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  • UNIVERSITDEGLISTUDIDIROMA

    TORVERGATA

    FACOLTADIMEDICINAECHIRURGIA

    DOTTORATODIRICERCAINNEUROSCIENZE

    XXIICICLO

    Effettidegliamminoacidiacatenaramificata(BCAA)

    sulleccitabilitdineuronicorticaliincolturaprimariae

    confrontoconilmodellomurinodiSclerosiLaterale

    Amiotrofica,G93A.

    LiviaCurcio

    A.A.2009/2010

    DocenteProf.CristinaZona

    Coordinatore:Prof.GiorgioBernardi

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    2

    Indice

    INDICE 2

    INTRODUZIONE 4

    1 LASCLEROSILATERALEAMIOTROFICA 4

    1.1 IpotesipatogenetichediSLA 71.1.1 SOD1(Cu/ZnSuperossidodismutasi) 81.1.2 Alterazionimitocondriali,vacuolizzazioneestressossidativo 121.1.3 Anormalitcitoscheletricheeaggregazioneproteica 131.1.4 MeccanismiintercellularinellapatogenesidellaSLA 141.1.5 Dannoeccitossico 151.1.6 IcanaliionicinellaSLA 181.1.7 Fattoridirischioambientali 22

    1.2 AttivitfisicaeinsorgenzadiSLA 25

    1.3 IpotesidiSLAneicalciatoriinItalia 27

    1.4 Integrazionealimentaredurantelattivitsportiva 30

    1.5 Amminoacidiacatenaramificata 30

    1.6 MetabolismoefabbisognoumanodiBCAA 32

    1.7 GliamminoacidiacatenaramificatanelSNCedeffettosuimeccanismidifaticacentrale 35

    1.8 PossibileimplicazionedeiBCAAnellaSLA 39

    2 ILCOMPLESSOMTOR(MAMMALIANTARGETOFRAPAMYCIN) 42

    3 ICANALIIONICIVOLTAGGIODIPENDENTIELATRASMISSIONESINAPTICA 50

    3.1 Genesiionicadeipotenzialidazione 51

    3.2 Icanaliionicidelsodiovoltaggiodipendenti 51

    3.3 IcanaliionicidelcalcioVoltaggiodipendenti 56

    SCOPODELLOSTUDIO 60

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    3

    4 MATERIALIEMETODI 63

    4.1 Colturecellulari 63

    4.2 Trattamentodellecellulecorticali 67

    4.3 Registrazioneelettrofisiologiche 684.3.1 LatecnicadelPatchClamp 684.3.2 Configurazioni 704.3.3 CurrentclampeVoltageclamp 714.3.4 Leproprietelettrichedellamembranacellulare 734.3.5 Elettrodiesoluzioni 744.3.6 Apparatosperimentale 78

    4.4 Analisideidati 79

    5 RISULTATI 81

    5.1 EffettodeiBCAAsulleproprietpassiveeattivedineuronicorticali 81

    5.2 SpecificitdelleffettodiBCAA 84

    5.3 EffettodellaRapamicina 87

    5.4 ConfrontoconilmodelloG93A 90

    5.5 EffettodellesposizionediBCAAsullafunzionalitdeicanaliionicivoltaggiodipendenti 925.5.1 StudiodeicanaliionicivoltaggiodipendentidelSodio:correntetransienteepersistente 925.5.2 Caratterizzazionefarmacologicadeicanaliionicidelcalciovoltaggiodipendenti 96

    6 DISCUSSIONE 100

    7 BIBLIOGRAFIA 106

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    4

    Introduzione

    1 LaSclerosiLateraleAmiotroficaLaSclerosiLateraleAmiotrofica(SLA)unamalattiaprogressivachecolpisce

    imotoneuroni,cio lecellulenervosesiaa livellocorticale (Imotoneurone)

    chedelmidollospinale (IImotoneurone)checomandano ilmovimentodei

    muscoli. La morte dei motoneuroni altera la funzionalit del muscolo

    scheletrico, causando paralisi e atrofia muscolare. I disturbi variano a

    secondadellapartedelcorpocolpita.Spessolamancanzadiforzailprimo

    sintomochepumanifestarsiconaffaticamento,debolezzadiunamano,di

    una gamba (ipostenia) o come debolezza deimuscoli che permettono di

    parlare(disartria)odideglutire(disfagia).

    Lesistenzadiunasindromecaratterizzatadaundeficitmotorioprogressivo

    degliartiassociatoadatrofiamuscolarefuconfermatanellacomunitmedica

    nella met del diciannovesimo secolo. Il Dr. Franois Aran pubblic la

    descrizionedellasindromenel1848eipotizzcheavesseradicineurologiche.

    Dopodiluiparecchimedicicontinuaronolostudiodellamalattiaconosciuta

    ormai comeatrofiamuscolareprogressiva. IlDr. JeanMartinCharcotnel

    1874evidenzidelledifferenzerispettoallamalattiastudiatadaAran,siaper

    laprecocecompromissionebulbarecheperlapresenzadispasticit.

    TalequadroclinicovennedenominatoSclerosiLateraleAmiotrofica(SLA).

    LaSLAancheconosciutacon ilnomedimalattiadiLouGehrig.Questo

    personaggiofuungrandecampionedibaseballdeiNewYorkYankeeschesi

    ammaldiquestamalattianel1939(Brown,1997).

    Il termine di sclerosi laterale si riferisce alla consistenza dura delmidollo

    spinale che si riscontra allesame autopticodeipazienti e che dovuta alla

    proliferazione di astrociti ed alla presenza di cicatrici fibrose nelle colonne

    laterali del midollo spinale. Queste fibrosit sono lespressione

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    dellalterazione dei tratti corticospinali in cui decorrono gli assoni dei

    motoneuroni superiori cheprovengonodalla cortecciamotoria edal tronco

    dellencefalo e che terminano nelle corna anteriori del midollo spinale, a

    ridossodeimotoneuroni inferiori.Iltermineamiotroficasinonimodiatrofia

    muscolareneurogenica,asottolineare lorigineneurologicadellaparalisiche

    caratterizzalamalattia(Fig.1).

    Fig.1VienervosecherisultanodanneggiatenellaSLA(daRowland,2001)

    Sebbene la degenerazione dei motoneuroni (Fig. 2) sia progressiva dalla

    corteccia, al tronco encefalico ed alle corna anteriori, alcuni motoneuroni

    restano indenni, inparticolarequellideimuscolioculariequellideputatial

    controllovolontariodeglisfinterivescicali(Kandeletal.,1991).

    Iprimisintomivarianodaun individuoallaltroma ingenereconsistono in

    alterazionimotorie, affaticamentodellebraccia edellegambe,difficoltnel

    parlare, crampimuscolari. Lemani sono colpite per prime rendendo cos

    difficili le normali attivit quotidiane e, soprattutto, lesecuzione dei

    movimentifinicomescrivereamacchina,afferrareunapalla,contaremonete.

    Con ilprogrediredellamalattia sihaparalisi completadegli arti ediventa

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    difficile deglutire, masticare e parlare. La paralisi dei muscoli respiratori

    rende infinenecessaria laventilazioneassistita ed una causa frequentedi

    morte.Lanotevoleselettivitdellamorteneuronalefainmodochevengano

    risparmiate le componenti sensitive e cerebrali necessarie alle funzioni

    cognitive.

    Fig.2Differenzatrailmuscoloeilneuronespinaleincondizioninormaliedurantelapatologia.Progressivamentelafibranervosadegeneraeiltonomuscolarediminuisce.

    Questo comporta che il malato assista in piena lucidit alla perdita

    progressiva delle proprie capacit motorie (Harrison et al., 1995). E stata

    tuttavia riscontrata demenza frontotemporale, in circa il 23% dei pazienti,

    caratterizzata da profondi cambi della personalit.Questo fenomeno pi

    comune traquelli conuna storia familiaredidemenza e sembra esserepi

    comunediquantopensatoinprecedenza(Brown,1997).

    LaSLAunapatologiachecolpiscepifrequentementegliindividuidisesso

    maschileecheinsorgeabitualmentetrai50ei60anni.Lincidenzaannuale

    di 1,7 casi per 100.000 abitanti (Worms, 2001). Lesito della SLA sempre

    fatale, in un periodomedio di 23 anni. Il 90% dei casi appartengono alla

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    formasporadicadellamalattia(sSLA).Ilrestante10%deicasiappartengono

    alla forma familiare (fSLA) che si trasmette con modalit autosomica

    dominante ad alta penetranza o con penetranza ed espressivit variabili.

    Clinicamente la fSLA simile alla forma sporadicama il debutto agli arti

    inferioripi frequentee ildeterioramentomentalepresentenel15%dei

    casi (Fazio e Loeb, 1999). Esiste anche una rara forma giovanile che si

    trasmette con modalit autosomica recessiva. Lesordio della malattia si

    manifestainetinfantile(etmedia35anni)esembraessereprovocatadalla

    mutazione del gene ALS2 che codifica per una porteina importante nella

    formazionedelcitoscheletro.Lasopravvivenzadicirca15anni(Rabinetal.,

    1999).

    1.1 IpotesipatogenetichediSLA

    Leziologia e la patogenesi della SLA sono attualmente in gran parte

    sconosciute.Essavieneconsiderataunamalattiadegenerativamultifattoriale,

    nella quale lamorte cellulare conseguente alla complessa interazione di

    diversecomponenti, lacui importanzapuvariareneidifferentisottogruppi

    dipazienti (Shaw andEggett, 2000).Gli attuali studimolecolari sulla SLA,

    infatti, focalizzano limportanzadei fattori genetici (MajoorKrakauer et al.,

    2003), in associazione con fattori ambientali (traumi, attivit fisica intensa,

    agenti chimici, shock elettrici, metalli pesanti, agenti infettivi etc.)

    nellattivazionedelprocessopatologico(Cozzolinoetal.,2008).

    Inparticolaretra ifattorigenetici,sonostate identificatecirca135mutazioni

    del gene che codifica per lenzima rame/zinco superossido dismutasi (SOD1),

    (SorianiandDesnuelle,2009),lequalipotrebberoinnescarediversifenomeni

    osservati nella patologia come: stress ossidativo, tossicit da glutammato,

    autoimmunit,aggregatiproteici(inclusioni),disorganizzazionedeifilamenti

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

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    intermedi, modificazioni del sistema di trasporto assonale anterogrado e

    retrogrado,attivazionedellamicrogliae interazionecon lecelluleneuronali,

    infiammazione e deregolazione dei fattori di crescita. Infine sono stati

    riscontratiaumentidelcalciointracellulareeattivazionedellevieapoptotiche

    comeulteriorimeccanismi coinvoltinellaneurodegenerazioneosservatanei

    pazientiSLA.

    1.1.1 SOD1(Cu/ZnSuperossidodismutasi)

    Gli studi sulletiologia della SLA hanno portato negli anni novanta

    allidentificazionediunamutazionegeneticaacaricodellenzima rame/zinco

    superossidodismutasi,riscontratanel20%deipazientiaffettidafSLA(Rosen

    etal.,1993)eoccasionalmentedapazientisSLA (Orrell,2000).La rame/zinco

    superossido dismutasi, prodotto del gene sod1, il principale enzima

    antiossidante localizzato prevalentemente nel citosol, nel nucleo, nella

    membrana mitocondriale degli eucarioti e nello spazio periplasmatico dei

    procarioti. Negli eucarioti esiste anche unaltra superossido dismutasi,

    caratterizzata da un atomo di manganese, localizzata nei mitocondri e

    prodottadalgenesod2.

    Ilgenesod1localizzatosulcromosoma21,consistedi5esoniecodificaper

    unacatenapeptidicadi153amminoacidi(16KDa).Lenzimaeucarioticoun

    omodimero di 32 kDa, con una sequenza altamente conservata e

    caratterizzato da siti di legame per rame e zinco e da ponti disolfuro in

    ognunadelleduesubunit(ValentineandHart,2003)(Fig.3).

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

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    Fig.3StrutturacristallinadellegamedimericodiSOD1umano.Gliionidirameezincosonomostratirispettivamentecomesferebluearancione.Illoopdizincocoloratoinarancione.Illoopelettrostatico

    inverde(daValentineS.etal,2005)

    Questo enzima catalizza la dismutazione del superossido (O2), prodotto

    principalmentepererroridurantelafosforilazioneossidativamitocondriale,e

    produce perossido didrogeno (H2O2) e acqua (H2O) riducendo i livelli di

    superossidoelimitando,quindi,lostressossidativo.Lareazionecatalizzata

    induepassaggiasimmetricitramiteunatomodiramechealternativamente

    ridottoeossidatodalsuperossido.

    LaSOD1largamenteespressanelsistemanervosocentraledeimammiferie

    rappresentacirca l1%di tutte leproteinedelcervello.Edifficilericondurre

    lespressione ubiquitaria di questo enzima alla degenerazione selettiva dei

    motoneuroni. Questi ultimi, normalmente, presentano un contenuto

    notevolmente elevato di proteina SOD1 rispetto a tutte le altre cellule del

    sistema nervoso (Shaw and Eggett, 2000). La localizzazione

    immunoistochimicadella SOD1 neimotoneuroni rivela la suapresenzanel

    corpo cellulare e nei processi assonali che si estendono verso la giunzione

    neuromuscolare (Pardoetal.,1995).Leprime ricercheeffettuate sul sangue

    deipazientiSLAsuggerivanounariduzionedellattivitdiquestoenzimaesi

    ritenevaquindi chequesta fosse la causadellamalattia (Rosenetal.,1993).

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

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    Successivi studi hanno per smentito questa ipotesi. Lemutazioni a carico

    della SOD1 determinerebbero lacquisizione di una o pi funzioni tossiche

    (gainoffunction)acaricodellenzima,piuttostocheunasemplicediminuzione

    della capacit di scavenging dello ione superossido (Cudkowicz et al.,

    1997). Infatti, tuttora ilmodello sperimentaledi SLApi simile alla forma

    umana familiare epiutilizzato il topo transgenicoG93A (Fig. 4), in cui

    lenzimaSOD1presentaunamutazionepuntiformeGlicina93Alaninapurmantenendo elevati i livelli di attivit enzimatica (Gurney et al., 1994). In

    questomodellosiriscontraunaumentodella funzioneperossidasicaconun

    conseguenteaumentodellaformazionediradicali liberirapidamenerispetto

    allaproteinawildtype.

    Fig.4FenotipodelmodelloanimaledifSLA,G93A(destra)allafinedellamalattia(circa4mesiemezzo),rispettoaltoponontransgenicowildtype(sinistra).Siosservanoevidentisegniallezampe

    posteriori(frecciarossa)eperditadeltonomuscolare(frecciabianca).

    Questo dato stato confermato anche da altri studi condotti su topi

    transgenicichesviluppavanolaSLA.Questitopiesprimevanoaltredifferenti

    mutazioni del gene sod1 le quali causavano unattivit enzimatica SOD1

    uguale o superiore alla condizione wildtype (Wong et al., 1995) o non

    producevano alcuna attivit enzimatica (Bruijn et al., 1997). Infine stato

    dimostrato che topi privi dellenzima SOD1 non presentavano la

    degenerazionedeimotoneuroni(Reaumeetal.,1996).Daquestidiversilavori

    risultaquindichediversemutazioniacaricodellenzimaSOD1determinano

    lacquisizioneda partedi questo enzima dipropriet tossiche, responsabili

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    11

    dellinsorgenza della SLA, indipendenti dal livello di attivit dellenzima

    stesso (Fig.5) (Cleveland,1999).Lemutazionia caricodiquestogene sono

    principalmentesostituzionidiamminoacidi.Inizialmentesieraipotizzatoche

    tutte le mutazioni fossero localizzate sullasse principale del dimero della

    SOD1ma gli studi successivi hanno evidenziato una distribuzione casuale

    dellemutazioninellastrutturaprimariaeterziariadellenzima.Tremutazioni

    alterano uno dei quattro residui che coordinano il rame, e almeno sette

    causano modificazioni dello schema di lettura degli esoni (splicing),

    determinandoiltagliodegliultimiventiotrentaamminoacidi(Clevelandand

    Rothstein,2001).La relazione tra lemutazionidelgeneSOD1e laSLAnon

    sonoancorachiare.

    NormalActivityofSuperoxideDismutase1SOD1Cu2++O2(SOD1Cu++O2

    SOD1Cu++O2(SOD1Cu2++H2O2

    GenerationofHydroxylRadicalsSOD1Cu2++H2O2(SOD1Cu++O2+2H+SOD1Cu++H2O2(SOD1Cu2++OH+OH

    NitrationofTyrosine

    SOD1Cu2++ONOOSOD1CuO....NO2+SOD1CuO....NO2++TyrSOD1Cu2++OH+NO2Tyr

    Fig.5Reazioniossidativemediatedallasuperossidodismutase(SOD1).LaSOD1normalmentecatalizzalaconversiondianionisuperossido(O2)tossiciperlacellulainperossidodidrogenoH2O2(inalto).LemutazioniacaricodelgenechecodificalaSOD1possonorevertirequestareazioneportandoallaformazionedelradicaletossicoidrossileOH(alcentro)o

    utilizzarealtrisubstratireattivicomeilperossinitritoONOO,causandocoslanitrazioneanomaladeiresiduiditirosinanelleproteine(inbasso).

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

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    DiversesonoleipotesichepossonocausarelaSLA,alcunediquestesaranno

    diseguitoanalizzate.

    1.1.2 Alterazionimitocondriali,vacuolizzazioneestressossidativo

    Studi recenti hanno evidenziato che i mitocondri, che sono la centrale

    energeticadellacellula,sianofraibersagliprecocideldannoaimotoneuroni.

    NeipazientieneimodellisperimentalidiSLA, ladisfunzionemitocondriale

    siosservaprecocemente epotrebbe essere la causadelladegenerazionedei

    motoneuroni, e quindi della paralisi dei pazienti (Beal, 2005). Imitocondri

    alterati e i vacuoli sono stati per lo pi osservati nei dendriti di diverso

    calibro,neicorpicellularieinalcuniassonideineuronidellecornaanteriori

    (Bendottietal.,2001).Imitocondripotrebberoessereiprimisitidanneggiati

    nei topi G93A. Lalterata capacit metalbinding porta allaccumulo nello

    spaziointermembranadiionirame(OkadoMatsumotoandFridovich,2002),

    oppureprovoca lacatalisidireazionicon laproduzionedimolecolereattive

    chedanneggianoimitocondri.Alternativamente,lealterazionimitocondriali

    potrebbero essere il risultato di cambiamenti nella permeabilit

    mitocondriale, risultanti da uno scorretto funzionamento di un canale

    voltaggiodipendente permeabile ai cationi, il MPTP (Mitochondrial

    PermeabilityTransitionPore).Ilmalfunzionamentodiquestocanalepotrebbe

    essere indotto da un eccessivo aumento intracellulare di calcio o di agenti

    ossidanticomeiROS(ReactiveOxygenSpecies)(Carrietal.,1997,Liuetal.,

    1999) ediglutammato.LaSOD1mutata infatti, agendo comeperossidasi e

    convertendoilperossidodidrogenoinradicalitossicidiverrebbeunafontedi

    radicali liberi. Il danno ossidativopotrebbe essere lultima via comune che

    determina la morte del motoneurone come conseguenza di diversi

    meccanismieziopatogenetici.

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

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    1.1.3 Anormalitcitoscheletricheeaggregazioneproteica

    I neurofilamenti sono proteine composte da tre monomeri: la subunit

    leggera(NFL),lasubunitmedia(NFM)equellapesante(NFH)(Julien,1999).

    Nei topiG93A ineurofilamenti fosforilati si localizzanoneicorpicellularie

    negli assoni prossimali dei motoneuroni (Tortarolo et al., 2003) e quando

    diventano iperfosforilati, il loro trasporto pu non essere funzionale, e ci

    portaal loroaccumulo (Shibataetal.,2001).Si ritiene chequestoaccumulo

    possa essere originato dallalterata fosforilazione proteica prodotta dalle

    chinasi. Nel midollo spinale di topi G93A, infatti, stato rilevato un

    progressivo accumulo di p38MAPK (un componente della famiglia serin

    treonin chinasiMAPK), che procede parallelamente alla degenerazione dei

    motoneuroni. p38MAPK attivato sia da un aumento del livello di

    glutammatoextracellulare,siadallapresenzadicitochinepro infiammatorie

    (Tortaroloetal.,2003).

    Nella fase dimalattia conclamata, imotoneuroni delle corna anteriori del

    midolloappaionoatroficieridottidinumero(Woodetal.,2003).Leinclusioni

    citoplasmaticheubiquitinate risultano esserepositiveallimmunoistochimica

    perglianticorpiantiSOD1,localizzatenelcorpocellulareenegliassoni,che

    appaiono rigonfi. Studi ultrastrutturali mostrano la presenza in esse di

    neurofilamentiassociatiafibrilledimaggiorspessoreeappaionomoltosimili

    aicorpidiLewy,ritrovatiinpazientiSLA.Latossicitassociataallaccumulo

    di aggregati proteici intracellulari sta emergendo come una dellemaggiori

    ipotesipatogenetichenellemalattiedeimotoneuroniepi ingeneralenella

    neurodegenerazione(ClevelandandRothstein,2001).

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    14

    1.1.4 MeccanismiintercellularinellapatogenesidellaSLA

    Crescentievidenze indicanoche lamortedeineuroninonunprocessoche

    coinvolgeesclusivamentequestecellule,macontuttaprobabilitilrisultato

    di una complessa interazione con le cellule ad essi adiacenti, per lo pi

    astrocitiemicroglia.Asostegnodiquestipotesiilfattocheitopitransgenici

    cheesprimonolaSOD1mutataesclusivamenteneimotoneuroni,osolonegli

    astrociti,nonsonoingradodiinnescareunprocessopatologicocomequello

    osservatoquandolenzimamutatoespressoinmodoubiquitario(Boilleeet

    al.,2006,Raibonetal.,2008).

    Gliastrocitie lamicroglia,anchesenonmorfologicamentealteratinellafase

    precocedellamalattia,sembranoesseringradodiliberarenelmicroambiente

    intornoaimotoneuroniunaseriedi fattorineurotossicichecomprendono le

    citochine,ilglutammatoelossidonitrico(Raibonetal.,2008).Inparticolare,

    lespressione di TNF, una citochina principalmente secreta da astrociti e

    microglia nel sistema nervoso centrale (SNC), edel suo recettore, risultano

    notevolmenteaumentatinelmidollospinaleditopiG93Aprimadellaperdita

    deimotoneuroniedellareattivitgliale(Boilleeetal.,2006).

    IlTNFhanelSNCdiversieffetti,quali lalterazionedei livellidi fattoridi

    crescita e di altre citochine, del glutammato, dei recettori AMPA, della

    periferinaediunampiagammadisecondimessaggeriintracellulariqualila

    p38MAPKe lOssidonitrico (NO). IlTNFcontribuisce inoltrealcontrollo

    delle risposte immunitarie e recentemente stato riportato che limmunit

    indottadaripetute iniezionidi liposaccaridesia lacausadiunasignificativa

    anticipazione dellamalattia nei topi G93A (Nguyen et al., 2004). LNO, il

    glutammato e i ROS rappresentano dei fattori intercellulari fisiologici

    importantinel crosstalk tra cellule glialieneuroni,ma in certe condizioni

    possono diventare dannosi per le cellule pi vulnerabili, ad esempio i

    motoneuroni.Essi, inoltre,possonocontribuireallapropagazionedeldanno

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

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    neuronale.Un sostegno a questipotesiderivada studi effettuati su culture

    miste di motoneuroni e astrociti che dimostrano che i ROS prodotti nei

    motoneuroni, in risposta ad un insulto di tipo eccitotossico, inducono un

    danno ossidativo del trasportatore del glutammato negli astrociti adiacenti

    (Rao and Weiss, 2004). Questo amplificherebbe lo stress eccitotossico dei

    motoneuroni risultando in un circolo vizioso, determinante per la

    progressione della malattia. Lipotesi di un crosstalk tra cellule gliali e

    motoneuroni (VanDenBosch andRobberecht, 2008) emerge anchedauno

    studio recente su topi transgenici chimerici tra SOD1mutata e SOD1wild

    type,neiqualistatodimostratochelaSOD1mutataincellulenonneuronali

    cocoltivate con motoneuroni privi della proteina mutata, in grado di

    indurre in questi ultimi un continuo accumulo intracellulare di proteine

    aberranti ubiquitinate sino a portare alla formazione delle inclusioni

    filamentoseesferoidalitipichedellaSLA(Clementetal.,2003,Jaarsmaetal.,

    2008)

    1.1.5 Dannoeccitossico

    LeccitossicitdovutoadaccumulodiLglutammatoedialtresostanzesimili,

    un processo patogenetico in seguito al quale la cellula nervosa risulta

    fortementedanneggiata(Struzynska,2009).Negliultimiannistatoproposto

    che la SLA non sia una patologia isolata dei motoneuroni ma che sia

    conseguenteadalterazionidelleinterazionitraimotoneuronielecircostanti

    cellulegliali.Unmeccanismo ritenuto importanteper laSLA sembraessere

    leccitotossicit causata da una eccessiva attivazione dei recettori per il

    glutammato(Coronaetal.,2007).

    Ilconcettodieccitossicitstato introdottoda JohnOlney ilquale ladefin

    come un fenomeno in cui lazione eccitatoria del glutammato viene

    trasformata inunprocessoneuropatologicochepu rapidamenteuccidere i

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

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    neuroni del SNC (Olney, 1978). Il fenomeno viene di solito attribuito al

    glutammatomapuessereindottodamoltialtriamminoacidiendogeniquali

    lacidoaspartico, lacidoomocisteico e lacidoquisqualico (Lodge,1988).Le

    cause principali di una eccessiva attivazione dei recettori postsinaptici

    glutamatergici possono derivare sia da una eccessiva produzione del

    glutammato, sia da un suo ridotto assorbimento ma non possono essere

    esclusi altri fattori quali la localizzazione e le propriet molecolari dei

    recettori, lattivitdi altri recettori canali emeccanismi intracellulariavalle

    dellattivazionerecettoriale.

    Il glutammato il principale neurotrasmettitore eccitatorio del sistema

    nervosocentraledeivertebrati.Agiscesurecettorimetabotropici,accoppiatia

    sistemidisecondimessaggeriattraversoproteineG,esurecettoriionotropici,

    canali ioniciattivatidallinterazionecon ilglutammatoocon i suoiagonisti

    quali lAMPA (acido amino3idrossi5metil4isoxazolepropionico), il

    kainatoelNMDA(NmetilDaspartato).

    I livelli extracellulari di glutammato sono finemente regolati da proteine

    transmembrana che hanno la funzione di trasportatore del glutammato.Ci

    sonodiverse classidi trasportatori sia suineuroni, sia sugli astrocitima la

    maggior parte del riassorbimento del glutammato sembra essere mediato

    dagliastrociti(AndersonandSwanson,2000)(Fig.6).

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    17

    Fig.6Neurotrasmissioneglutammatergicaecascataapoptotica.LarrivodiunpotenzialedazioneinduceuninflussodiCalciochecausalafusionedellevescicolerilasciantiglutammatonellafessurasinaptica.SullamembranadellacellulapostsinapticasiattivanoirecettoriAMPAcheinduconouninflussodisodioeladepolarizzazionedellamembrana.IlbloccofisiologicodeirecettoriNMDAdapartedelloioneMagnesiovienerimossoediconseguenzasihaunentratadiCalcioallinternodellacellulapostsinaptica.Ilglutammatoineccessochenormalmentevienerimossodaspecificheproteinelocalizzatesianegliastrociti(GLT1eGLAST)cheneineuroni(EAAC1),vienemetabolizzatoaglutamminanellecelluleglialiperazionedellaglutamminasintetasi(GS)ericaptatodaineuroni.Unalterazionedelturnoverdelglutammatoinduceunaccumulodiquestoneurotrasmettitoreeconseguentementeuneccitotossiciteprobabilemortecellulare.Ilcalciointracellulareineccesso

    inducelattivazionedidiversienzimielaproduzionediROScondannoalmitocondrio,ossidazionedilipidi,proteineeDNA.

    Il trasportatoreglialemurinoGLT1 (ratglialglutamate transporter)e ilsuo

    equivalenteumanoEAAT2 (excitatory amino acid transporter 2) sono stati

    ritenuti particolarmente interessanti riguardo la SLA (Rothstein, 1995). Il

    trasporto di glutammato pu essere alterato, ad esempio, per una perdita

    delle proteine responsabili del trasporto. In pazienti con SLA allo stadio

    terminale,coscomeneitopitransgeniciSOD1,sihaunariduzionedellivello

    deitrasportatori(Bruijnetal.,1997).Studidiimmunoblottingdimostrano,in

    pazientiaffettidaSLA,unasostanzialeperditadeltrasportatoreglialeEAAT

    2siaa livellocorticalechemidollare(Linetal.,1998).Contemporaneamente

    per,altreindaginibiomolecolari,qualiadesempiolibridazioneinsitu,pur

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    18

    confermando la diminuizione di EAAT2 a livello delmidollo, non hanno

    riscontrato nessuna variazione a livello della cortecciamotoria (Shaw and

    Eggett, 2000). comunque chiaro che il trasporto del glutammato pu

    svolgere un ruolo attivo nella morte neuronale, mediando fenomeni di

    eccitotossicit diretta. stato anche dimostrato che la sovraespressione di

    EAAT2svolgeunruoloneuroprotettivoinunmodellomurinodiSLA.Infatti

    topi doppi transgenici EAAT2/G93A, ottenuti incrociando topi che

    sovraesprimono EAAT2 con topi che sovraesprimono la SOD1 umana

    mutata (G93A), sono caratterizzati da un ritardo nellinizio e nella

    progressionedellamalattia(Guoetal.,2003).

    Altra possibile disfunzione del trasporto del glutammato pu derivare da

    unalterazione funzionale dei trasportatori come diretta conseguenza di un

    danno ossidativo, dalmomento che i trasportatori sono sottoposti ad una

    regolazione da parte degli ossidanti (Trotti et al., 2001). Rao e Weiss

    suggeriscono poi che leccitotossicit provochi nei motoneuroni una

    produzionediROS chepotrebbedanneggiare i trasportatoridiglutammato

    degli astrociti (Rao and Weiss, 2004). Questa ipotesi si basa, tra laltro,

    sullelevataconcentrazionedeltrasportatoreEAAT2,danneggiatoneipazienti

    SLA, che si trova nei processi degli astrociti a diretto contatto con i

    motoneuroni(Guoetal.,2003).

    1.1.6 IcanaliionicinellaSLA

    Le alterazionidei trasportatoridelglutammatoportano adun accumulodi

    questo neurotrasmettitori nello spazio extracellulare. Questo evento

    rappresenta una delle cause del fenomeno delleccitotossicit da

    gluatammato (Heath and Shaw, 2002). Durante questo processo si assiste

    primadi tuttoadun ingressodi ionisodioecloro,accompagnatidaacqua,

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    19

    come risultato della depolarizzazione e quindi ad un rigonfiamento del

    neuronechepuessere interrottocon larimozionedellagonista.Durante la

    seconda fase, siverificaun influssodicalcionelneuroneattraverso icanali

    voltaggiodipendenti (Choi,1988), idei recettoriNMDAe i recettoriAMPA

    (HeathandShaw,2002).

    Latossicitpuinoltreessereuneventosecondariochesiverificadopoaltri

    eventi patologici. La causa primaria pu essere una compromissione del

    bilancioenergeticodelneurone.SihaquindiunaridottaproduzionediATPe

    unmalfunzionamentodellapompaNa+/K+ATPasiconconseguenteriduzione

    del potenziale di membrana. In seguito a questa riduzione si ha una

    iperattivazione dei recettori NMDA che normalmente sono bloccati dal

    magnesio.Lecellulerisultanocosdepolarizzateancheabasseconcentrazioni

    diglutammato(Ludolphetal.,2000).

    IrecettoriAMPAsonodeicomplessiproteicicostituitidavariecombinazioni

    di 4 subunit (GluR14), che vanno a costituire un canale permeabile ai

    cationi. La subunitGluR2 legata alla permeabilit di questo recettore al

    Ca2+.LamancanzadiGluR2determinainfattilaformazionedirecettoricanali

    AMPA con alta permeabilit al calcio.Queste propriet della GluR2 sono

    attribuibiliallapresenzadiunaargininaneldominiodellasubunitcoinvolto

    nella formazionedelporo ionico,alpostodiunaglutammina, che invece

    tipicadellealtresubunitdellAMPA(Humeetal.,1991).statopropostoche

    laselettivavulnerabilitdeimotoneuronipotessederivaredallapresenzadi

    recettori altamente permeabili al calcio (BarPeled et al., 1999) e, quindi,

    dallassenza o dalla diminuzione di espressione della subunit GluR2. A

    supporto di queste ipotesi stata dimostrata la presenza di recettori

    permeabili al calcio in motoneuroni in coltura (Carriedo et al., 1996).

    Applicando tecniche di RTPCR (ReverseTranscriptase Polymerase Chain

    Reaction)alcunilavorihannoinveceriportatochenonvialcunaalterazione

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    20

    nellespressione della subunit GluR2 in condizioni di controllo, SOD1 e

    G93A (Spallonietal.,2004).Risulta invecesignificativaunavariazionenella

    frequenzadiespressionedelle subunitGluR3eGluR4.Queste sono infatti

    notevolmente superiori nella popolazione G93A rispetto ai due controlli,

    murinoetransgenico(Spallonietal.,2004).

    In condizioni normali esiste una fine regolazione della concentrazione

    intracellularedicalciolibero,chemantieneisuoilivellialdisottodi0,1M

    (CasellaeTaglietti,1996).Come conseguenzadiuna eccessiva stimolazione

    deirecettoridelglutammato,siverificaunadestabilizzazionedellaomeostasi

    delcalciointracellulare,inseguitoallaqualesideterminalattivazionediuna

    cascatadieventibiochimicicitotossicichevedecoinvoltienzimiquali lipasi,

    fosfolipasi,endonucleasi,ossidonitricosintetasi,proteinachinasiCexantina

    ossidasi.Questiprocessipossonodanneggiareilneuronesiadirettamenteche

    attraversolaformazionediradicaliliberi(Rothstein,1995).

    Per comprenderemeglio il ruolodei recettoriAMPAnellapatogenesidella

    SLAsonostaticondottideglistudielettrofisiologicisumotoneuronispinaliin

    colturaprimaria,utilizzandounmodellomurinodifSLA.Questistudihanno

    evidenziatoneimotoneuroniG93Adellealterazionidellapermeabilitionica

    deirecettoriAMPA(Pierietal.,2003)chepotrebberoessere inrelazionecon

    alcunedifferenzea livellobiomolecolaredelle subunitdei recettoriAMPA

    (Spallonietal.,2004).ItopitransgeniciG93AesprimonodeicanaliAMPAcon

    unapermeabilitalsodioealpotassioalmenotrevoltesuperioreaquelladei

    SOD1 mentre la permeabilit al calcio non sembra essere modificata.

    Leccitotossicit sembra quindi non essere correlabile ad un aumento della

    concentrazionedel calciodirettamentemediatadai recettoriAMPA/KA,ma

    potrebbeessereriferitaadunaattivazionedeirecettorivoltaggiodipendenti

    delcalcio,attivatiaseguitodelladepolarizzazionemediatadairecettorinon

    NMDA(Pierietal.,2003).Laumentointernodicalciopotrebbeancheessere

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    21

    dovutoalmaggioreingressodisodiochesiverificasempreattraversoquesti

    recettori. La presenza di unamaggior quantit di questo ione attiverebbe,

    infatti,unoscambiatoreNa+/Ca2+lacuiazionedeterminerebbeuningressodi

    ioni calcio allinterno del neurone. Questa ipotesi anche avvalorata

    dallazione di uno dei pochi farmaci utilizzati nella terapia della SLA, il

    riluzolo.Sidimostratoinfattichequestasostanzaingradodiinteragire,in

    colture primarie di corteccia di ratto, con le correnti ioniche di sodio, sia

    voltaggiodipendentichemediatedallattivazionedeirecettoriAMPA (Zona

    et al., 1998 , Zona et al., 2002). Gli stessi studi sono stati poi condotti su

    motoneuronimurini confermando che il riluzolo in grado di bloccare le

    correnti indotte dal kainato (Albo et al., 2004). A conferma di quanto

    dimostrato invitro,statoosservatocheanche invivo leccitotossicithaun

    ruolocrucialeneldannoneuronaleindottodaeventicomelischemia(Martin

    et al., 1998), e si pensa che possa giocare un ruolo importante nella lenta

    degenerazione neuronale che si verifica nella SLA. Questa ipotesi stata

    confermata dagli elevati livelli di glutammato registrati nel fluido

    cerebrospinale di pazienti SLA (Plaitakis and Caroscio, 1987) e dal deficit

    delle capacit di trasporto riscontrata nelmidollo spinale e nella corteccia

    motoriadel40%pazienticonsSLA(Rothstein,1995).

    Nei motoneuroni di topi G93A, attraverso esperimenti di patch clamp e

    calciumimaging,statoriscontrataunalterazionenellomeostasidelcalcioin

    seguitoadattivazionedeirecettoriAMPArispettoaicontrolli(Guatteoetal.,

    2007).notoche lingressodelcalcioe lasua localizzazione inmicrodomini

    intracellulari dia origine allattivazione di diverse vie di trasduzione del

    segnalechemedianorisposte fisiologiche indipendenti.Diversi lavorihanno

    mostrato che tra queste risposte alcune possono indurre processi di

    neurotossicitmediatidalcalcio(GhoshandGreenberg,1995).Ilcalcioentra

    nel neurone durante la neurotrasmissione non solo attraverso i recettori

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    22

    ionotropici del glutammato ma anche tramite i canali ionici voltaggio

    dipendenti (Powers and Binder, 2001). Leccitabilit neuronale potrebbe

    essere cos uno dei maggiori contributi alla vulnerabilit eccitotossica. Le

    cellule che generano potenziali dazione con frequenzamaggiore risultano

    infatti maggiormente vulnerabili alleccitotossicit. Inoltre un aumento

    delleccitabilit neuronale potrebbe contribuire a cambiamenti nello stress

    ossidativo (Hand and Rouleau, 2002) come anche a cambiamenti

    mitocondrialiedelmetabolismoenergetico(Browneetal.,2006).

    Recentementestatoosservatochelealterazioninelleproprietdiscaricasia

    dimotoneuroni che di cellule corticali nelmodello di SLA,G93A, fossero

    dovuteallalterazionedispecificicanaliionicidelsodiovoltaggiodipendenti

    (Pieri et al., 2003, Pieri et al., 2009). Queste potrebbero innescare

    lipereccitabilit dei neuroni G93A e quindi una maggiore vulnerabilit

    allingressodicalcio.

    1.1.7 Fattoridirischioambientali

    Ilrapportocon lambiente fondamentaleperdeterminare lostatodisalute

    della popolazione umana e la relazione tra lindividuo e i diversi fattori

    ambientali pu avere risvolti diversi sullequilibrio salute/malattia.

    necessario studiare, conoscere e comprendere quali siano gli elementi da

    considerare,daunpuntodivistaepidemiologico,pervalutare limpattodei

    diversifattorisullostatodisalute(MiglioreandCoppede,2009).

    AllinsorgenzadellaSLApossonoconcorrereanchecauseditipoambientale

    come lesposizioneadagenti tossici,qualimetallipesanti,pesticidi, solventi

    chimicie intossicazioni cronichedapiombo, selenio,mercurioemanganese

    (Johnson and Atchison, 2009). Tra gli agenti tossici, quelli maggiormente

    chiamatiincausasonoipesticidieifertilizzanti.Ineffetti,secondounostudio

    epidemiologico condotto in Sardegna, la prevalenza della malattia tra gli

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    23

    agricoltori doppia rispetto alla popolazione generale (Giagheddu et al.,

    1983).Talisostanze,utilizzateancheperlamanutenzionedelcampodagioco,

    potrebberoessere responsabilioltremododellinsorgenzadellamalattia tra i

    calciatori (FerrazzaandSturchio,2007).Tra i fattoriambientalicorrelaticon

    leziologiadellamalattianervosasonostatiidentificatiilfalloutradioattivo

    legato alla sperimentazionedi arminucleari inGiapponenegli anni 5060

    (Neilson et al., 1995) e le concentrazioni indoor di radon in Inghilterra

    determinateneglianni8189(FerrazzaandSturchio,2007).

    Tra gli studi epidemiologici sulla SLA, condotti su specifiche categorie di

    persone, ipinoti sonoquelli che riguardanogli atleti chepraticanovarie

    disciplinesportiveeimilitari.Daquestidatiemersochegiocatoridicalcio

    professionisti,maratoneti eveteranidellaGuerradelGolfo sonomoltopi

    esposti al rischio di sviluppare questa patologia rispetto alla popolazione

    generale(Horneretal.,2003).

    Inoltre recentemente sono stati studiati gli effetti molto pericolosi della

    diffusione dei cianobatteri.Questimicrorganismi sembrano essere associati

    alla produzione di neurotossine e citotossine come il BMAA (N

    methylaminoLalanine), lanatossina, la saxitossina, la curacina, la

    microcistina e la cilindrospermopsina. Tutte queste molecole si legano a

    bersaglipresentinel sistemanervoso centrale eperiferico e sono altamente

    diffuse in ambienti terrestri e marini. Recentemente stata riscontrata la

    presenzadialcunediquestesostanzetossiche in integratoridietetici(Funari

    andTestai,2008).

    UnavarianteparticolaredellaSLAilcosiddettocomplessoSLAParkinson

    Demenza (SLAPDC) di Guam, unisola dellOceano Pacifico sotto

    giurisdizioneUSA.Questamalattiastatamessainrelazioneconilconsumo

    da parte dei nativi di due specie di pipistrello (le volpi volanti, Pteropus

    tokudaeeP.mariannus)chesialimentanodisemiefogliediCycascircinalisL,

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    24

    contenenti un aminoacido neurotossico, la NmetilaminoLalanina

    (BMAA). Questultimo un amminoacido del tutto particolare in quanto

    appartieneallacategoriadelle fontialimentaridiazotononproteico.noto

    infatti che la LBMAA, in analogia con unaltra tossina implicata nel

    neurolatirismo (la bNoxalilamminoLalanina, LBOAA) provoca

    eccitossicit mediata dallattivazione dei recettori glutamatergici di tipo

    AMPA.ImodellisperimentaliapprontatiperriprodurrelaSLAmedianteuso

    delleneurotossinenonsisonorivelatiefficaci.Cidamettere inrelazione

    allanecessitdialtrifattorichecondizionanopesantementelinstaurarsidella

    patologia.

    Cox et al., (Cox et al., 2003) hannomesso in evidenza come la BMAA sia

    prodotta da qualunque genere di cianobatterio simbionte delle radici

    coralloididelleCycas.Daquilatossinaincorporataneisemidellapianta,e

    daquiallevolpivolanti,doveraggiungeconcentrazioni10.000voltesuperiori

    aquellenellorganismoproduttore (biomagnification).Murchetal. (Murchet

    al., 2004)hanno riscontrato laBMAA in cervellidipazienti affettida SLA

    PDC e daAlzheimer.Questo dato non stato confermato in altri pazienti

    affettidallestessepatologie(sMontineetal.,2005).SebbeneilruolodiBMAA

    nellemalattieneurodegenerative sia altamente indiscussione, ci sono studi

    che dimostrano che questa sostanza sia in grado dimimare la tossicit da

    glutammato e per questo la sporadicit di alcuni casi di SLA. Il BMAA

    attraversa la barriera ematoencefalica attraverso il trasportatore ad alta

    affinit L1, ma non attivo fino a che non si associa con il bicarbonato

    assumendounastrutturechemimaquelladelglutammatoedattivairecettori

    glutammatergiciinducendolamorteneuronale(Stipaetal.,2006).

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    25

    1.2 AttivitfisicaeinsorgenzadiSLA

    LaSLAnelcorsodiquestiultimiannistatafrequentementeassociatasiaa

    lavori fisici particolarmente pesanti che alla pratica di sport di resistenza,

    ancheseadogginessunacertezzascientificaemersa,eccettodatidiricerche

    epidemiologichecherimangonocontroversi (Kirkinezosetal.,2003,Valenti

    etal.,2005,Veldinketal.,2005).Traquesti,idatiraccoltisonoprovenientida

    casianeddoticiedastudicasocontrollo.

    Tra i casi aneddotici, spesso ampiamente ripresi dai mass media, che

    storicamente possono essere fatti risalire al caso del giocatore di baseball

    americanoLouGehrig,chevennecolpitodallaSLAnel1939alletdi35anni

    edecedettecirca2annidopo.Va inoltrericordato ilpiccoloma interessante

    cluster di 3 giocatori di football americano che avevano giocato

    contemporaneamente nella squadra dei San Francisco 49ers nel 1964 e che

    svilupparonolaSLAquasicontemporaneamenteneglianni80.Questocluster

    fu collegato aun fertilizzantediffusamenteusatonei campidi allenamento

    dellasquadra, ilmilorganite.Caratteristicadiquesto fertilizzantediessere

    costituito,inparte,dascartidilavorazionedellefonderieepertantodiessere

    estremamente ricco di residui metallici. Questa osservazione non stata

    successivamenteconfermata.

    Recentemente, i ricercatori del Dipartimento diNeurologia dellUniversity

    MedicalCenterdiUtrecht,hannovalutatoselattivitfisicapraticatanellarco

    dellavita,per lavoroenel tempo libero, fosseassociataadunaumentodel

    rischiodisvilupparelaSLAesecifosseunassociazionetraattivitfisica,la

    suadurataeletdinsorgenzadellamalattia(Veldinketal.,2005).Daquesti

    datiemersocheperi219pazientiricoveratipressoilCentro,trail2001edil

    2002,condiagnosicerta,probabileopossibiledisclerosi lateraleamiotrofica

    non era significativo lo svolgimento di unattivit sportiva rispetto ai 254

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    26

    soggettidicontrollo.

    Gli studi casocontrollo sono basati sul confronto fra soggetti affetti dalla

    malattiaecontrollisani,disolitoappaiatiperetesesso,chepermettonodi

    ricercare retrospettivamente differenze di esposizione a presunti fattori

    patogenetici. I risultati sullattivit sportiva finora pubblicati non hanno

    fornitodatiunivoci,anche sealcunidiessi sembrano indicare lesistenzadi

    un rapporto fra SLA e attivit sportiva intensa (Longstreth et al., 1998,

    Scarmeas et al., 2002). Uno dei maggiori problemi di questi studi

    rappresentato dalle differenti definizioni operative di attivit sportiva

    utilizzate e dalluso di questionari retrospettivi, che spesso comportano

    rispostescarsamenteaccuratedapartedeicasie/odeicontrolli.Finora,nonsi

    chiarito inmodo esaustivo lesistenza di un rapporto fra SLA e attivit

    sportivaoattivitfisicaintensa.

    Sonostatepropostediverseipotesisulpossibilemeccanismopatogeneticoche

    metterebbe incorrelazioneSLAeattivitsportiva,quali:(a)unattivitfisica

    intensaeprolungatapotrebbeaumentareleffettodelleccitotossicitalivello

    deimotoneuroni spinali; (b) lattivit fisicapotrebbe aumentare il livellodi

    stressossidativo,forseattraversolaumentodellaformazionediradicaliliberi;

    (c) i traumi correlati alla partecipazione allattivit sportiva potrebbero

    danneggiare la funzione dei motoneuroni inducendone la degenerazione.

    Anche idati sullattivit fisica nei topi transgenici SOD1,modello genetico

    dellaSLA,nonsonodiaiuto,perchilavoripubblicatihannofornitorisultati

    contraddittori, rilevando un effetto di tipo protettivo dellattivit fisica di

    resistenzaolassenzadiuneffettosignificativo(Kirkinezosetal.,2003).

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    27

    1.3 IpotesidiSLAneicalciatoriinItalia

    IlgiornalistaTomKington,inunarticolocomparsoil25Febbraio2003sulsito

    internet della Uefa, fa riferimento ad inchieste giornalistiche e giudiziarie

    italianesullabusodifarmacinellosporteperlaprimavoltaparladiMotor

    neuroneMystery.

    Recentemente,un aumentodi incidenzadi SLA fra calciatoriprofessionisti

    italiani stata riscontrata in studi epidemiologici. Questi studi hanno

    dimostrato un aumento di rischio di SLA di 6,510 volte fra i calciatori

    professionistirispettoallapopolazionegenerale(Berettaetal.,2003,Piazzaet

    al., 2004, Belli andVanacore, 2005,Chio et al., 2005,Vanacore et al., 2006,

    Armon,2007,Taioli,2007b,Wicksetal.,2007,Chioetal.,2009) .Lecausedi

    tale aumento sono ancora sconosciute ma fattori tossici, insieme a una

    predisposizione individuale, sembrano poter avere un ruolo rilevante

    (Mitchell,2000).

    A seguitodiuninchiesta giudiziariapresso laProcuradellaRepubblicadi

    Torino, stato confermato un aumento di rischio nella popolazione di

    giocatoridi calcio in Italia.Questo aumento statovalutato induediversi

    modaliteinstudiseparati(BelliandVanacore,2005,Vanacoreetal.,2006).

    Il primo studio stato effettuato basandosi sui certificati dimorte su una

    coorte di circa 24.000 calciatori professionisti e semiprofessionisti. Questo

    studioharivelato lapresenzadiunsignificativoeccessodidecessiperSLA

    nel periodo 19601996 rispetto a quanto atteso nella popolazione italiana

    (trattodaidati ISTAT) (casiosservati8,casiattesi0,69) (BelliandVanacore,

    2005, Vanacore et al., 2006). Questo eccesso risultato particolarmente

    significativofraisoggettidietinferioreai60anni.Irisultatidiquestostudio

    sono estremamente indicatividellesistenzadiun rapportopatogenetico fra

    SLAecalcio,mapresentanoalcuniproblemimetodologici,quali:

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    28

    (1)inaccuratezzadellediagnosiriportateneicertificatidimorte;

    (2)lincompletezzadellacoortedicalciatoriutilizzatacheincludevagiocatori

    siaprofessionistichenonprofessionisti;

    (3)ilconfrontononcorrettofralediagnosidiSLAneigiocatoridicalcio,che

    includevanolecausedimorteiniziale,intermedia,terminaleeaggiuntiva,ei

    datidiriferimentoISTAT,cheincludonolasolacausadimorteiniziale;

    (4)ilmancatocontrollodellediagnosidiSLAnellapopolazionedicalciatori.

    Perovviareaquestiproblemi si sono impostati studi retrospettividi coorte

    basatisuicalciatori tesseratiper lesquadrediserieAeBnelperiodo1970

    2001identificatiattraversogliarchividelladittaPaniniegliarchividellEnte

    NazionalediPrevidenzaeAssistenzaLavoratoridelloSpettacolo(ENPALS),

    cuisonoobbligatoriamente iscritti tutti igiocatoridicalcioprofessionistidal

    giugno1973.La coortedello studio comprendeva7325giocatori.Fraquesti

    sonostatidiagnosticatidi5casidiSLA,conunetmediadiesordiodi43,4

    anni. Il significativo aumentodel rischio di insorgenzadi SLA in giocatori

    professionisti(periodidigiocopariosuperiorea6anni)osservatoeradi6,5,

    superioresiaalleccessodirischiochesiosservaingeneraledurantelattivit

    sportivaesiadastudicasocontrollopubblicatiinletteratura(Chioetal.,2005,

    Chio et al., 2009). Ci potrebbe indirettamente indicare che il rischio di

    svilupparelaSLAfraicalciatoriprofessionistinonesclusivamenteconnesso

    allattivitfisicaintensaoalleffettoditraumiomicrotraumicomeipotizzato

    (Piazzaetal.,2004),maapparespecificamentecorrelatoallattivitcalcistica

    in s,anche con casi inambitoamatoriale (Wicks etal.,2007).Nello studio

    recente di Taioli (Taioli, 2007a), effettuato in gruppi di giocatori

    professionisti, sidimostra chementre restabassa lamortalitperpatologie

    comecancroemalattiecardiovascolari,rispettoallapopolazionegenerale,alla

    stessa etaumenta invecedi circa 18volte lamortalitperSLA e incidenti

    dauto.

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    29

    Da tutti i lavori epidemiologici che sono statipubblicatinel corsodiquesti

    anni,sipossonosollevarealcuneipotesichesembranolegateallaltorischiodi

    SLAfraicalciatoriitaliani,quali:

    luso di sostanze permigliorare le prestazioni atletiche oppure abuso di

    farmaci leciti,adosi superiori eperperiodipiprolungati rispettoaquelli

    normalmenteutilizzatidallapopolazionegenerale(BelliandVanacore,2005,

    Vanacoreetal.,2006,Taioli,2007b);

    il contatto con sostanzeutilizzate comediserbantio conciminei campidi

    giocooallenamento;

    le alterazioni metaboliche del muscolo o del motoneurone correlate a

    specifichemetodichediallenamentoodigioco;

    i traumiemicrotraumi ripetuti,specificidelgiocodelcalcio (Piazzaetal.,

    2004).

    Tenendo inoltre contodella giovane etdi esordio nellamaggiorpartedei

    casi di SLA fra i calciatori, si pu inoltre ipotizzare che il fattore tossico

    ambientale responsabile dellinsorgenza della SLA induca unanticipazione

    delletdi insorgenzadellamalattia in soggettigeneticamentepredisposti

    (Chioetal.,2005).

    Sebbenegli studiepidemiologici sianomaggiormente concentratiallinterno

    del contesto del calcio italiano, numerosi altri giocatori professionisti di

    footballamericanohanno sviluppato laSLAnel corsodegliultimianni, e i

    datirisultanomoltopreoccupanti (Abel,2007)conunaumentodirischiodi

    40 volte rispetto allintera popolazione americana.Non ancora chiaro se

    questaassociazionesiasolocasuale.

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    30

    1.4 Integrazionealimentaredurantelattivitsportiva

    Lutilizzodisupplementinonanaboliciafininutrizionaliedimiglioramento

    della performance atletica, comune tra gli sportivi. Le diverse sostanze

    utilizzatenonsonosupportatedaveriepropristudiscientificisuanimaliche

    abbiano testato il vero beneficio, ma soltanto da benefici teorici. Le dosi

    raccomandateduranteesercizifisiciintensisonocosmesseindiscussione

    poichgli studi a favorediun loro effettivobeneficio risultanopoco chiari

    (SchwenkandCostley,2002).Daunostudiocondottonel2007nellambiente

    sportivo, pi dell 82% dei giocatori intervistati riportava di fare un uso

    costantedisupplementi,il93%usavanofarmaciantifiammatorinonsteroidei

    e il28%vitamine (Taioli,2007a).Tuttavia, rimangono fortiperplessit sulla

    reale efficacia di questi prodotti anche in considerazione del fatto che i

    favorevoliallintegrazioneindicanoquantitativietempidisomministrazione

    assaidiversi(SchwenkandCostley,2002,ASSOCIATION,2009).

    1.5 Amminoacidiacatenaramificata

    Gliamminoacidiacatenaramificata(BranchedChainAminoAcid,BCAA)sono

    considerati supplementi nutrizionali e lusodi questi integratori si molto

    diffuso soprattutto nellultimo decennio, favorito da una vasta produzione

    scientificache avrebbedimostratounaspecificaefficaciadiquestesostanze

    nelmigliorarelaprestazionesportiva.

    Valina,Leucina e Isoleucina sono treamminoacidi essenziali,dettia catena

    ramificata in quanto caratterizzati da una catena di atomi di carbonio che

    deviadallacatenaprincipale(Fig.7).Questivengonoutilizzaticomefontedi

    energia in modo preferenziale dal muscolo durante lesercizio fisico e

    rappresentano il 30% dellamassamuscolare. Inoltre sarebbero in grado di

    promuovere lasintesiproteica (effettoanabolizzante)edi favorire iprocessi

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    31

    direcuperodopouncaricodilavoromuscolare.Unacorrettaassunzionedei

    BCAA necessaria per una normale crescita e sviluppo e quindi sono

    importantissiminellalimentazione.

    Fig.7Strutturadeitreamminoacidiramificati:Isoleucina,LeucinaeValina,conevidenziatiigruppialifaticichedeterminanolaramificazione.

    Gli amminoacidi ramificati sono ampiamente presenti nelle proteine dei

    comuni alimenti che, pertanto, se consumati nelle giuste quantit, sono in

    gradodi coprire completamente il fabbisognonutrizionalegiornalierodegli

    atleti. Nella maggioranza dei casi, luso degli integratori contenenti

    amminoacidi (inparticolare ramificati e arginina,ornitina e lisina)daparte

    degli atleti e degli sportivi in genere motivato dalla speranza e/o

    convinzionedipoterottenereunaumentodiproduzioneerilascio incircolo

    dellormonedellacrescita(GrowthHormon,GH,(DePaloetal.,2001).Intal

    modo verrebbero potenziati i processimetabolici e in particolare anabolici,

    quali aumento delle masse muscolari e della forza, mediati da questo

    fondamentale ormone ipofisario. Tuttavia, lanalisi critica e statisticamente

    correttadeidatidisponibili in letteraturasembrerebbesmentireuneffettodi

    questo tipo di integratori, quando assunti da atleti sani, opportunamente

    allenatieconabitudinialimentaricorrette(GiampietroandGambarara,2005).

    Infattilallenamentoeilgielevatoapportodiamminoacidiconglialimenti,

    tipico degli sportivi in genere, sarebbero sufficienti da soli ad ottenere la

    massima stimolazione possibile delGH, sempre entro i limiti fisiologici, e

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    32

    quindilusodiintegratoriproteicieamminoacidicinonprodurrebbeulteriori

    aumentidellaconcentrazioneplasmaticadellormone.

    Negli sport ad alto impatto quali lamaratona, il ciclismodi resistenza e il

    tennis stato dimostrato un miglioramento delle performance mediante

    lutilizzodiunintegrazionealimentareabasedileucina,valinaeisoleucina,a

    dosidi39,19e19rispettivamente,peruntotaledi77mg/kg/die(MacLeanet

    al.,1994,Ohtanietal.,2006).Glistudipirecentiriportanoche lutilizzodi

    questa integrazione, ad esempio nel gioco del calcio, pu portare ad un

    miglioramento delle performance cognitive nella fase finale delle partite,

    senzapermigliorarelaperformancefisica(Meeusenetal.,2006).

    1.6 MetabolismoefabbisognoumanodiBCAA

    LaregolazionedeglienzimichiavedelcatabolismodeiBCAAessenzialeper

    limitare lossidazione irreversibiledeiBCAA quando lassunzionedi questi

    amminoacidi insufficiente, e per eliminarli efficientemente quando sono

    assuntiineccessorispettoallanormalerichiesta.

    IlcatabolismodeiBCAAcoinvolgeinizialmenteduevieenzimatichecomuni,

    una transaminazione e una successiva decarbossilazione ossidativa. Di

    conseguenza, le quantit relative dei singoli BCAA si influenzano

    vicendevolmente.Gli enzimi catabolici dei BCAA, a differenza di quelli di

    tuttiglialtriamminoacidiessenziali che sonopresenti solonel fegato, sono

    distribuiti ubiquitariamente in tutto il corpo e tutte le trasformazioni

    biochimicheavvengononeimitocondri,conlunicaeccezionedelSNCdovele

    reazioniavvengononelcitosol(Hutsonetal.,1998,Shimomuraetal.,2004).

    IBCAAvengono assorbitinellintestino egiungono al fegatodadove,non

    subendo trasformazioni chimiche, vengono immessi nella circolazione

    sanguignaper esserepoimetabolizzati in largaparte a livellodelmuscolo

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    33

    scheletrico (Gelfand et al., 1986). Il primo passaggio del metabolismo dei

    BCAAneltessutoperiferico ladeaminazionemediante lenzimabranched

    chainaminotrasferasi(BCAT)perprodurrechetoacidiacatenaramificata(BCKA). Esistono due diverse isoforme per questo enzima: la prima,

    distribuita ubiquitariamente in tutto il corpo, presente nei mitocondri

    (BCATm), la seconda, sintetizzata principalmente nel cervello, attiva nel

    citosol(BCATc;Fig.8)(Bixeletal.,1997).

    Fig.8LocalizzazionedeglienzimidelcatabolismodeiBCAAnelcorpo.Laproduzionedigruppiamminicineidifferentitessutidiversaedipendedallespressionedideterminatienzimi.(DaHutson

    etal,2005)

    IBCKAvengono incorporatinelleproteine,oppurepossonoessereutilizzati

    come substrato energetico non solo nelmuscolo scheletrico,ma anche nel

    cervello, nei reni, nel fegato e nel cuore (Abumrad et al., 1982). In questi

    organi i BCAA subiscono una decarbossilazione ossidativa, limitante e

    irreversibile catalizzata dalla deidrogenasi dei BCKA (BCKD) con la

    conseguente generazionedei substratiper il ciclodellacido citrico (Fig. 9;

    ciclo di Krebs). Sulla base di studi condotti su modelli animali, stato

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    34

    osservato chenellinsufficienza epatica cronica il catabolismo acceleratodei

    BCAA nel cervello pu ridurre la neurotossicit dellammoniaca

    promuovendo lasintesidiglutamminaapartiredalglutammato (Watanabe

    et al., 1986, Kasinski et al., 2004). Inoltre studi metabolici (Hutson, 2006)

    riportanochenelcaso incui laproteinachinasiBCKcheregola lattivazione

    del complesso BCKD mutata, la disponibilit dei BCAA per la sintesi

    proteicasiannulla.Ilfenotipomurinochenederivasoggettoadisfunzione

    muscolareedattacchiepilettici.Questemanifestazionisiosservanoanchenei

    pazientiaffettidaMSUD (MapleSyrupUrineDisease), incuialcontrariosi

    bloccalossidazionedeiBCAAconconseguenteaccumulotossicodiBCAAe

    BCKA(Zhangetal.,1989).

    Fig.9ProdottidelcatabolismodeiBCAA.IlprimostepunatransaminazionedeiBCAAedcatalizzatodagliisozimidellaBranchedchainaminotrasferasi.(DaHutsonetal.2005)

    Nel 1985 lorganizzazionemondialedella sanit (WorldHealthOrganization,

    WHO) in collaborazione con lOrganizzazione per lAlimentazione e

    lAgricoltura(FoodandAgricultureOrganization,FAO)elOrganizzazionedelle

    NazioniUniti (UnitedNationsOrganization,ONU) stabilirono il fabbisogno

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    35

    giornaliero degli amminoacidi essenziali nelle diverse fasce det. Nel

    neonato, ad esempio, la quantitdiLeucina (Leu), Isoleucina (Ile) eValina

    (Val) necessaria per un corretto sviluppo rispettivamente 161, 70 e 93

    mg/Kg/die. Questa quantit va via via diminuendo fino ad arrivare

    nelladultoa14,10e10mg/Kg/dierispettivamente(FAO/WHO,1985).Questa

    diminuzionedel fabbisognodeiBCAA in funzionedellet si spiega con la

    necessit del neonato di aumentare la propria massa muscolare e quindi

    laccrescimento durante tutto lo sviluppo. In uno studio successivo

    (FAO/WHO, 1991, FAO/WHO, 2007), queste quantit sono state riviste

    soprattuttonelladultomodificandolein19,13e13mg/Kg/diedeitreBCAA

    (LeuIleVal).Questiamminoacidi,cometuttiquelliessenziali,sonointrodotti

    inquantitsufficienteconunadietaequilibrata(Kreideretal.,1993).

    1.7 Gli amminoacidi a catena ramificata nel SNC ed effetto sui

    meccanismidifaticacentrale

    I BCAA svolgono un ruolo importante nel cervello sia nel regolare il

    metabolismodellazoto, sianella sintesidellaglutammina. IBCAApassano

    rapidamente labarrieraematoencefalicascambiandosicon laglutamminae

    sono i maggiori donatori di azoto per la formazione di glutammina e

    glutammato nel cervello (Yudkoff et al., 1994, Yudkoff, 1997,Daikhin and

    Yudkoff,2000,Hutsonetal.,2001,Yudkoffetal.,2005).Gliastrocitiossidanoi

    BCAAperformareiBCKA,inquestomodofornisconoazotoamminicoperil

    pooldiglutammatodellecellulegliali (Bixeletal.,1997,Bixeletal.,2001). I

    BCKAtraslocanonelcitosoldeineuronidovevengonoriconvertitiinBCAAe

    corpi chetonici (Bixel and Hamprecht, 1995). Il neurotrasmettitore

    glutammato rimosso dal liquido extracellulare dagli astrociti e

    metabolizzato a glutammina mediante lenzina glutammina sintetasi,

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    36

    responsabile della regolazione della concentrazione di questo

    neurotrasmettitore. La glutammina quindi rilasciata dagli astrociti e

    riassorbitadaineuronineiqualivieneidrolizzataaglutammatoeammoniaca

    dallenzima glutaminasi. Lammoniaca cos prodotta viene utilizzata per la

    sintesidiBCAAapartiredaiBCKA.IBCAAsonosuccessivamenterilasciati

    nello spazio extracellulare e riassorbiti dagli astrociti, completando il ciclo

    BCAAGlutammato (BCAA shuttle; Fig. 10). Questo ciclo permette la

    regolazionedellaconcentrazionedelglutammato(Platelletal.,2000).stato

    osservato che eccessidiBCAAodei loroderivati,quali lammoniaca, sono

    tossiciper lo sviluppodel sistemanervoso centrale (Bachmann et al., 2004,

    Kasinski et al., 2004). Infatti, questi autori hannodimostrato che in coltura

    cellulareunesposizioneallammoniacaprimadelcompletodifferenziamento

    induce un alterato sviluppo assonale colinergico accoppiato ad un

    decrementodellacreatinaedellafosfocreatina,mentreunesposizionediuna

    colturagidifferenziatanonportaaglistessirisultati.

    Fig.10RelazionecheintercorretraiBCAA,BCKAelaGlutamminatraivariorgani.(DaHutsonetal.,2001)

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    37

    IBCAA funzionanoda importantesubstratoenergeticonelcervello (Hutson

    et al., 2005) e sono rapidamente metabolizzati dalle cellule neuronali in

    colturaanchequandoaltrisubstratienergetici,comeadesempio ilglucosio,

    sonopresentiinabbondanza.

    LintegrazionedeiBCAAstataconsiderata importantesoprattuttoperdue

    aspetti:

    riduzionedellafaticacentralecausatadaunallenamentointenso; riduzione della degradazione proteica del muscolo in seguito

    allallenamento.

    Un aspetto sicuramente interessante il ruolo che diversi ricercatori

    attribuiscono ai BCAA nel determinare una riduzione della sensazione di

    fatica durante un esercizio fisico prolungato (Blomstrand and Saltin, 2001).

    Fisiologicamente lafaticapuesseredefinitacome lincapacitdimantenere

    uno sforzoprolungato epu essere indicata comeperiferica e centrale.Per

    faticaperifericasiintendeladiminuzionedellacapacitdisvolgereunlavoro

    muscolare.Questotipodifaticacoinvolgesialatrasmissioneneuromuscolare,

    sia linterazione actinamiosina (Green et al., 1995,Davis et al., 1998). Sono

    stati identificati diversi fattori responsabili della fatica periferica, come la

    diminuzione nelmuscolodel glicogeno edella fosfocreatina, laccumulodi

    protoni,ladifficoltditrasmissioneneuromuscolareelaumentodellattatoa

    livellomuscolare.

    Lecausemolecolaridellafaticacentralenonsonoancorastatechiaritemauna

    delle ipotesi sarebbe un incremento nel sangue della concentrazione di

    triptofano(TRP)equindidelneurotrasmettitore5idrossitriptamina(5HT),o

    serotonina,eche,neineuronicoinvoltinelcontrollodellattivitmotorianel

    cervello,puessereresponsabiledellafaticaditipocentrale.Siritienechela

    variazionediconcentrazionedellaserotoninacerebralesiadipendentedaun

    aumento del triptofano libero plasmatico e sia responsabile dello stato di

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    38

    fatica centrale che caratterizzato da sonnolenza, malumore, senso di

    stanchezzaedifficoltaproseguire limpegno (NewsholmeandBlomstrand,

    2006).Poichiltriptofanoilprecursoredellasintesidi5HT,unincremento

    della sua quota libera (fTRP), ovvero non legata allalbumina nel sangue,

    porta adun suomaggiore trasporto attraverso labarriera ematoencefalica,

    mediata dal sistema di trasporto L1 specifico per gli amminoacidi neutri.

    Infatti la concentrazionedi serotoninanel cervelloaumentaquandoviun

    aumentodelrapportotralaconcentrazionedifTRPelaconcentrazionetotale

    dei BCAA nel plasma (Mizuno et al., 2006). stato infatti osservato che

    lassunzione di BCAA potrebbe far diminuire il rapporto fTRP/BCAA nel

    plasmariducendocoslasintesidi5HT(NewsholmeandBlomstrand,1996).

    Lincremento della serotonina si verifica principalmente durante un

    allenamentoprolungatoperdueragioni:

    i BCAA presenti nel sangue vengono ossidati per produrre energiadurantelacontrazionedelmuscoloscheletrico;

    nelplasma la concentrazionedi acidigrassi aumenta,parallelamenteallincrementodelfTRP,poichcompetonoentrambiperillegamecon

    lalbumina(Davisetal.,2000).

    Poich stato osservato che laumento degli acidi grassi circolanti, che si

    verifica durante un esercizio fisico submassimale, pu essere parzialmente

    bloccatodaunalimentazionericcadicarboidrati(CHO),sonostatestudiatele

    conseguenze dellintegrazionealimentareconBCAAassociatiaicarboidrati

    sullafaticacentrale(Davisetal.,1992).

    stata posta lattenzione sullintegrazione dei BCAA come mezzo per

    prevenire la fatica di tipo centrale durante unattivit prolungate quali ad

    esempio loscidi fondo, lemaratoneo lepartitedicalcio (Blomstrandetal.,

    1991,Newsholmeetal.,1991).Inunaseriedistudielavorisuccessiviemerge

    che:

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    39

    somministrazionidiBCAAda7,5a21gprimaedurante lesercizio fisico,

    inducono in alcuni soggetti unmiglioramento nelle prestazioni sia fisiche

    (Newsholmeetal.,1991)chementali(Blomstrandetal.,1991).

    non si evidenziano differenze significative nelle prestazioni fisiche n un

    miglioramentodella faticadiun gruppodi volontaridurante attivit fisica

    intensaacui,70minutiprimadellesercizio,sonostatisomministrati20gdi

    BCAA, rispetto ad un gruppo a cui era stata somministrata una soluzione

    zuccherata(Varnieretal.,1994).

    inuno studio su ratti sidimostra che la somministrazionedi altedosidi

    BCAA causava linsorgenza della fatica precocemente rispetto alla

    somministrazionedisolaacquaeglucosio(Vergeretal.,1994).

    altedosidiBCAApossonoessere ingradodiridurre lafaticacentrale,ma

    determinano un aumento delle concentrazioni di ammoniaca, uno dei

    catabolitideiBCAA, che si saessere tossicaper il cervello e imuscoli (van

    Halletal.,1995a,vanHalletal.,1995b,Kasinskietal.,2004).

    1.8 PossibileimplicazionedeiBCAAnellaSLA

    Alcuniricercatorihannoipotizzatochelaneurotossicitcausatadauneccesso

    di glutammato extracellulare potesse contribuire alla degenerazione dei

    motoneuronibulbarie spinali (Plaitakisetal.,1988). Infatti stato riportato

    cheunaparzialeanomaliadellenzimaglutammatodeidrogenasi(GDH)pu

    causare un incremento dei livelli del glutammato nel plasma dei pazienti

    affettidaSLA(PlaitakisandCaroscio,1987,Plaitakis,1990).Ilglutammato

    convertito in chetoglutarato e viceversa dallenzima GDH. Lattivit diquestoenzimastatadimostrataesserenormale(PlaitakisandCaroscio,1987)

    oridotta(Hugonetal.,1989)neileucocitideipazientiSLA,mentrerisultava

    essereelevatanellecornadorsalienelmidollospinale(Malessaetal.,1991).

    Poich laGDHpuessereattivataallostericamentedaiBCAA(Yieldingand

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    40

    Tomkins, 1961, Erecinska and Nelson, 1990), stato ipotizzato che la

    progressionedellamalattiapotesseesseremodificatadallasomministrazione

    diquestiamminoacidi.

    Successivamente, in uno studio effettuato su 22 pazienti SLA, 11 dei quali

    trattatiperunannoconBCAA(12gdiLLeucina,8gdiLIsoleucina,6,4gdi

    LValina)ed11conplacebo,statodimostratoche,nelgruppotrattatoconi

    BCAAsinotavaunsignificativomiglioramento in terminidimantenimento

    della forzamuscolare edella capacitdi camminare (Plaitakis et al., 1988),

    mentre nel gruppo trattato con ilplacebo si notava unadiminuzionedello

    stato funzionale, in accordo con la storia naturale dellamalattia.Altri due

    studiinvece(Testaetal.,1989,BeghiandMennini,2004)hannoriportatochei

    pazienti trattati conBCAAnon riscontravanonessunvantaggio terapeutico

    rispettoalgruppodicontrollo.IncontrastoconirisultatidiPlaitakisdel1988,

    ungruppoitalianodistudiodellaSLA,nel1989,hainiziatoindiversicentri

    specializzatiuna ricercapervalutare lefficaciae la sicurezzadeiBCAAnei

    pazientitrattati.

    La sperimentazione stata effettuata in nove centri SLA tra ospedali e

    universit,peruntotaledi126pazienti.61pazientisonostatitrattaticonun

    prodottovendutosulmercatoitaliano,contenente1,2gdiLLeucina,0,6gdi

    LIsoleucinae0,6gdiLValinae7,6gdicarboidrati;65pazienti sono stati

    trattati conunplacebo, contenente solo i carboidrati.Aipazienti sono stati

    somministrati 2 pasticche, contenenti i BCAA o il placebo a secondo del

    gruppo,daassumereperviaoraleprimadeipasti5voltealgiornopertuttoil

    periodo di studio. Nel 1991 un eccesso di mortalit tra i soggetti a cui

    venivano somministrati i BCAA, in assenza quindi di risultati positivi in

    favoredeltrattamentoconiBCAA,haportatoilcomitatoperilmonitoraggio

    deidatiarichiederelinterruzionediquestostudio(1993).Eranoinfattimorti

    24pazientitrattaticon iBCAAe13trattaticon ilplacebo.Lapercentualedi

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    41

    sopravvivenzaera,peripazientitrattaticoniBCAA,del92%a3mesi,81%a

    seimesi,74%anovemesie59%adodicimesi;mentreper ipazientitrattati

    con ilplacebo lacorrispondentepercentualedisopravvivenzaeradel100%,

    90%,85%e74%.IlrischiorelativodimorteneipazientitrattaticoniBCAA

    risultatoessere2,3voltesuperioreaipazientitrattaticonilplacebo(1993).

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    42

    2 IlcomplessomTOR(mammaliantargetofRapamycin)

    MoltistudisonostatieseguitiperesaminareilruolodeiBCAAnellinduzione

    di modificazioni molecolari che aumentano la sintesi proteica muscolare.

    Alcuni hanno riportato che, combinando lintegrazione di BCAA con un

    allenamento intenso, siamplificherebberoalcuni segnaligenetici,mentreda

    altristudiemergeche,assumendoquestiamminoacidiprimaedopolattivit

    fisica, si ridurrebbe la degradazione proteicamuscolare (Blomstrand et al.,

    2006).UnsupplementodiBCAAinfatticreaunalterazionedellattivitdella

    trasduzione del segnale delle vie che regolano la trascrizione dei geni

    coinvoltinellacrescitamuscolare(Blomstrandetal.,2006).Alivellocellulare

    coinvoltalaviadellmTOR(mammaliantargetofRapamycin)regolataanche

    dallapresenzadinutrienticomeilglucosio,nonchdaormonicomelinsulina

    (Fig.11)(Proud,2006,Krebsetal.,2007,Proud,2007).

    mTOR,elacascatadireazionichedaessoderivano,vieneattivatoquandola

    cellula ha a disposizione alti livelli di nutrienti (Proud, 2002). Con queste

    premesse i ricercatori hanno ipotizzato che il ruolo di sensore energetico

    cellularesvoltodamTORpotesseessereapplicatoinmodopigeneralealla

    regolazione del bilancio energetico del corpo intero. Per verificare

    questipotesistatostudiato ilsegnaledimTORe lasuacascatadireazioni

    nellipotalamo, unimportante area cerebrale coinvolta nella regolazione

    dellappetitoedelpesocorporeo(Cotaetal.,2006,Morietal.,2009).

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    43

    Fig.11DestinodeiBCAAnellecelluleestimolazionedellasintesiproteicaedellaccrescimentomuscolare.

    LaproteinamTOR(mammaliantargetofRapamycin)(Kubicaetal.,2005)una

    molecoladi290KDa,coschiamataperch inibitadalmacrolideRapamicina,

    antibioticoprodottodalbatterioStreptomyceshygroscopicus.LaRapamicinaei

    suoi derivati presentano un unico meccanismo dazione che comporta

    linterazioneconunapiccolamolecolaproteicadalpesodi12KDa,notacome

    FKBP12(FK506bindingprotein)aformareuncomplessochesivaalegaread

    mTOR, inibendola (Bjornsti andHoughton, 2004). I due complessi in cui

    presentelaproteinamTORsono:

    il complessomTORC1 responsabile della regolazione della sintesi

    proteicaesicomponedimTOR,raptor (regulatoryassociatedprotein

    ofmTOR)edGL(Haraetal.,2002).Raptorunagrossamolecoladi

    150 KDa, che stabilisce interazioni multiple con mTOR e con suoi

    substrati(Kimetal.,2002);GL,invece,unaproteinadi36KDa,che

    si lega al dominio chinasico di mTOR, regolandone positivamente

    lattivitcatalitica(Wullschlegeretal.,2005).

    il complessomTORC2 costituitodamTOR,GL edaunaproteina

    dal peso molecolare di circa 200 KDa proteina, nota come rictor

    BCAA

  • Dottorato di ricerca in Neuroscienze

    44

    (rapamycininsensitive companion ofmTOR).La funzione fisiologica

    dimTORC2nonancoradeltuttochiara,tuttavialipotesiadoggipi

    accreditata che tale complessomoduli lorganizzazione dellactina

    citoscheletrica(Jacintoetal.,2004).

    mTORC1 una serintreonin chinasi costituitadaundominio catalitico,un

    sitodilegameperilcomplessoFKBP12Rapamicinaedunprobabiledominio

    adazioneautoinibitoria(negativeregulatorydomain)(Sekulicetal.,2000).

    Lattivit della proteinamTOR e dei suoi target modulata da numerosi

    stimoli, quali fattori di crescita (IGF1), nutrienti (amminoacidi), stress

    ambientali (ipossia), ormoni (insulina, T3, GH, testosterone) e secondi

    messaggeri(IP3ecalcio)(Inokietal.,2005).

    Studi condotti su cellule di mammifero suggeriscono che, il complesso

    mTORC1 possa agire da sensore dei livelli intracellulari di nutrienti. In

    assenzadiamminoacidieinparticolarelaleucina(Kimetal.,2002,Kimetal.,

    2003), tale complessoandrebbe incontroadunavariazione conformazionale

    cheprecluderebbelachinasimTORdalfosforilareisuoisubstrati(Kimetal.,

    2002,Kimetal.,2003,Wangetal.,2006,Wangetal.,2008).Alcontrario, in

    presenza di amminoacidi, lo stesso complesso proteico subirebbe una

    modificazione tridimensionale tale da promuovere unefficiente interazione

    traraptoredisubstratidimTOR,favorendonelafosforilazioneadoperadella

    chinasi(Kimetal.,2002,Kimetal.,2003)(Fig.12).

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    45

    Fig.12SchematizzazionedituttiisegnaliesternichegiungonoallacellulaepermettonolattivazionedelcomplessomTORC1edmTORC2eregolazionedidiversimeccanismi.

    Dalpuntodivista strutturale, laRapamicina unmacrolidederivatodalla

    fermentazionedellactinomiceteStreptomyceshygroscopicus,originariamente

    isolatodalterrenonellisoladiRapaNuinel1975(Fig.13).

    Fig.13strutturadellaRapamicina

    Al farmaco, chiamato appunto Rapamicina dal nome dellisola dove fu

    scoperto,statoinseguitoaggiuntoilnomegenericodiSirolimus,mentre

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    46

    Rapamuneilnomeregistratodallindustriafarmaceuticacheloproducee

    lodistribuisce(Wyeth/PfizerInc).

    La Rapamicina venne dapprima studiata come molecola antifungina ed

    antitumorale e solo in seguito linteresse per il farmaco si spost sulle sue

    potenti propriet immunosoppressive. La Rapamicina infatti, una volta

    legatasi al recettore citoplasmatico FKBP12, interagisce con il complesso

    proteicomTORbloccandonelesuefunzioni.

    Siritienechemoltemalattieneurodegenerativesianogeneratedaalterazioni

    dellaconformazionedialcuneproteine,chevannoincontroallaformazionedi

    aggregati (Christie et al., 2002). Queste patologie, per le quali stato

    appositamenteconiatoilterminediproteinopatie,sonocaratterizzatedalla

    presenza, allinterno di aree specifiche del sistema nervoso centrale, di

    aggregati proteici che possono variamente localizzarsi in sede intra o

    extracellularenellediversemalattie (Christie et al., 2002).Tali cambiamenti

    conformazionali, misfolding,possono essere la conseguenzadimutazioni

    geniche che alterano la struttura primaria della proteina codificata, di

    alterazioni dei sistemi che controllano il corretto processo di ripiegamento

    dellacatenapolipeptidicadurantelasintesiproteica,oppurediinsultitossici

    chepossonocolpirelacelluladuranteilpropriociclovitaleedanneggiarela

    proteinainfaseposttraduzionale.

    Studigeneticie limpiegoestensivodianimali transgenicihannodimostrato

    che le alterazioni conformazionali possono determinare la totale o parziale

    perditadi funzionedellaproteinaalterataoppureconferisconoallaproteina

    propriet tossiche per guadagno di funzione, incrementando lattivit

    fisiologica o causando la comparsa di nuove propriet (Rubinsztein et al.,

    2007).

    Dallattivit dei sistemi di degradazione proteica, in grado di regolare i

    normalilivellieilturnoverfisiologicodelleproteine,dipendelacapacitdella

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    cellula di rimuovere le proteine danneggiate e potenzialmente tossiche.

    Lautofagia regola il turnover fisiologico di svariati costituenti cellulari,

    inclusi organuli e proteine, solubili o aggregate, mediante un processo

    multifasico che coinvolge lattivit degradativa lisosomiale (Klionsky and

    Ohsumi, 1999). Sulla base delle diverse modalit con cui i componenti

    intracellularivengonoindirizzatiailisosomi,sidistinguonotretipiprincipali

    di autofagia, che prendono il nome di macroautofagia, microautofagia e

    autofagia mediata da chaperonine (CMA). I diversi tipi di autofagia

    differiscono per tipologia di substrato e meccanismo di regolazione

    attivazione.

    Tra queste la Rapamicina sembra essere un forte induttore della macro

    autofagia,unprocessodi autodegradazione che in condizioni fisiologiche

    costitutivamenteattivoecausailturnoverbasaledellecomponenticellularie

    regola il bilancio di nutrienti negli eucarioti (Fig. 14) (Schmelzle andHall,

    2000,YorimitsuandKlionsky,2005).

    stato studiato approfonditamente il ruolodegli aggregati citotossici nelle

    malattie neurodegenerative, come nellAlzheimer (AD), il Parkinson (PD),

    lHuntington (HD) e varie atassie spinocerebellari (SCA), in cuimutationi

    nella sequenza primaria amminoacidica causano errori nellassemblaggio

    proteicoconlaformazionediaggregati(Bergeretal.,2006).Siritienecheuna

    mancanza di autofagia causi la neurodegenerazione (Takada et al., 2005,

    Bergeretal.,2006,Haraetal.,2006)echequestomeccanismogiochiunruolo

    importantenellaneuroprotezione (Webbetal.,2003,Ravikumaretal.,2004,

    Berger et al., 2006,Hornberger andChien, 2006,Kabuta et al., 2006). Inun

    articolopubblicatosullarivistaNature,Sarkarecollaboratoriaffermanoche

    somministrando dellemolecole denominate smallmolecule enhancers, si

    stimola il processo di autofagia attraverso il quale le cellule eliminano le

    proteinealterateemalripiegatecomelaproteinahuntingtinamutante(Sarkar

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    etal.,2007). I ricercatori ritengono che stimolando lautofagianellepersone

    chesoffronodellacoreadiHuntington,oinaltremalattieneurodegenerative,

    anche senon si rallenta o arresta laproduzionediproteinahuntingtina, le

    celluleeliminanomeglioirestitossiciineccesso,ritardandolapparizionedei

    sintomi (Rubinsztein et al., 2007). stato anche dimostrato che sia la

    RapamicinacheilsuoanalogoCCI779,sianoprotettivinellaDrosophilaein

    modellimurinidiHD(Ravikumaretal.,2004).

    Fig.14ViediattivazioneintracellularidellautofagiaadoperadellaRapamicinaedelLitio

    La SLA risulta essere una delle patologie in cui unalterata conformazione

    proteica (SOD1) induceunaccumulodiaggregatineurotossici eperquesto

    lautofagiasembraavereunruoloimportante.

    In particolare, diversi lavori hanno riportato che lautofagia riduce i livelli

    (Kabuta et al., 2006) di tossicit nella SLAmediata da accumulo di SOD1

    mutata inuna lineadineuroblastoma.Gliaggregati tossicidiSOD1mutata,

    trovatiinmodellianimalidifSLAeinpazientiaffetti,potrebbesuggerireun

    meccanismoalteratodiautofagiaequindi il coinvolgimentodiunpathway

    mTORdipendente modificato (Bruijn et al., 1997, Watanabe et al., 2001,

    Kobayashietal.,2006). InoltreKabutadimostrache lautofagiaabbassasia i

    livellidiproteinadellaSOD1mutata,chelatossicitindottadaquestultima

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    (Kabuta et al., 2006). stato inoltre riportato che la funzionalit dimTOR

    attivataattraverso lafosforilazionedellaSerina2448siaridottaneitopimutati

    G93Aadunostadioprecoceprimadellacomparsadeisintomi(Morimotoet

    al.,2007).possibilequindi che lautofagia regolatadalla rapamicina sia in

    questomodellodi SLAunodeimeccanismi coinvolti.Tuttavianon ci sono

    lavorisuimeccanismidiautofagiainvivonellaSLA.

    Poich i BCAA regolano il complessomTOR, e poich una loro eccessiva

    assunzionerisulterebbe implicatanellosviluppodellaSLA,sarannostudiate

    leproprietdiscaricadipotenzialidazioneelafunzionalitdeicanaliionici

    voltaggiodipendenti, parametri che risultano essere alterati nel corso della

    patologia.

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    3 IcanaliioniciVoltaggiodipendentielatrasmissione

    sinaptica

    Lagenesideimessagginervosidipendedarapidevariazionidelladifferenza

    del potenziale elettrico esistente sullemembrane neuronali.Questa rapida

    variazionedelpotenzialedimembranadenominatapotenzialedazione.Nel

    corso di un potenziale dazione, il potenziale di membrana pu andare

    incontro a variazioni dellordine di 500millivolt al secondo. Variazioni di

    questordinedigrandezza sono resepossibilidallapresenzadi canali ionici

    che costituiscono una classe di proteine integrali che attraversano la

    membrana da parte a parte. Questi canali posseggono tre propriet

    importanti: (1) lasciano passare gli ioni; (2) riconoscono e selezionano le

    diverse specie ioniche; (3) si aprono e si chiudono in risposta a segnali

    specificichepossonoesseredinaturaelettrica,meccanicaochimica (Kandel

    etal.,1991).Ledimensionidiquesticanali,dedottedalladimensionedellepi

    grosseparticellechepossonoattraversarli,corrispondonoadundiametronon

    maggioredi8(1=1010m).Essiquindinonpossonoesserepercorsidalla

    maggior parte delle molecole non dissociate che si trovano nei liquidi

    organici,mentre lascianopassare, inmodopiomeno selettivoneidiversi

    casi,molti ioni inorganici grazie alle loro dimensioni relativamente piccole

    (Hille, 1986). I canali ionici possiedono la peculiare caratteristica di poter

    passaredaunostatoapertooattivato,checonsente ilpassaggiodegli ioni,ad

    unostatochiusoedeventualmente,adunostatoinattivato,neiqualilaperviet

    dei canali interrotta e gli ioni nonpassano.La transizione tra lo stato di

    apertura e quello di chiusura pu essere determinata da variazioni del

    potenziale dimembrana. In questo caso si parla di canali ionici voltaggio

    dipendenti. Se invece lamodificazione indotta da particolari sostanze in

    gradodicombinarsicongruppichimicidelleproteinecostituenti ilcanale, i

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    canalisonodettichemiodipendenti.Icanaliionicivoltaggiodipendentisono

    costituitidadueparti:undominio che,appunto, sensibileavariazionidi

    voltaggio e un dominio che forma il poro attraverso cui passano gli ioni

    (Pongs,1999,Sansometal.,2000).

    3.1 Genesiionicadeipotenzialidazione

    Ineuronisono,perdefinizione,dellecelluleeccitabilicherispondonoaduno

    stimolo adeguato variando il loro potenziale di membrana e, superato il

    valoresoglia,generanounpotenzialedazione.

    Lecellulenervosesono,inoltre,ingradodigenerarepotenzialidazioneinun

    ampiointervallodifrequenze,epossonorispondereapiccolicambiamentidi

    correntivariandodimolto la lorofrequenzadiscarica,odifiring(Tatenoet

    al., 2004). Le propriet di scarica delle cellule nervose dipendono

    allespressionedimoltitipidicanaliionicivoltaggiodipendenti.Siritieneche

    le conduttanze voltaggio dipendenti delle cellule neuronali del cervello di

    mammiferoincludanoalmeno2o3componentidellecorrentidisodio,4o5

    diversecomponentidellecorrentidicalcio,4o5componentidellecorrentidi

    potassio attivate dalla variazione del voltaggio e almeno 2 o 3 di quelle

    attivatedalcalcio,elecorrentiattivatedalliperpolarizzazione.Leproprietdi

    attivazione ed inattivazione di ciascun canale, e la densit alla quale sono

    espressi sulla membrana di ciascun neurone, determinano la forma e la

    ripetitivitdelfiring(Bean,2007).

    3.2 Icanaliionicidelsodiovoltaggiodipendenti

    Ilprincipalecontributoperlagenesidelpotenzialedazionedatodaicanali

    ionici voltaggiodipendentidel sodio (Fig. 15).Uno stimolodepolarizzante,

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    infattineprovoca larapidaattivazione (delladuratadicircauncentinaiodi

    microsecondi) e la comparsa di una corrente entrante di sodio. Questa

    correnteinduceunulterioredepolarizzazionechefaaprireunnumeroancora

    maggiore di canaliNa+, determinando un ulteriore aumento della corrente

    entrante.Lacorrentedisodio,alpermaneredelladepolarizzazione,raggiunge

    un valoremassimo o di picco, in seguito al quale si riduce rapidamente e

    ritorna al suo livello di riposo in circa 2ms. Questo rapido decadimento

    spontaneo di correntedimostra che, alpermaneredelladepolarizzazione, i

    canali ionicidelNa+presentano il fenomenodell inattivazione,che li rende

    nuovamente impervi allo ione dopo che sono stati per un breve periodo

    attivati nello stato aperto. La loro successiva attivazione, per, richiede il

    passaggio attraverso lo statodi chiusura (Taglietti andCasella, 1997). Se la

    depolarizzazione generata dalla corrente del sodio raggiunge un valore

    soglia, viene innescato il potenziale dazione. Infatti lattivazione di questi

    canali del sodio responsabile della fase dascesa del potenziale dazione

    (Catterall,2000a,YuandCatterall,2003,Catteralletal.,2005).

    I canali del sodio (Fig. 15) sono formati da una subunit di 260 kDa

    associataadunaopisubunitausiliare(1,2e/o3)di3336kDa.Ad

    oggi sono state identificatenove subunit (Nav1.1Nav1.9).Le subunit

    sono suddivise inquattrodomini (I IV) simili tra loroeognunodeiquali

    contieneseielichetransmembrana(S1S6).Ognidominiohanellelica

    S4 dei residui amminoacidici carichi positivamente che inducono

    cambiamenti conformazionali nel canale a seconda del potenziale di

    membrana.Ognidominioha,traleelicheS5eS6,unlooprientrantecheva

    aformarelaparteextracellularedelporo(quellaresponsabiledellaselettivit

    del canale)mentre lelicaS6va a formare laparte intracellularedelporo

    (Catterall,2000a,YuandCatterall,2003,Catteralletal.,2005).

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    Fig.15Strutturadeicanalidelsodiovoltaggiodipendenti.Asinistra)Rappresentazioneschematicadellesubunitdelcanaledeicanalidelsodiovoltaggiodipendenti.Lasubunit

    illustratainsiemeallesubunit1e2.Inumeriromaniindicanoidominideisegmenti,5e6sonoisegmenticheformanoilporo(verde),4ilsensoredelvoltaggio(giallo),illoopintracellularetraidominiIIIeIVcontieneilmotivoIFMresponsabiledellinattivazione(celeste),Psonoisitidi

    fosforilazione(icerchirossisonoibersaglidellaproteinchinasiAeirombirossisonoibersaglidellaproteinchinasiC)eunprobabilesitodiNglicosilazione(YuandCatterall,2003).IlTTxsilegaalprimoloop.Adestra)Classificazioneelocalizzazionedeigenicodificantilesubunitdelcanaledel

    sodio.

    Daunpuntodivistasperimentale,icanalidelsodiosonostatiiprimicanali

    voltaggiodipendentiadesserescoperti.Daunpuntodivistaevolutivo,sono

    invece gli ultimi ad essersi sviluppati. I canali del sodio infatti sembrano

    derivaredai canalidel calcio che contengonoquattrodominiomologhi (Yu

    andCatterall,2003).

    I lavoridiHodgkin eHuxleyhannodefinito le tre caratteristicheprincipali

    dei canali del sodio: lattivazione voltaggiodipendente, la conduttanza

    selettiva e linattivazione spontanea. Come gi visto le prime due

    caratteristicherisiedonorispettivamenteinunaseriediresiduiamminoacidici

    carichi positivamente e nel loop rientrante tra le eliche S5 e S6.

    Linattivazione un processo rapido che avviene nel giro di pochi

    millisecondi ed determinato dal loop che connette i domini III e IV.

    Allinterno di questo loop presente una sequenza di tre amminoacidi

    denominataIFM(daIsoleucina,fenilalaninaemetionina)lacuifenilalaninasi

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    legaal latocitoplasmaticodelporocausandone lachiusura(Catterall,2000a,

    YuandCatterall,2003,Catteralletal.,2005).

    Questicanalipossonoesserebloccatidalla tetradotossina (TTX),una tossina

    letaleprodottadaipesci appartenenti alla famigliadeiTetraodontiae (il cui

    esemplare piu noto il pesce palla).Questa tossina va a legarsi nel poro

    selettivodel canale impedendo lingressodel sodio senza tuttaviaalterare i

    meccanismidaper