L'INGEGNERIA GENETICAL'INGEGNERIA GENETICA

COME SI MANIPOLA IL DNA?COME SI MANIPOLA IL DNA?

COME SI MANIPOLA IL DNA?COME SI MANIPOLA IL DNA?

COME SI MANIPOLA IL DNA?COME SI MANIPOLA IL DNA?

COME SI ISOLA IL DNA?COME SI ISOLA IL DNA?

LA “POLYMERASE CHAIN LA “POLYMERASE CHAIN REACTION” (PCR)REACTION” (PCR)

Sfrutta il principio della Sfrutta il principio della replicazione del DNAreplicazione del DNA per per

amplificare una specifica sequenza.amplificare una specifica sequenza.

LA “POLYMERASE CHAIN LA “POLYMERASE CHAIN REACTION” (PCR)REACTION” (PCR)

MECCANISMO DELLA REPLICAZIONEMECCANISMO DELLA REPLICAZIONE – La DNA – La DNA polimerasi può iniziare la replicazione solo partendo da polimerasi può iniziare la replicazione solo partendo da primers o inneschi.primers o inneschi.

SPECIFICITÀ DEI PRIMERSSPECIFICITÀ DEI PRIMERS – Sequenze di 20-25bp – Sequenze di 20-25bp consentono di amplificare una sequenza unica nel consentono di amplificare una sequenza unica nel genoma umano.genoma umano.

UNICA DIREZIONE DI POLIMERIZZAZIONEUNICA DIREZIONE DI POLIMERIZZAZIONE – La DNA – La DNA polimerasi è in grado di replicare il DNA soltanto in polimerasi è in grado di replicare il DNA soltanto in direzione 5’-3’.direzione 5’-3’.

DNA POLIMERASI TERMOSTABILIDNA POLIMERASI TERMOSTABILI – Le Taq polimerasi – Le Taq polimerasi sono in grado di resistere alla temperatura di sono in grado di resistere alla temperatura di denaturazione del DNA (>90°C) senza degradarsi.denaturazione del DNA (>90°C) senza degradarsi.

LA “POLIMERASE CHAIN LA “POLIMERASE CHAIN REACTION” (PCR)REACTION” (PCR)

LA “POLYMERASE CHAIN LA “POLYMERASE CHAIN REACTION” (PCR)REACTION” (PCR)

UN “CICLO” DI PCR E COMPOSTO DA TRE “STEP”

-DENANTURAZIONE-ANNEALING-ESTENSIONE

COME SI “LEGGE” IL DNA?COME SI “LEGGE” IL DNA?• Il principio della Il principio della PCR PCR è utilizzato per “leggere” è utilizzato per “leggere”

una specifica sequenza.una specifica sequenza.• La reazione sfrutta la presenza di speciali La reazione sfrutta la presenza di speciali

nucleotidi detti dideossinucleotidi.nucleotidi detti dideossinucleotidi.

COME SI “LEGGE” IL DNA?COME SI “LEGGE” IL DNA?

I I dideossinucleotididideossinucleotidi sono legati ad un sono legati ad un fluorocromofluorocromo, una , una molecola che eccitata da un laser è in grado di molecola che eccitata da un laser è in grado di emettere una luce colorataemettere una luce colorata

COME SI “LEGGE” IL DNA?COME SI “LEGGE” IL DNA?

L’interruzione casuale della polimerizzazione genera L’interruzione casuale della polimerizzazione genera frammenti di diversa lunghezza ognuno dei quali è frammenti di diversa lunghezza ognuno dei quali è “marcato” da un fluorocromo diverso.“marcato” da un fluorocromo diverso.

COME SI “LEGGE” IL DNA?COME SI “LEGGE” IL DNA?

COME SI “LEGGE” IL DNA?COME SI “LEGGE” IL DNA?

LIVELLI DI INTERVENTO LIVELLI DI INTERVENTO SUL DNASUL DNA

SOSTITUZIONE O INATTIVAZIONE DI

UN GENE ENDOGENO

MUTATO

RIPRISTINO DI UNA RIPRISTINO DI UNA FUNZIONE FUNZIONE

ORIGINARIAORIGINARIA

INTRODUZIONE DI UNA O PIU’ COPIE DI

UN GENE

ENDOGENO FUNZIONANTE

POTENZIAMENTO DI POTENZIAMENTO DI UNA FUNZIONE UNA FUNZIONE

ORIGINARIAORIGINARIA

INTRODUZIONE DI UN GENE ESOGENO

ATTIVAZIONE DI UNA ATTIVAZIONE DI UNA

NUOVA FUNZIONENUOVA FUNZIONE

COME INSERIRE DNA IN COME INSERIRE DNA IN UNA CELLULAUNA CELLULA

VIENE ISOLATA LA SEQUENZA DI DNA CHE SI INTENDE INSERIRE NELLA CELLULA OSPITE

VIENE INDIVIDUATO UN VETTORE IDONEO, CIOÈ UNA SEQUENZA DI DNA IN GRADO DI PERMETTERE L’INSERIMENTO DEL DNA TRASPORTATO NEL GENOMA DELLA CELLULA OSPITE

VIENE COSTRUITA UNA MOLECOLA DI DNA RICOMBINANTE, CIOÈ FORMATA DAL DNA VETTORE E DAL DNA DEL GENE DA INSERIRE

L’INSERIMENTO DEL DNA NELLA L’INSERIMENTO DEL DNA NELLA CELLULA: FASI E PROBLEMATICHECELLULA: FASI E PROBLEMATICHE

DIFFICOLTÀ NELL’ISOLAMENTO DEL GENE INDIVIDUATO ALL’INTERNO DI UN GENOMA COMPLESSO

ISOLAMENTO GENI IDONEI

CARATTERIZZAZIONE DI VETTORI SELETTIVI PER GLI SPECIFICI TIPI CELLULARI DA COLPIRE

UTILIZZAZIONE VETTORI IDONEI

LA PERCENTUALE DI CELLULE CHE INCORPORANO IL DNA NEL GENOMA È BASSO

INCORPORAZIONE DNA NEL GENOMA OSPITE

METTERE IL GENE INSERITO IN CONDIZIONI DI ESPRIMERSI SOLTANTO NELLE CELLULE DOVE LA SUA FUNZIONE È RICHIESTA

ESPRESSIONE MIRATA DEL GENE INSERITO

GENE SELETTOREGENE SELETTORE

PROCARIOTI - VETTORI DI PROCARIOTI - VETTORI DI CLONAGGIOCLONAGGIO

PROCARIOTI - SELEZIONEPROCARIOTI - SELEZIONE

X-galX-gal

ampamp

PROCARIOTI - APPLICAZIONIPROCARIOTI - APPLICAZIONI

Kary Mullis, premio Nobel per la chimica 1993Kary Mullis, premio Nobel per la chimica 1993

•In una famosa intervista si domandò retoricamente se avrebbe mai scoperto il PCR se non avesse assunto LSD, concludendo che ne dubitava seriamente, in quanto poteva letteralmente veder lavorare i singoli polimeri e ammettendo di avere imparato parecchio grazie a tale esperienza.

•Sostiene che "la scienza dei media è una fesseria" per finire addirittura con l'ipotesi di essere stato rapito dagli alieni; gli accadde una notte del 1985, in un bosco nei pressi di Mendocino County in California.

James Dewey Watson, premio Nobel per la Medicina James Dewey Watson, premio Nobel per la Medicina 19621962

Nell'ottobre 2007 The Independent pubblicava una sua dichiarazione secondo la quale «I neri sono meno intelligenti dei bianchi» e che l'idea che «l'eguaglianza della ragione condivisa da tutti i gruppi razziali si è rivelata una delusione», tanto che «chi ha a che fare con dipendenti di colore pensa che questo non sia vero».

Neanche due giorni dopo, nella tempesta delle innumerevoli prese di distanza e dopo diverse collaborazioni scientifiche e divulgative andate in fumo, Watson ritratta, affermando che le sue dichiarazioni non poggiavano su alcuna base scientifica e non riusciva nemmeno a rendersi conto di come avesse potuto affermare tali sciocchezze.

Trascorsi poco meno di due mesi dalla dichiarazione, il genoma di James Watson è stato reso pubblico, dietro sua esplicita richiesta, ed è risultato avere 16 volte più geni di origine "nera" nel proprio Dna rispetto al bianco medio occidentale. Ciò significa, con tutta probabilità, che un suo bisnonno o trisavolo era di origine africana.