Interferenza e vettori 27-X-06

Per reprimere l’attività genica : metodo definitivo = knock out di un gene,

metodo temporaneo : prima antimessaggeri, ora interferenza

L’interferenza è un sistema enzimatico complesso

L’antimessaggero ha un’azione meccanica (appaia il messaggero)

È un sistema fisiologico

Come si può fare interferenzaVediamo come si può dimostrare che esiste l’interferenza e che se si inibisce ricomincia l’attività enzimatica su cui abbiamo interferito

Si tratta di fare degli esperimenti che osservano il fenomeno e poi di dimostrare il meccanismo con cui si verifica

Per dimostrare che il meccanismo identificato è il responsabile effettivo dell’interferenza devo avere un modello in cui funziona l’interferenza e poi devo bloccare l’interferenza (in un punto del pathway) e ripristinare l’espressione bloccata dalla interferenza.

Espressione di emerald GFP B) Cells transfected with Lipofectamine™ 2000 (efficiency 50%) - 100% tracking of EmGFP and miRNA expression. -1° Hoechst nuclear stain After 48 hours, - cells stained with a red lamin stain, and monitored for GFP expression. -2° half of the cells express lamin protein -3° cells expressing EmGFP and lamin A/C stained are combined, - cells expressing GFP do not appear to have lamin A/C present, - cells stained red for lamin A/C do not appear to have any GFP expression. - This demonstrates that cells expressing EmGFP are also all greatly reduced in lamin expression due to the presence of the miRNA that is co-cistronically

expressed. Come è il costrutto ?vettore GFP+lamina siRNA

espressione di un micro RNA

Vettore per interferenza

L’interferenza avviene per effeto di un enzima “dicer” che serve come difesa da RNA virali (forse anche altro)

(emerald green fluorescent protein)

Sequenze di integrazione retrovirale

Come sarà il costrutto ?

Vettore per interferenza

L’interferenza = meccanismo enzimatico specifico di difesa da infezione di dsRNA, presente in quasi tutti gli org. superiori

(emerald green fluorescent protein)

Sequenze di integrazione retrovirale

se dobbiamo esprimere la GFP e inibire l’espressione di Lamin A/C

lamin A/C siRNAsmall interfereingmi = micro

Interference come difesaA brief history of RNAi: the silence of the genes.Sen GL, Blau HM.

Department of Molecular Pharmacology, Baxter Laboratory in Genetic Pharmacology, 269 Campus Dr., CCSR 4225A, Stanford University School of Medicine, Stanford, California 94305, USA. gsen@stanford.edu

The use of the RNA interference (RNAi) pathway to eliminate gene products has greatly facilitated the understanding of gene function. Behind this remarkable pathway is an intricate network of proteins that ensures the degradation of the target mRNA. In this review, we explore the history of RNAi as well as highlighting recent discoveries.

FASEB J. 2006 Jul;20(9):1293-9. PMID: 16816104 [PubMed - indexed for MEDLINE

1° paper plant cell (petunia) 1990; 2° Neurospora 1992;Sistema enzimatico Dicer 1998-2000

Dimostrazione tramite esperimenti di controllo

Dimostrazione: soppressione con antisenso RNA

l’interferenza è dal blocco con antimessaggero ?

Come lo dimostrereste ?

Un antimessaggero può legare il messaggero e bloccarneil funzionamento (va trasfettato nella cellula)

Piccoli RNA possono bloccare l’espressione di un gene

osservazione in piante (x cambiar colore alle petunie)

osservazione di silenziamento (quelling) in Neurospora crassa

Esperimenti tramite vettoriPer ogni esperimento un vettore con caratteristiche specifiche

tramite tecniche di DNA ricombinante e trasfezionivettori di controllo con e senza inserto

I exp. overexpression in petunia del gene “chalcone syntase” biosintesi antocianine - colore viola dei fiori

fiori binchi = repressione dell’espressione (‘90)II exp. Neurospora crassa (Romano e Macino) sequenze

omologhe di geni inibivano temporaneamente specificamente l’attività di molti geni (‘92)

III exp. Caenorabditis elegans sequenze senso ed antisenso inibiscono il gene par 1 (gene della partizione) (‘98)

IV exp. Verifica che è il dsRNA a innescare l’interferenza

Altre evidenze di RNAiGli esperimenti a singola elica di RNA erano contaminati da dsRNA

Mancavano i controlli giusti di purificazione dell’ RNA

Exp con singolo filamento senso o antisenso

10-100 volte minor efficienza rispetto a dsRNA

Ipotesi di un prodotto intermedio stabile

Exp in C.elegans mostrava interferenza nella II generazioneIsolamento di un piccolo RNA da 25 nt antisenso

Exp in cellule di Drosofila con firefly luciferase: interferenza con dsRNA 22-23nt con sporgenza libera di 2-3 nt. Si inibisce sia il gene esogeno che endogeno

Interferenza nei mammiferiNelle cellule di mammifero dsRNA lunghi inducono interferone e blocco della sintesi proteica (traduz.) - alternativa: prova con dsRNA corti

Ipotesi di funzionamento in 2 passaggi:1° taglio del dsRNA in piccoli frgm 22-23nt2° taglio del mRNA specifico

Exp. di centrifugazione per separare le due attività

nel surnatante resta solo attività di taglio del dsRNA

Ipotesi di attività ribonucleasica della famiglia delle Rnase-IIIExp. costrutti con epitopo tag T7 di fusione a RNAse (tipo 1-2-3) che funge da carrier, trasfezione in cellule S2 di Drosofila, immunoprecipitazione, 1 solo enzima che taglia dsRNA in frammenti di 21-23nt. L’ enzima viene chiamato DICER legato ad Rnase di tipo III.Mutante KO perde attività di interference. Omologhi di DICER in tutte le specie

Cosa è l’immunoprecipitazione

La tecnica di immunoprecipitazione la dovreste conoscere, però in poche parole:

Molti enzimi formano dei complessi oppure interagiscono con altri enzimi, proteine o DNA

immunoprecipitazione con uno degli enzimi del complesso da studiare

Si deve avere un buon anticorpo : non deve interagire col sito attivo che lega l’altro enzima

Viene fatto l’estratto cellulare e si fa reagire con l’anticorpo contro la proteina, la precipitazione dell’anticorpo con la proteina fa da carrier per le altre proteine legate

Immunoprecipitazione e artefattiin breve I

La tecnica ha molti rischi di carry-over

Come si può fare per non precipitare artefattiEvidenze incrociate con altre tecniche

Se la proteina che coprecipita è già nota è più facile dimostrare la sua identità con un anticorpo specificoInversione dell’esperimento = col 2° ab si ripesca il 1°enzima

Controlli con altri tipi di estratti e con condizioni diverse

Stressare le condizioni di legame per eliminare legami aspecifici

Per proteine nuove il rischio di vedere artefatti è più difficile da controllare

Imm.precipitazione con DNA* o RNAin breve II

Immunoprecipitazione del DNA legato a fattori di trascrizione

Anticorpo specifico (monoclonale, dovete sapere cosa è)

Non deve alterare il sito di legame al DNAhomeo boxzip domainzinc finger

Viene fissata la prot. al DNA precipitato e amplificato

Si deve conoscere proteina (Ab) e sito di legame (PCR)Verifica del legame in vitro o in vivo

*CHIP = chromosome immune-precipit.

Iterferenza exp in cellule HelaCellule epiteliali di carcinoma umano della cervice

Exp. trasfezione con siRNAs biotinilatoco-immunoprecipitazione: coprecipita compl. enzimaticopurificazione di 2 enzimi ≈100 kDafamiglia geni Argonauta (sviluppo Drosofila Ago1 e Ago2

interaz. con metab. RNA)

Solo Ago 2 ha la capacità di taglio, gli altri legano piccoli RNA

Topo transgenico per Ago2 non chiude il tubo neurale

Attività Rnase, sito attivo con motivo DDE (aspart. glutam.)Identico ad Ago2 - due domini PIWI e PAZ

sito PIWI taglia e PAZ lega mRNA (slicer activity)

Mutazioni al sito DDE non tagliano

Più attività e funzioni di un sistema complesso

Come viene scelta l’elica del dsRNA da processare ?quale elica lega RISC/Ago2 ? l’antisenso è meno stabile

Il complesso formato da Dicer-Ago2- siRNA con TRBP

Nuova evidenza che RISC è complessato ad rRNA 80S(controlla i messaggeri per la traduzione)

Negli oociti di Drosofila non c’è traduzione e nemmeno l’interferenza funziona

RISC avrebbe 2 attività come si libera la siRNA dal dsRNA ?

TRBP = HIV transactivating response RNA binding protein

RISC = RNA interference (gene)-silencing complex

Necessità di altro exp di conferma prossima diapo

Exp traduzione - interferenceSistema Iron = ferro

Le proteine regolatrici del ferro IRPs in assenza di ferro legano siti specifici di risposta al ferro che stanno nei mRNA dei geni di controllo Iron e bloccano la traduzione impedendo ai fattori di inizio di legare l’mRNA

Esperimento con reporter gene regolato con siti Iron

L’attività RISC non richiede traduzione di mRNARNA-induced gene-silencing complex (RISC)

siRNAs contro il gene reporter: era attivo sia in presenza che assenza di ferro, indipendentemente che l’mRNA fosse tradotto o meno

Vettore per dsRNA palindrome

Vettori per il silenziamento di geni espressi con metodo piu’ efficace di quello dell’RNA antisenso. Paddison et al. PNAS 5 Feb. 2002

Clonaggio con inserimento di elementi fiancheggianti LoxP del fago P1 che tramite l’enzima CRE (ricombinasi) se gli elementi sono in palindrome produce una inversione dell’inserto, se gli elementi sono in tandem fa excidere ed integrare se c’e’ un solo elemento

PGFP GFPZEO

rL L

Gene per la resistenza alla zeocina;ZEOr

GFPLe prime 500 bp codificanti di EGFP;

L Lox P;

P Promotore di citomegalovirus;

pcDNA3

In alternativa al primo vettore con GFP e lamina A/C costitutivo

L

PGFP GFPZEO r

L L

PGFP GFPL

Ricombinasi CRE

ZEO r

dsGFP

ZEO rCMV

CMV

funzione del vettore per interferenza

Exp DICER + GFPEnzima Dicer siRNA

(~ 21 - 20 nts)

dsRNA(~ 500 bp)

P19 EC cells: cellule con il vettore stabilmente integrato.

ds FF

ds Dicer

pGFP+

500ng dsRNA

pGFP+

no dsRNA

pGFP+

1000ng dsRNA

P19

GF

P H

arp

in

In vivo

siR

NA

mar

ker

Con

trol

P19

siRNA

Cellule trasfettate con pGFP e dsRNA di DICER o Firefly GFPDimostrazione che è DICER a mediare l’interferenza

(due negazioni affermano !)

L’interferenza contro la GFP viene bloccata bloccando DICER con interferenza. Exp. very elegant

2 modelli di interferenza:dicer TRBP

Ago2Ago2

TRBPCorpi P di degradazionedi mRNA

Dicer taglia il ds RNAlungo in siRNA

Formazione del complesso

Ago2 + TRBP Ago2

3’ finisce nei corpi P e Ago2 viene rilasciato di nuovo

5’ degradato da exonucleasi

Il lungo RNA a doppio filamento è degradato da DICER che recluta Ago2 e TRBP. Ago2 taglia il piccolo siRNA che poi si associa al mRNA, viene tagliato in due frammenti, l’exisoma digerisce il frgm 5’, il frgm 3’ entra nel corpo P e la degradazione con Xrn1* rilascia Ago2 che nel citoplasma ricomincia il ciclo e si riassocia ad un altro complesso mRNA

Modello 1

*Xrn1 =esonucleasi

modello di interferenza n.2mRNA si associa nei corpi P tramite RCK (elicase) che permettono ad AGO2 e RISC di trovare il bersaglio di ibridazione con il siRNA, dopo l’ibridazione con il bersaglio l’ mRNA è tagliato ed i frammenti degradati all’interno del corpo P

ribosomaInibizione della traduzione tramite RCK

Il ribosoma si

disassembla

DICER e TRBPDigeriscono il dsRNA in siRNA

Ago2

approfondimentoPLoS Biol. 2006 Jun 13;4(7):e210 [Epub ahead of print] Links Translation Repression in Human Cells by MicroRNA-Induced Gene Silencing Requires RCK/p54. Articolo disponibile o-l sulla biblioteca bio-medica di TVChu CY, Rana TM.

Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, Worcester, Massachusetts, United States of America.

RNA interference is triggered by double-stranded RNA that is processed into small interfering RNAs (siRNAs) by Dicer enzyme. Endogenously, RNA interference triggers are created from small noncoding RNAs called microRNAs (miRNAs). RNA-induced silencing complexes (RISC) in human cells can be programmed by exogenously introduced siRNA or endogenously expressed miRNA. siRNA-programmed RISC (siRISC) silences expression by cleaving a perfectly complementary target mRNA, whereas miRNA-induced silencing complexes (miRISC) inhibits translation by binding imperfectly matched sequences in the 3' UTR of target mRNA. Both RISCs contain Argonaute2 (Ago2), which catalyzes target mRNA cleavage by siRISC and localizes to cytoplasmic mRNA processing bodies (P-bodies). Here, we show that RCK/p54, a DEAD box helicase, interacts with argonaute proteins, Ago1 and Ago2, in affinity-purified active siRISC or miRISC from human cells; directly interacts with Ago1 and Ago2 in vivo, facilitates formation of P-bodies, and is a general repressor of translation. Disrupting P-bodies by depleting Lsm1 did not affect RCK/p54 interactions with argonaute proteins and its function in miRNA-mediated translation repression. Depletion of RCK/p54 disrupted P-bodies and dispersed Ago2 throughout the cytoplasm but did not significantly affect siRNA-mediated RNA functions of RISC. Depleting RCK/p54 released general, miRNA-induced, and let-7-mediated translational repression. Therefore, we propose that translation repression is mediated by miRISC via RCK/p54 and its specificity is dictated by the miRNA sequence binding multiple copies of miRISC to complementary 3' UTR sites in the target mRNA. These studies also suggest that translation suppression by miRISC does not require P-body structures, and location of miRISC to P-bodies is the consequence of translation repression.

conclusioni

Resta da capire se è valido il modello n.1 o n.2

Potrebbe venir proposto un altro modello alla luce di nuove evidenze che sconfessa quelli precedenti

“ del doman non v’è certezza ” L. da Vinci  L. il Magnifico A. Poliziano L. Pulci

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