare al microscopio comprende 3 fasi: 1. Fissazione 2. Disidratazione e diafanizzazione 3. Inclusione e/o sezionamento 4. Colorazione Colorazione 1  Esistono diverse tecniche di colorazione dei tessuti. Le principali sono le seguenti:  Istologica. Questo tipo di colorazione mette in evidenza lei “caratteristiche morfologiche” dei tessuti e delle cellule. A sua volta, comprende tecniche bicromiche (quando si usano due coloranti), tricromiche (se si usano 3 coloranti) e tecniche elettive (quando si privilegia la colorazione di un determinato tessuto   es. connettivo, nervoso, muscolare - a scapito di altri). Le più diffuse colorazioni istologiche sono l’Ematossillina-Eosina (bicromica), colorazione di Azan-Mallory (tricromica) e alcune colorazioni istologiche selettive, quali la Gomori, la Sudan III, la Nissl, la Golgi- Cajal, la May-Grunwald-Giemsa.  Istochimica. Mette in evidenza le caratteristiche chimiche dei tessuti e delle cellule che li compongono. Ciò avviene sviluppando una reazione chimica vera e propria che darà un precipitato che si vede al microscopio. Esempio classico è la reazione di PAS e l’Alcian blu.   Immunoistochimica. Si tratta di una tecnica di colorazione altamente specifica che colora determinati antigeni presenti nel tessuto. Questa tecnica prevede l ’uso di particolari anticorpi legati a cromogeni insolubili che permettono la visione delle strutture che interessano mediante microscopia ottica (si tratta di metalli pesanti, enzimi o fluorocromi). Alcuni esempi di colorazione istologica. Colorazione ematossilina-eosina (EE) è la tecnica più comunemente usata. L’ematossilina è un colorante basico che si lega a molecole acide (quindi basofile) conferendo ad esse un colore blu violaceo. L’eosina è invece una molecola acida che colora le strutture basiche (acidofile) in rosso- rosa-arancio. In generale, nei tessuti colorati con HE, le cellule hanno i nuclei di colore blu-violaceo e il citoplasma di colore rosa- arancio.  Colorazione  Azan-Mallory : è una colorazione tricromica utilizzata per evidenziare le fibre del collagene. L’azocarminio, colora in rosso intenso le strutture acide (nucleo e, in minor misura, il citoplasma), mentre le strutture basiche (fibre collagene e muco) vengono colorate dal blu di anilina o dal violetto arancio dell’orange G.  Colorazione di Gomori : è una colorazione elettiva per le fibre reticolari, che appaiono in nero intenso su un fondo grigio-giallo. Si basa 1  La colorazione serve a rendere visibili le cellule, dato che esse sono per natura trasparenti. La maggior parte dei coloranti è impiegata per la microscopia ottica, mentre per quella elettronica non si usano coloranti, ma si uniscono i campioni ad alcune sostanze metalliche, che si prestano bene ad essere attraversate dagli elettroni (TEM) o a riflettere il fascio di elettroni, mettendo in evidenza le superfici cellulari (SEM).

description

:)

Transcript of Istologia 02 - Colorazioni Istologiche

  • Istologia 02 Colorazioni istologiche 1

    Istologia 02 Colorazioni istologiche Preparazione di un campione La preparazione di un campione (preparato istologico) da osservare al microscopio comprende 3 fasi:

    1. Fissazione

    2. Disidratazione e diafanizzazione

    3. Inclusione e/o sezionamento

    4. Colorazione

    Colorazione1 Esistono diverse tecniche di colorazione dei tessuti. Le principali sono le seguenti:

    Istologica. Questo tipo di colorazione mette in evidenza lei caratteristiche morfologiche dei

    tessuti e delle cellule. A sua volta, comprende tecniche bicromiche (quando si usano due coloranti),

    tricromiche (se si usano 3 coloranti) e tecniche elettive (quando si privilegia la colorazione di un

    determinato tessuto es. connettivo, nervoso, muscolare - a scapito di altri). Le pi diffuse

    colorazioni istologiche sono lEmatossillina-Eosina (bicromica), colorazione di Azan-Mallory

    (tricromica) e alcune colorazioni istologiche selettive, quali la Gomori, la Sudan III, la Nissl, la Golgi-

    Cajal, la May-Grunwald-Giemsa.

    Istochimica. Mette in evidenza le caratteristiche chimiche dei tessuti e delle cellule che li

    compongono. Ci avviene sviluppando una reazione chimica vera e propria che dar un precipitato

    che si vede al microscopio. Esempio classico la reazione di PAS e lAlcian blu.

    Immunoistochimica. Si tratta di una tecnica di colorazione altamente specifica che colora

    determinati antigeni presenti nel tessuto. Questa tecnica prevede luso di particolari anticorpi legati

    a cromogeni insolubili che permettono la visione delle strutture che interessano mediante

    microscopia ottica (si tratta di metalli pesanti, enzimi o fluorocromi).

    Alcuni esempi di colorazione istologica.

    Colorazione ematossilina-eosina (EE) la tecnica pi comunemente

    usata. Lematossilina un colorante basico che si lega a molecole acide

    (quindi basofile) conferendo ad esse un colore blu violaceo. Leosina

    invece una molecola acida che colora le strutture basiche (acidofile) in

    rosso- rosa-arancio. In generale, nei tessuti colorati con HE, le cellule

    hanno i nuclei di colore blu-violaceo e il citoplasma di colore rosa-

    arancio.

    Colorazione Azan-Mallory: una colorazione tricromica utilizzata per

    evidenziare le fibre del collagene. Lazocarminio, colora in rosso intenso

    le strutture acide (nucleo e, in minor misura, il citoplasma), mentre le

    strutture basiche (fibre collagene e muco) vengono colorate dal blu di

    anilina o dal violetto arancio dellorange G.

    Colorazione di Gomori: una colorazione elettiva per le fibre reticolari,

    che appaiono in nero intenso su un fondo grigio-giallo. Si basa

    1 La colorazione serve a rendere visibili le cellule, dato che esse sono per natura trasparenti. La maggior parte dei coloranti impiegata per la microscopia ottica, mentre per quella elettronica non si usano coloranti, ma si uniscono i campioni ad alcune sostanze metalliche, che si prestano bene ad essere attraversate dagli elettroni (TEM) o a riflettere il fascio di elettroni, mettendo in evidenza le superfici cellulari (SEM).

  • Istologia 02 Colorazioni istologiche 2

    sullaffinit dellargento per le proteine costituenti queste fibre.

    Colorazione Sudan III e Sudan Black: serve

    per evidenziare le goccioline lipidiche

    contenute nelle cellule adipose. Le sezioni

    si ottengono da pezzi congelati e tagliati al

    criostato (in modo da evitare i successivi

    passaggi nei solventi organici) che scioglierebbero le goccioline lipidiche. Il Sudan III colora le

    goccioline lipidiche in giallo-arancio mentre il Sudan Black le colora in nero.

    Colorazione di Nissl: una colorazione per il sistema nervoso centrale

    e si usa su sezioni in paraffina di 10 m di spessore. La peculiarit

    quella di mettere in evidenza la zona tigroide del Nissl (accumulo di

    ribosomi nel pirenoforo, il corpo cellulare delle cellule nervose),

    colorandola con il blu-azzurro tipico del blu di toluidina.

    Colorazione di Golgi-Cajal: anchessa una colorazione specifica per il sistema nervoso centrale.

    Piccoli pezzi molto freschi di sistema nervoso centrale vengono

    immersi per 1-6 giorni in soluzione osmio-bicromica a 25C.

    Successivamente, il pezzo viene colorato con nitrato dargento all1%

    in acqua. La reazione pu durare fino a 3 giorni. A colorazione

    avvenuta si includono i pezzi in paraffina e si tagliano sezioni molto

    spesse, intorno a 40-50 m, per avere una visione il pi completa

    possibile del tessuto e dei vari costituenti cellulari. Questa una colorazione di difficile riuscita che,

    molte volte, presenta problematiche praticamente irrisolvibili. In ogni caso, si ha una buona

    colorazione quando le cellule nervose spiccano in nero intenso su un fondo color tabacco. Proprio

    perch di difficile e incostante riuscita sono state proposte, da vari autori, diverse varianti (Golgi-

    Bubenaite, Golgi-Cox, ecc.) sempre difficoltose da realizzare.

    May-Grunwald-Giemsa: una colorazione elettiva per il sangue. Viene

    utilizzata per colorare gli strisci di sangue. Il sangue viene strisciato su

    un vetrino portaoggetto, fissato per 30 min. allaria e colorato prima

    con la miscela di May-Grnwald (blu di metilene e eosina), quindi,

    lavato e colorato col Giemsa (composto da eosina, blu di metilene,

    azzurro A e B e violetto di metilene). I globuli rossi appaiono rosa-

    arancio, i nuclei dei leucociti blu.

    Alcuni esempi di colorazione istochimica.

    Reazione PAS: Questa una reazione specifica per le mucine neutre (presenti negli epiteli

    secernenti, nelle ghiandole endocrine e nel sistema nervoso). Viene

    impiegato un ossidante (lacido periodico), che attacca

    selettivamente il gruppo funzionale amminico primario o quello

    OH delle mucine, provocando la liberazione di un gruppo aldeidico

    rivelato, poi, dal reattivo di Shiff (rosso porpora). Si esegue

    normalmente in associazione allAlcian blu (che colora le mucine

    acide).

    Alcian blu: una colorazione utilizzata per evidenziare sia le mucine acide che i glicosaminoglicani

    (GAG) contenenti gruppi carbossilici. Di solito si esegue in contemporanea alla PAS reazione, per

  • Istologia 02 Colorazioni istologiche 3

    avere un quadro completo delle mucine presenti nel preparato, sia

    acide (Alcian, precipitato blu intenso), sia neutre (PAS, rosso).

    Alcuni esempi di colorazione immuno-istochimica.

    Limmunoistochimica un metodo complesso specifico per la rilevazione di particolari antigeni2

    presenti nel tessuto o nelle cellule da

    esaminare. Su una sezione di tessuto o su

    cellule opportunamente preparate, si

    pone lanticorpo specifico che legato a

    sostanze evidenziabili alla microscopia

    (fluorocromi, metalli pesanti, enzimi).

    Sezioni istologiche Quando si osserva un vetrino, si deve saper immaginare la struttura 3D corrispondente allimmagine piatta che vediamo. Se loggetto che si osserva una sfera, ci apparir come un cerchio di dimensione diversa a seconda della zona dove avviene il taglio. Se loggetto una struttura tubulare, possiamo avere tre diversi tipi di sezioni:

    Longitudinale: la struttura viene tagliata secondo la sua dimensione maggiore (di lungo);

    Trasversale: il taglio avviene lungo la dimensione minore delloggetto (perpendicolare al taglio longitudinale)

    Obliqua: il taglio avviene lungo un asse a met tra il trasversale e il longitudinale.

    2 Un antigene una sorta di targa che identifica le cellule di un organismo. Un organismo ha cellule diverse tra loro, ma con gli stessi antigeni. Gli antigeni vengono riconosciuti da particolari glicoproteine, gli anticorpi (o immunoglobuline Ig). Essi sono prodotto da un particolare tipo di cellule, i linfociti B. Nei metodi immunoistochimici, il legame antigene-anticorpo causa una fluorescenza, che pu essere rilevata con particolari macchinari.

  • Istologia 02 Colorazioni istologiche 4

    Nel taglio longitudinale, un tubo pu apparire o come due pareti distanziate da uno spazio vuoto (se il taglio avviene lungo la cavit del tubo) o come una singola parete (se il taglio non prende la cavit). Nel taglio trasversale il tubo appare come un cerchio il cui interno vuoto. Nel taglio obliquo si ha una forma simile al taglio trasversale, ma pi ovale. Nel caso in cui si osservi un tessuto con cellule strettamente unite tra di loro (come un tessuto epiteliale di rivestimento), le sezioni longitudinale e trasversale daranno lo stesso risultato allosservazione: si vedr uno o pi strati di cellule quadrate o rettangolari ed i nuclei risulteranno sempre allineati per file. Se invece si fa una sezione obliqua, si osserveranno parti di cellule dei vari strati e lo stesso accadr con i loro nuclei. Appariranno pi file di cellule e solo alcune saranno complete, mentre la maggior parte risulter frammentaria. Preparazione microscopia elettronica

    Chimica Fissazione Disidratazione Impregnazione: con resina epossidica Taglio: ultramicrotomo (50 nm) Coloranti: sali e idrossidi di metalli pesanti Montaggio: microreti metalliche

    Fisica Frozen-fracture (impronta): scansione