Introduzione
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Valutazione della sensibilità in vitro agli antimicrobici, ricerca dei fattori di virulenza e di geni responsabili dell’antibiotico-resistenza in Escherichia coli enteropatogeni isolati da coniglio Anna Giannina Perugini 1 , Anna Cerrone 1 , Fabrizio Agnoletti 2 , Lorella Barca 1 , Elena Mazzolini 3 , Giovanni Cattoli 4 , Vincenzo Caligiuri 1 , Mario Bartoli 1 , Federico Capuano 1 1Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Via Salute 2, 80055 Portici (Na) 2Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio di Treviso, Viale Brigata Treviso 13/A, 31100 Treviso, 3Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio di Udine, Via Della Roggia 100, 33030 Campoformido (UD) 4Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio di Virologia, Viale dell’Università 10, 35020 Legnaro (PD) Introduzione Le infezioni da Escherichia coli enteropatogeni (EPEC) rappresentano una frequente causa di patologie gastro-intestinali nel coniglio. Tali patogeni sono in grado di indurre non solo specifiche lesioni intestinali, definite “attachment-and-effacement (A/E) lesion”, ma producono anche un caratteristico pattern di aderenza, definito ‘localized adherence’ (LA) (Adu-Bobie et al., 1998). Geni responsabili di LA e A/E sono stati localizzati in due regioni, definite ‘LEE region’ e EAF, all’interno delle quali, oltre a geni codificanti per sistemi di secrezione, è localizzato il gene dell’intimina (eae in LEE). A promuovere l’adesione alle cellule epiteliali intestinali del coniglio intervengono anche le fimbrie AF/R1 e AF/R2, descritte rispettivamente nel ceppo RDEC-1 (O’Hanley e Cantey, 1978) e negli isolati O103:H2 che non fermentano il ramnosio (Milon et al, 1990). Nonostante sia noto il meccanismo responsabile della patogenicità degli EPEC nel coniglio, i trattamenti per le enterocoliti da Escherichia risultano spesso inutili forse anche a causa della resistenza agli antimicrobici, in grado di favorire la sopravvivenza nonché la proliferazione di tali patogeni. In questo studio per la prima volta ceppi REPEC (Rabbit Enterophatogenic Escherichia coli ), caratterizzati per la presenza dei geni di patogenicità eae, AF/R1 o AF/R2, sono stati analizzati sia per la sensibilità in vitro ad alcuni antimicrobici, comunemente usati in medicina veterinaria, in particolar modo nell’allevamento del coniglio da carne, sia per la presenza di alcuni dei determinanti genetici di resistenza agli antibatterici potenzialmente trasferibili ad altri patogeni. Bibliografia Adu-Bobie J, Frankel g, Bain C, Goncalves AG, Tabulsi LR, Douce G, Knutton S and Dougan G, 1998. J. Clin Microbiol, 36 (3): 662-668. Bauer Enne V.I., Livermore D.M., Stephens P., Hall L.M.C., 2001. The Lancet, 357: 1325-1328. Karch H, Bohm H, Schmidt H, Gunzer F, Aleksic S and HeesemannJ., 1993. J. Clin. Microbiol., 31: 1201-1205; O’Hanley P, Cantey JR, 1978.Infect Immun, 21: 874-878. Milon A, Esslinger L, Camguilhem R, 1990. Infect Immun 58: 2690-2695. National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1999. Approved standards M7-A5: methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. NCCLS, Wayne, Pa. Materiale e metodi Isolamento 198 ceppi di Escherichia coli sono stati isolati da conigli deceduti per enterocolite in Italia. I campioni, raccolti durante gli esami necroscopici, sono stati isolati su McConkey agar, incubato a 37° C per 24h. La caratterizzazione biochimica delle colonie identificate è stata realizzata mediante gallerie API 20E System (bioMerieux, Marcy l’Etoile, France). Sensibilità agli antibiotici I saggi di sensibilità sono stati eseguiti mediante la tecnica di diffusione in agar (Bauer, 1996), secondo le procedure della National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). PCR La reazione a catena della polimerasi è stata utilizzata sia per la ricerca di alcuni fattori di patogenicità (eae; AF/R1 o AF/R2) ( Karch et al., 1993;Penteado et al., 2002) che di alcuni dei geni responsabili della resistenza: ai sulfamidici (sul1 e sul2) (Enne et al, 2001), al trimetoprim (dhfrI, dhfrV, dhfrVII, dhfrIX, dhfrXIII), alla gentamicina [aadB, aaC2, aac(3)-IV], alla neomicina (aphA1, aphA2 e aadB) e all’apramicina [aac(3)-IV] (Maynard et al., 2003). Risultati Dei 198 ceppi analizzati per la presenza dei fattori di virulenza, 129 sono risultati positivi per eae (65.2%), 114 per AF/R2 (57.6%), 15 per AF/R1 (7.6%), questi ultimi isolati tutti dallo stesso allevamento. I risultati dei saggi di sensibilità agli antibiotici e delle PCR per la ricerca di geni alla resistenza ai farmaci sono schematizzati nelle tabelle 1 e 2. Conclusioni Sebbene sia stata analizzato solo un ridotto gruppo di geni associati alla resistenza ad alcuni antimicrobici, risulta evidente la presenza di alcuni di essi negli isolati analizzati. L’esistenza di geni in grado di garantire la resistenza a più farmaci, ovvero in grado di agire su molecole diverse [es. aac (3)-IV], può influenzare la “precocità” della comparsa dei fenomeni di resistenza, e incidere negativamente sull’efficacia delle eventuali associazioni impiegate in campo. Sebbene alcuni ceppi risultino sensibili ad alcuni farmaci, non presentano necessariamente i markers cercati (ad es. aadB), probabilmente perché sebbene conferiscano resistenza a più molecole della stessa famiglia (neomicina e gentamicina), sono solo una piccola rappresentanza del cluster di determinanti genetici in grado di conferire resistenza a diversi amminoglicosidi. I risultati ottenuti suggeriscono di estendere l’analisi dei geni di resistenza agli antimicrobici, ovvero di continuare il monitoraggio dei REPEC, non solo in funzione della loro nota patogenicità, ma anche in quanto potenziale serbatoio di geni di resistenza trasferibili ad altri organismi della microflora intestinale del coniglio. MOLECOLE TESATE ISOLAMENTOMENTO DEL CEPPO: PERIODO DI RIFERIMENTO 1999-2001 2002-2005 N. di ceppi analizzati distribuiti secondo la loro risposta all’antibiotico S I R S I R trimethoprim- sulfamethoxazole (STX) 63 3 70 16 13 32 Enrofloxacina 87 21 8 15 12 26 Flumequina 75 37 24 5 18 26 Norfloxacin 94 1 Chinolone (Gen III) 2 9 1 Colistina solfato 48 66 22 54 3 2 Penicillina G 122 11 Amoxcyllina 62 3 30 38 4 8 Doxiciclina 5 5 85 3 2 72 Oxitetracyclina 8 128 0 62 Gentamicina 63 13 60 5 6 51 Neomicina 13 27 96 34 19 8 Amminosidina 77 23 26 53 0 9 Apramicina 90 11 35 8 2 52 Tilmicosina 4 11 118 7 3 38 Tylosina 0 0 110 1 0 35 Cefalotina 4 15 75 Cefoperazone 50 1 0 MOLECOLA TESTATA GENE DI RESISTENZA ISOLATI CARATTERIZZATI DA UN FENOTIPO DI RESISTENZA ISOLATI POSITIVI ALLA PCR RISPETTO AL TOTALE DEI FENOTIPI RESISTENTI N. % 1999- 2001 2002- 2005 1999- 2001 2002- 2005 Trimethoprim- sulfamethoxazolo dhfrI 37 5 27,2 8,1 dhfrV 1 1 0,7 1,6 dhfrVII 37 10 27,2 16,1 dhfrIX 40 46 29,4 74,2 dhfrXIII 4 1 2,9 1,6 Sul 1 72 16 52,9 25,8 Sul 2 60 41 44,1 66,1 Gentamicina aac(3)-IV 35 52 25,7 83,9 aadB 10 6 7,4 9,7 aacC2 1 0 0,7 0 Neomicina aphA1 4 2 2,9 3,2 aphA2 6 6 4,4 9,7 aadB 0 0 0 0 Apramicina aac(3)-IV 0 0 0 0 Tab. n° 2 Tab. n° 1
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Valutazione della sensibilità in vitro agli antimicrobici, ricerca dei fattori di virulenza e di geni responsabili dell’antibiotico-resistenza in Escherichia coli enteropatogeni isolati da coniglio - PowerPoint PPT Presentation
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Valutazione della sensibilità in vitro agli antimicrobici, ricerca dei fattori di virulenza e di geni responsabili dell’antibiotico-resistenza in Escherichia coli enteropatogeni isolati da coniglio
Anna Giannina Perugini1, Anna Cerrone1, Fabrizio Agnoletti2, Lorella Barca1, Elena Mazzolini3, Giovanni Cattoli4, Vincenzo Caligiuri1, Mario Bartoli1, Federico Capuano1
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Via Salute 2, 80055 Portici (Na)2Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio di Treviso, Viale Brigata Treviso 13/A, 31100 Treviso, 3Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio di Udine, Via Della Roggia 100, 33030 Campoformido (UD)4Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Laboratorio di Virologia, Viale dell’Università 10, 35020 Legnaro (PD)
IntroduzioneLe infezioni da Escherichia coli enteropatogeni (EPEC) rappresentano una frequente causa di patologie gastro-intestinali nel coniglio. Tali patogeni sono in grado di indurre non solo specifiche lesioni intestinali, definite “attachment-and-effacement (A/E) lesion”, ma producono anche un caratteristico pattern di aderenza, definito ‘localized adherence’ (LA) (Adu-Bobie et al., 1998). Geni responsabili di LA e A/E sono stati localizzati in due regioni, definite ‘LEE region’ e EAF, all’interno delle quali, oltre a geni codificanti per sistemi di secrezione, è localizzato il gene dell’intimina (eae in LEE). A promuovere l’adesione alle cellule epiteliali intestinali del coniglio intervengono anche le fimbrie AF/R1 e AF/R2, descritte rispettivamente nel ceppo RDEC-1 (O’Hanley e Cantey, 1978) e negli isolati O103:H2 che non fermentano il ramnosio (Milon et al, 1990).Nonostante sia noto il meccanismo responsabile della patogenicità degli EPEC nel coniglio, i trattamenti per le enterocoliti da Escherichia risultano spesso inutili forse anche a causa della resistenza agli antimicrobici, in grado di favorire la sopravvivenza nonché la proliferazione di tali patogeni.In questo studio per la prima volta ceppi REPEC (Rabbit Enterophatogenic Escherichia coli), caratterizzati per la presenza dei geni di patogenicità eae, AF/R1 o AF/R2, sono stati analizzati sia per la sensibilità in vitro ad alcuni antimicrobici, comunemente usati in medicina veterinaria, in particolar modo nell’allevamento del coniglio da carne, sia per la presenza di alcuni dei determinanti genetici di resistenza agli antibatterici potenzialmente trasferibili ad altri patogeni.
BibliografiaAdu-Bobie J, Frankel g, Bain C, Goncalves AG, Tabulsi LR, Douce G, Knutton S and Dougan G, 1998. J. Clin Microbiol, 36 (3): 662-668. Bauer Enne V.I., Livermore D.M., Stephens P., Hall L.M.C., 2001. The Lancet, 357: 1325-1328. Karch H, Bohm H, Schmidt H, Gunzer F, Aleksic S and HeesemannJ., 1993. J. Clin. Microbiol., 31: 1201-1205; O’Hanley P, Cantey JR, 1978.Infect Immun, 21: 874-878. Milon A, Esslinger L, Camguilhem R, 1990. Infect Immun 58: 2690-2695. National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1999. Approved standards M7-A5: methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 5th ed. NCCLS, Wayne, Pa.
Materiale e metodiIsolamento198 ceppi di Escherichia coli sono stati isolati da conigli deceduti per enterocolite in Italia. I campioni, raccolti durante gli esami necroscopici, sono stati isolati su McConkey agar, incubato a 37° C per 24h. La caratterizzazione biochimica delle colonie identificate è stata realizzata mediante gallerie API 20E System (bioMerieux, Marcy l’Etoile, France).
Sensibilità agli antibioticiI saggi di sensibilità sono stati eseguiti mediante la tecnica di diffusione in agar (Bauer, 1996), secondo le procedure della National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).
PCRLa reazione a catena della polimerasi è stata utilizzata sia per la ricerca di alcuni fattori di patogenicità (eae; AF/R1 o AF/R2) ( Karch et al., 1993;Penteado et al., 2002) che di alcuni dei geni responsabili della resistenza: ai sulfamidici (sul1 e sul2) (Enne et al, 2001), al trimetoprim (dhfrI, dhfrV, dhfrVII, dhfrIX, dhfrXIII), alla gentamicina [aadB, aaC2, aac(3)-IV], alla neomicina (aphA1, aphA2 e aadB) e all’apramicina [aac(3)-IV] (Maynard et al., 2003).
RisultatiDei 198 ceppi analizzati per la presenza dei fattori di virulenza, 129 sono risultati positivi per eae (65.2%), 114 per AF/R2 (57.6%), 15 per AF/R1 (7.6%), questi ultimi isolati tutti dallo stesso allevamento.I risultati dei saggi di sensibilità agli antibiotici e delle PCR per la ricerca di geni associati alla resistenza ai farmaci sono schematizzati nelle tabelle 1 e 2.
ConclusioniSebbene sia stata analizzato solo un ridotto gruppo di geni associati alla resistenza ad alcuni antimicrobici, risulta evidente la presenza di alcuni di essi negli isolati analizzati. L’esistenza di geni in grado di garantire la resistenza a più farmaci, ovvero in grado di agire su molecole diverse [es. aac (3)-IV], può influenzare la “precocità” della comparsa dei fenomeni di resistenza, e incidere negativamente sull’efficacia delle eventuali associazioni impiegate in campo. Sebbene alcuni ceppi risultino sensibili ad alcuni farmaci, non presentano necessariamente i markers cercati (ad es. aadB), probabilmente perché sebbene conferiscano resistenza a più molecole della stessa famiglia (neomicina e gentamicina), sono solo una piccola rappresentanza del cluster di determinanti genetici in grado di conferire resistenza a diversi amminoglicosidi.I risultati ottenuti suggeriscono di estendere l’analisi dei geni di resistenza agli antimicrobici, ovvero di continuare il monitoraggio dei REPEC, non solo in funzione della loro nota patogenicità, ma anche in quanto potenziale serbatoio di geni di resistenza trasferibili ad altri organismi della microflora intestinale del coniglio.
MOLECOLE TESATE
ISOLAMENTOMENTO DEL CEPPO: PERIODO DI RIFERIMENTO
1999-2001 2002-2005
N. di ceppi analizzati
distribuiti secondo la loro risposta all’antibiotico
S I R S I R
trimethoprim-sulfamethoxazole (STX) 63 3 70 16 13 32
Enrofloxacina 87 21 8 15 12 26
Flumequina 75 37 24 5 18 26
Norfloxacin 94 1
Chinolone (Gen III) 2 9 1
Colistina solfato 48 66 22 54 3 2
Penicillina G 122 11
Amoxcyllina 62 3 30 38 4 8
Doxiciclina 5 5 85 3 2 72
Oxitetracyclina 8 128 0 62
Gentamicina 63 13 60 5 6 51
Neomicina 13 27 96 34 19 8
Amminosidina 77 23 26 53 0 9
Apramicina 90 11 35 8 2 52
Tilmicosina 4 11 118 7 3 38
Tylosina 0 0 110 1 0 35
Cefalotina 4 15 75
Cefoperazone 50 1 0
MOLECOLA TESTATA GENE DI RESISTENZA
ISOLATI CARATTERIZZATI DA
UN FENOTIPO DI RESISTENZA
ISOLATI POSITIVI ALLA PCR RISPETTO
AL TOTALE DEI FENOTIPI
RESISTENTI
N. %
1999-2001
2002-2005 1999-2001 2002-2005
Trimethoprim-sulfamethoxazolo
dhfrI 37 5 27,2 8,1
dhfrV 1 1 0,7 1,6
dhfrVII 37 10 27,2 16,1
dhfrIX 40 46 29,4 74,2
dhfrXIII 4 1 2,9 1,6
Sul 1 72 16 52,9 25,8
Sul 2 60 41 44,1 66,1
Gentamicinaaac(3)-IV 35 52 25,7 83,9
aadB 10 6 7,4 9,7
aacC2 1 0 0,7 0
Neomicina aphA1 4 2 2,9 3,2
aphA2 6 6 4,4 9,7
aadB 0 0 0 0
Apramicina aac(3)-IV 0 0 0 0
Tab. n° 2
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