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Indice

1. Introduzione ..................................................................................................................................... 5

1.1. Aspetti generali della funzionalità renale ................................................................................. 5

1.1.1. Struttura del rene dei Mammiferi ....................................................................................... 6

1.1.2. Sviluppo e nefrogenesi del rene di Mammiferi .................................................................. 9

1.2. Sviluppo e nefrogenesi del rene di Zebrafish .......................................................................... 10

1.2.1. Basi molecolari dello sviluppo del pronefro in Zebrafish ................................................ 15

Ret1 ............................................................................................................................................ 19

Gata3 .......................................................................................................................................... 19

Slc12a1 ....................................................................................................................................... 20

Trpm7 ......................................................................................................................................... 21

1.3. Eme ed ematopoiesi ................................................................................................................ 22

1.3.1 Malattie renali ed ematopoietiche ..................................................................................... 25

1.4. I geni Soul ............................................................................................................................... 27

1.5. Zebrafish come sistema modello nella ricerca ........................................................................ 28

1.5.1 Zebrafish: sviluppo embrionale ........................................................................................ 30

2. Materiali e metodi .......................................................................................................................... 33

2.1. Nomenclatura .......................................................................................................................... 33

2

2.2. Analisi delle sequenze proteiche ............................................................................................. 33

2.3. Sintesi degli oligonucleotidi .................................................................................................... 33

2.4. Preparazione di RNA totali da embrioni e tessuti di Zebrafish ............................................... 33

2.5. Sintesi del cDNA .................................................................................................................... 34

2.6. Amplificazione mediante PCR ................................................................................................ 34

2.7. Clonaggio di soul1 in pBluescript SK- vector ........................................................................ 36

2.8. Clonaggio di soul2 pCR® II-TOPO® ....................................................................................... 38

2.9 Clonaggio di soul3 e soul4 ...................................................................................................... 40

2.10. Trasformazione di DNA plasmidico in cellule batteriche mediante elettroporazione .......... 40

2.11. PCR colony ........................................................................................................................... 41

2.12. Maxipreparazione di DNA plasmidico ................................................................................. 42

2.13. Sequenziamento del DNA plasmidico .................................................................................. 43

2.15. Quantizzazione delle sonde a RNA ...................................................................................... 46

2.16. Preparazione degli animali .................................................................................................... 46

2.17. Ibridazione in situ .................................................................................................................. 47

2.18. RT-PCR ................................................................................................................................. 48

2.19. Microiniezioni di oligonucleotidi antisenso (morfolino) in uova fecondate ........................... 48

2.20. Clonaggio e sintesi di sonde di marcatori ematopoietici e renali ......................................... 50

2.21. Iniezione del morfolino gata1 in uova fecondate .................................................................. 51

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2.22. Clonaggio di soul1 in pEGFP/N1 per mRNA ....................................................................... 52

2.23. Clonaggio di soul1 nel vettore pCS2+ per mRNA ............................................................... 53

2.24. Clonaggio di soul2 nel vettore pCS2+GFP per mRNA ........................................................ 54

2.25. Clonaggio di soul2-FlagTag nel vettore pCS2+ per transfezione e mRNA .......................... 55

2.26. Transfezione di soul2-Flag-pCS2+ in cellule epiteliali umane 293T ................................... 56

2.27. Immunofluorescenza su cellule ............................................................................................. 56

2.28. Immunoprecipitazione e spettrometria di massa ................................................................... 57

2.29. Colorazione dell’emoglobina embrionale con benzidina ...................................................... 57

2.30. Esposizione degli embrioni a succinil acetone ..................................................................... 58

2.31. Purificazione di proteine ....................................................................................................... 58

2.32. Saggio Elisa ........................................................................................................................... 59

2.33. Analisi mediante Western blotting ........................................................................................ 59

2.34. Immunoistochimica ............................................................................................................... 60

2.35. Apoptosi ................................................................................................................................ 60

Tabelle delle soluzioni ....................................................................................................................... 62

3. RISULTATI .................................................................................................................................... 69

3.1. Analisi delle sequenze degli ortologhi soul1, soul2, soul3 e soul4 di Zebrafish .................... 69

3.2. Analisi dell'espressione degli ortologhi soul durante lo sviluppo di Zebrafish ...................... 78

3.2.1. Profilo di espressione di soul1 ......................................................................................... 78

4

3.2.2. Profilo di espressione di soul2 ......................................................................................... 82

3.2.3. Analisi dell'espressione di soul3 e soul4 ............................................................................ 85

3.3. Espressione del gene soul2 nei morfanti ematopoietici .......................................................... 88

3.4. Studi di gain-of-function mediante iniezione di mRNA ......................................................... 90

3.5. Studi di loss-of-function mediante iniezione di morfolino ..................................................... 92

3.6. Rescue mediante co-iniezione di morfolino ed mRNA .......................................................... 96

3.7. Effetti del morfolino sulla produzione di emoglobina ............................................................ 96

3.8. Esposizione farmacologia degli embrioni al succinil acetone ................................................ 99

3.9. Localizzazione e funzione del gene soul2 ............................................................................. 100

3.10. Immunoprecipitazione della proteina soul2 ........................................................................ 102

4. Discussione .................................................................................................................................. 103

5. Bibliografia: ................................................................................................................................. 109

5

1. Introduzione

1.1. Aspetti generali della funzionalità renale

La cellula vivente può essere paragonata a una minuscola fabbrica che richiede un

costante afflusso di materie prime e lo smaltimento continuo di sostanze di rifiuto,

alcune delle quali risulterebbero tossiche a concentrazioni elevate. Molti rifiuti

organici sono rimossi ed escreti dall'apparato urinario. Quest'ultimo svolge diverse

funzioni, tra cui l’eliminazione dei prodotti organici di scarto, specialmente i

rifiuti azotati come l'urea e l'acido urico, la regolazione della concentrazione

plasmatica di sodio, potassio, cloro, calcio ed altri ioni che vengono eliminati con

le urine, e della pressione arteriosa attraverso il controllo dell'acqua persa con le

urine, la liberazione di ormoni come l'eritropoietina (che stimola la produzione di

globuli rossi) e la renina. Inoltre il rene contribuisce alla regolarizzazione del pH

ematico, conserva nutrienti preziosi, come il glucosio e gli amminoacidi, che non

vengono eliminati con le urine e collabora con il fegato nell'opera di

disintossicazione dai veleni. Il sangue trasporta l'ammoniaca al fegato dove viene

trasformata in urea, una sostanza molto meno tossica. I reni filtrano dal sangue

l'urea che viene eliminata con l'urina, un liquido contenente acqua in cui sono

disciolte sostanze di rifiuto e una parte dei nutrienti in eccesso (Fig. 1).

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Fig. 1

1.1.1. Struttura del rene dei Mammiferi Nei mammiferi esistono due reni, in forma di organi ghiandolari compatti, situati

nello spazio retro peritoneale, fra i muscoli del dorso e la fascia peritoneale.

Ciascun rene ha la forma di un fagiolo, con una parte depressa detta ilo, situata in

corrispondenza del margine mediale. Il rene a sviluppo completo presenta due

facce, anteriore e posteriore, due margini, laterale e mediale, e due poli, superiore

e inferiore. La superficie dell’organo è ricoperta da una densa capsula fibrosa, che

ripiega verso l’interno dell’ilo per delineare una cavità interna detta seno renale. I

vasi renali e l'uretere fuoriescono dal rene attraverso l'ilo. Il rene può essere

suddiviso in una parte esterna, la corticale, ed una più interna, la midollare.

Quest’ultima contiene da 6 a 18 strutture coniche dette piramidi, le cui estremità,

le papille, si aprono nel seno renale. La sostanza corticale si sistema anche tra le

piramidi a costituire le cosiddette colonne renali. All’interno del seno renale si

trovano i calici minori in numero pari a quello delle piramidi. Ciascun calice

minore ha la forma di un imbuto che circonda la papilla renale. I calici minori

confluiscono in tre calici maggiori che fanno capo al bacinetto renale al quale si

collega l'uretere (Fig. 2).

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Fig. 2 Sezione del rene

L'unità funzionale del rene è il nefrone costituito dal corpuscolo renale e da un

tubulo, differenziato in sezioni successive, e che si immette nei tubuli collettori.

I corpuscoli renali costituiscono formazioni sferiche delle dimensioni di 0,2-0,3

mm, prevalentemente costituita da una rete capillare a gomitolo, il glomerulo,

attraverso il quale la parte liquida del sangue viene filtrata da una struttura a forma

di calice, la capsula di Bowman, che raccoglie il filtrato e rappresenta l'inizio a

fondo cieco del sistema tubolare. Nel corso dell'evoluzione questa parte, che

costituisce con il tubulo contorto prossimale, si è dilatata e ha circondato il

glomerulo. Ne è risultata una struttura dotata di doppia parete, il cui foglietto

interno è strettamente in rapporto con l'endotelio capillare del glomerulo. Le

cellule epiteliali di tale strato della capsula di Bowman si sono trasformate nei

tipici podociti (cellule fornite di pedicelli), tra i cui prolungamenti, l'acqua e le

piccole molecole solubili vengono filtrate dal glomerulo passando quindi nel

sistema tubolare. Il liquido filtrato è denominato filtrato glomerulare o preurina. Il

corpuscolo renale possiede, quindi, un polo vascolare nell'unico punto che non

risulta circondato dalla capsula di Bowman (sbocco e origine dei vasi afferenti ed

efferenti) nonché un polo urifero situato sul lato opposto, che costituisce l'inizio

del sistema tubolare e che comunica con lo spazio compreso tra i foglietti parietale

e viscerale della capsula, detto camera glomerulare. Il sangue, rimasto

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nell'arteriola efferente dal glomerulo, a questo punto è molto "concentrato",

contenendo una modesta quantità di acqua con relativi soluti e particelle troppo

voluminose per superare la barriera delle pareti dei capillari, come globuli rossi e

bianchi, grosse proteine e goccioline di grasso. Oltre il glomerulo l'arteriola

efferente si ramifica nuovamente in altri capillari, che si attorcigliano e si

intrecciano in una rete attorno al tubulo, consentendo il riassorbimento dal filtrato

delle sostanze utili, che vengono re-immesse nel circolo sanguigno; le sostanze di

rifiuto, invece, rimaste nel sangue dopo la filtrazione, vengono trasferite nel

filtrato per essere eliminate (Fig. 3).

Fig. 3 Corpuscolo renale (sx) e nefrone (dx)

Il tubulo renale in direzione prossimo distale comprende il tubulo prossimale,

l'ansa di Henle (che discende nella sostanza midollare) ed infine il tubulo distale,

che si immette nel dotto collettore. Attraverso i capillari glomerulari circa 200 Lt

di filtrato glomerulare raggiungono giornalmente la camera glomerulare ed il 99%

di tale liquido deve rientrare nel torrente sanguigno. Il nefrone, infatti, restituisce

al sistema circolatorio i materiali utili e quasi tutta l'acqua, trattenendo le scorie

che dovranno essere eliminate. Tale compito è affidato ai tubuli renali e si realizza

tramite due meccanismi: il riassorbimento tubolare e la secrezione tubolare.

Durante il primo meccanismo, le cellule del tubulo prossimale riassorbono

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normalmente il 60% del volume di filtrato prodotto nel corpuscolo renale. Il sodio

viene assunto attivamente, in un processo che comporta dispendio di energia;

dalle cellule tubolari, viene trasportato attraverso il citoplasma e rilasciato sul

versante opposto in corrispondenza della membrana basale dove viene immesso

nei capillari peritubulari. Il trasporto attivo del sodio è centrale rispetto a tutti gli

altri meccanismi di riassorbimento: con la fuoriuscita del sodio dal lume si

stabilisce una differenza di pressione osmotica fra lume e sangue, cui segue una

fuoriuscita di acqua dal lume tubulare. Il trasporto attivo del sodio è allo stesso

tempo il presupposto per il riassorbimento degli zuccheri, degli amminoacidi e di

altre sostanze organiche, in quanto questi elementi possono penetrare nella cellula

solo se legati ad esso.

Durante la secrezione tubulare, la composizione ed il volume del filtrato cambiano

sostanzialmente nel tragitto dallo spazio capsulare al tubulo contorto distale. Circa

il 60% di acqua ed il 65% dei soluti sono riassorbiti ed un altro 29% di acqua e

25% di sostanze disciolte, soprattutto ioni sodio e cloro, penetrano nel liquido

peritubulare della midollare lungo l'ansa di Henle. Il riassorbimento selettivo o la

secrezione, in particolare lungo il tubulo contorto distale, mettono a punto poi

l'aggiustamento definitivo della composizione del filtrato. La filtrazione non

sospinge tutte le sostanze disciolte fuori dal plasma, ed il sangue circolante nei

capillari peritubulari contiene ancora una certa quantità di sostanze

potenzialmente pericolose. In genere la loro presenza non è significativa, perché le

restanti concentrazioni sono troppo basse per determinare problemi fisiologici. Se

la concentrazione di ioni o componenti specifici nei capillari peritubulari resta

troppo elevata, i tubuli possono attivare una secrezione attiva di queste sostanze

all'interno del filtrato. Maggiore è la concentrazione, maggiore sarà la secrezione.

1.1.2. Sviluppo e nefrogenesi del rene di Mammiferi

Durante lo sviluppo dei vertebrati superiori si formano, in successione cranio-

caudale, a partire dal mesoderma intermedio (IM) tre abbozzi renali: il pronefro, il

rene più anteriore e primitivo; il mesonefro, il rene embrionale dei mammiferi e

definitivo di pesci e anfibi; e il metanefro, il rene definitivo di mammiferi e

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uccelli. Ciascun rene è costituito dai nefroni che condividono tre parti: un

glomerulo per la filtrazione del sangue, un tubulo che riassorbe e secerne soluti, ed

un dotto collettore che trasporta il filtrato modificato all’esterno. Nei mammiferi e

negli altri amnioti, il pronefro e il mesonefro esistono come strutture transienti:

una serie di nefrotomi costituiti dalle cellule mesenchimali a livello dei somiti

cervicali formeranno il pronefro, mentre quelli del tratto toraco-lombare

formeranno il mesonefro. Mentre il pronefro costituisce un organo che non è mai

funzionante nei mammiferi, il mesonefro funziona durante la vita fetale. Tuttavia,

entrambe le strutture involvono nel corso dello sviluppo, per essere sostituite dal

metanefro. Il metanefro si forma all’estremità caudale del dotto mesonefrico, da

un’evaginazione nota come gemma ureterica, che interagisce con il mesenchima

metanefrico adiacente ed è sottoposto a un elaborato processo di ramificazione

morfogenetica (Dressler, 2006). Questa ramificazione della gemma ureterica,

genera un sistema di dotti collettori all’interno del mesenchima metanefrico, nel

quale in conseguenza alcune cellule si aggregano e subiscono una conversione

epiteliale per formare delle vescicole che, successivamente, si svilupperanno in

nefroni. Le rimanenti cellule mesenchimali metanefriche costituiranno una

popolazione stromale con un ruolo essenziale durante la regolazione della

ramificazione della gemma ureterica. La conseguente proliferazione e

l’allungamento delle vescicole metanefriche darà vita a una struttura tubulare a

forma di “S”, che si modellerà lungo il proprio asse prossimo-distale per generare

la capsula di Bowman con i podociti, a livello del glomerulo, seguita da un

tubulare con un epitelio differenziato in segmenti ben specializzati. Questi

segmenti includono i tubuli convoluti prossimali e distali; i rami ascendente e

discendente, e l’ansa di Henle (nota anche come tubulo intermedio). L’estremo

distale di questo tubulo si immette in tubuli collettori derivati dalla gemma

ureterica e quindi nel dotto collettore (Hebert et al., 2001; Reilly et al., 2000;

Jacobson, 1981).

1.2. Sviluppo e nefrogenesi del rene di Zebrafish

Nei vertebrati inferiori, come pesci e anfibi, il rene pronefrico è funzionale e

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comprende un paio di nefroni bilaterali che derivano dai nefrotomi del pronefrio e

funzionano durante la vita embrionale e larvale. Il mesonefro si sviluppa solo più

tardi, durante la vita larvale, con la formazione di più nefroni indotti dal

mesenchima mesonefrico e che costituiscono il rene definitivo. In particolare,

durante lo sviluppo embrionale dei pesci si forma un unico rene, costituito da due

nefroni che derivano dalle due componenti bilaterali del mesoderma intermedio

pronefrico (Drummond, 2003; Drummond et al., 1998). Le cellule anteriori danno

vita ai podociti che migrano verso la linea centrale e reclutano le cellule

endoteliali per formare un unico glomerulo vascolarizzato comune ai due nefroni

(Drummond et al., 2003; Drummond et al., 1998; Serluca et al., 2001; Majumdar

et al., 1999; Majumdar et al., 2000). Il restante mesoderma intermedio subisce una

transizione mesenchimale - epiteliale per formare un epitelio tubulare che si fonde

con la cloaca, comune sia all’intestino sia al pronefro per eliminare i prodotti di

rifiuto all’esterno (Zhou et al., 2005; Hostetter et al., 2003; Drummond et al.,

1998). L’analisi dei tipi cellulari differenziati nel pronefro dei pesci ha mostrato

molte similitudini con quelle del metanefro dei mammiferi. Le cellule endoteliali

di tipo vascolare sono fenestrate e i podociti sono simili a quelli del rene dei

mammiferi (Drummond, 2003; Drummond et al., 1998). Queste caratteristiche

insieme alla semplicità di organizzazione del tubulo, ha reso il rene dei pesci, un

ottimo modello per lo studio della fisiologia e dei disordini renali.

Nello Zebrafish, il primordio pronefrico inizia a essere evidente durante la

somitogenesi iniziale come una massa del mesoderma intermedio che si estende

sotto il secondo e il terzo somite (Kimmel et al., 1995). Da questa posizione su

entrambi i lati dell’embrione, i dotti pronefrici sviluppano in direzione caudale.

Dalle 24 hpf (hours post fertilization), i dotti sono costituiti da tubuli epiteliali

aperti, che si fondono caudalmente e confluiscono fuori dall’embrione attraverso

l'apertura urogenitale. Studi morfologici in diverse specie di pesci suggeriscono

che i primordi del nefrone siano presenti nella porzione rostrale dei dotti

pronefrici e che diano origine ai glomeruli e ai tubuli pronefrici (Armstrong,

1932; Newstead and Ford, 1960; Agarwal and John, 1988; Tytler et al., 1996). Il

pronefro di un embrione di Zebrafish di 2 – 3 giorni è relativamente semplice ed è

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costituito da una coppia di nefroni, uniti all'estremità anteriore da un glomerulo

centrale deputato alla filtrazione del sangue. Nonostante la forma semplice, il

glomerulo pronefrico è composto di tipi cellulari caratteristici dei reni nei

vertebrati superiori, includendo, cellule endoteliali fenestrate in ciuffi capillari e

podociti con processi estesi a formare una sorta di reticolo attorno ai capillari.

I tubuli pronefrici collegano il glomerulo ai dotti pronefrici che si estendono

caudalmente e si fondono poco prima del loro contatto con la cloaca. Il rene

pronefrico si forma attraverso una serie di passaggi che comprendono l'addizione

sequenziale di questi tre elementi: i primi a formarsi sono i dotti pronefrici il cui

sviluppo si completa dopo 24 hpf. I tubuli si differenziano leggermente più tardi

tra le 30 e le 40 hpf, mentre il glomerulo comincia a filtrare il sangue a partire

dalle 48 hpf. A 72 hpf è possibile osservare l’intero sistema renale pronefrico

(Fig. 4).

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Fig. 4 Pronefro di Zebrafish

Allo stadio di 24 hpf il primordio del nefrone, posizionato ventralmente al terzo

somite (Fig. 5A,B), appare come una piega dell’epitelio celomico, con un'apertura

ben visibile (Fig. 5A). Quest'apertura verso il celoma potrebbe essere considerata

l’equivalente del nefrostoma, già osservato in altre specie di pesci e nel pronefro

maturo degli anfibi (Goodrich, 1930; Armstrong, 1932). In sezioni sagittali, il

primordio del nefrone pronefrico appare come un gruppo di cellule a forma di

disco in cui non sono morfologicamente evidenti tubuli o glomeruli (Fig. 5B).

L’esterno anteriore dei dotti pronefrici è adiacente ai margini laterali dei primordi

del nefrone (Fig. 5B). Dalle 32 – 33 hpf, la separazione dal celoma è completa e il

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primordio del nefrone appare come un gruppo di cellule distinte e separate, senza

alcuna connessione con la cavità del corpo (Fig. 5C,D), organizzate in una serie di

vescicole. I primi segni morfogenetici di un rene pronefrico sono costituiti dalla

presenza nel primordio di domini laterali e mediali nelle regioni che costituiranno

i futuri tubuli e glomeruli (Fig. 5D). A 40 hpf, è finalmente evidente la distinzione

morfologica tra le cellule della linea mediana e quelle che si estendono più

lateralmente, adiacenti all’estremo anteriore del dotto pronefrico (Fig. 5E). Le

cellule della regione si organizzano in una struttura a fondo cieco o capsulare,

mentre le cellule laterali cominciano ad assumere la forma tipica dei tubuli

pronefrici (Fig. 5E). La porzione a fondo cieco costituisce le presuntive cellule

della capsula che appaiono in stretto contatto con il presuntivo glomerulo e la

sovrastante aorta dorsale (Fig. 5G). Dalle 50 hpf, le superfici mediali dei due

primordi glomerulari si sono fuse sulla linea mediana mentre i due tubuli

pronefrici, che li abbracciano, si collegano ai dotti pronefrici bilaterali. Dalle 60

hpf (Fig. 5I) in poi (Fig. 5J), la formazione del nefrone è praticamente completa e

la connessione diretta tra la capsula di Bowman e il lumen dei tubuli pronefrici è

evidente.

15

Fig. 5 Morfologia del pronefro

Da quest’analisi istologica è facilmente deducibile che dopo la separazione dei

due nefroni primordiali dal celoma, ciascun nefrone pronefrico si differenzia come

un gruppo integrato di cellule a formare un sistema pronefrico chiuso, con un paio

di tubuli bilaterali che andranno a unirsi direttamente con i glomeruli.

1.2.1. Basi molecolari dello sviluppo del pronefro in Zebrafish

La scoperta di meccanismi molecolari che controllano lo sviluppo renale è stata

possibile attraverso l’identificazione di una serie di geni, tra cui 15 trasportatori di

soluti, espressi in specifiche regioni del pronefro di Zebrafish, a partire dallo

stadio di 5 somiti fino alle 144 hpf (Wingert et al., 2007). Questo ha permesso la

visualizzazione di 8 regioni distinte del pronefro, con alcuni geni espressi in più di

una regione. Molti di questi geni sono risultati ortologhi di geni espressi nel

metanefro dei mammiferi, e, inoltre, rappresentano definiti segmenti del nefrone.

16

Ad esempio slc9a3 è espresso nei podociti e nel segmento convoluto (PCT) e

dritto (PST) prossimale (Fig. 6) (Biemesderfer et al., 1993); slc20a1 è espresso in

tutto l’epitelio del nefrone, anche se in maniera più rilevante nel tubulo

prossimale. Trascritti di slc13a3 sono osservabili nel PST (Chen et al., 1999),

mentre l'attività del gene slc12a1 è ristretta alla macula densa (MD) (Nielsen et

al., 1998; Schmitt et al., 1999). Il gene slc12a3 è espresso nel tubulo convoluto

distale (PST) (Schmitt et al., 1999) e gata3 marca specificamente il dotto

collettore (CD). Attraverso questo confronto tra geni espressi nei mammiferi e

Zebrafish, è stato possibile rinominare i segmenti del pronefro, partendo dalla

regione prossimale a quella distale, in: podociti (pod), collo (N), tubulo convoluto

prossimale (PCT), tubuli prossimali retti (PDT), tubulo distale precoce (DE),

corpuscolo di Stannius (CS), tubulo distale tardivo (DL) e dotto pronefrico (PD)

(Fig. 6).

Fig. 6 Segmentazione del pronefro di Zebrafish

La divisione del tratto iniziale del tubulo in PCT e PST è basata sull’espressione

di slc20a1a nelle cellule del PCT, la cui morfogenesi trasforma, a partire dai 5

giorni dopo la fecondazione (dpf), l'iniziale tubo lineare in una struttura a forma di

spirale, mentre l’espressione di trpm7 e slc13a1 nel segmento PST ne evidenzia la

struttura lineare. Inoltre, l’espressione discontinua di trpm7 e slc13a1 nel PST

suggerisce la presenza di due tipi cellulari: cellule multiciliate ed epitelio di

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trasporto (Ma et al., 2007; Lyu et al, 2007).

Tra le 24 e le 48 hpf, quando ha inizio la filtrazione del sangue, i pronefri sono

sottoposti a una significativa riorganizzazione morfogenetica, con la migrazione

verso la linea mediana dei podociti e la crescita ed allungamento dei tubuli

(Drummond, 2003). A 24 hpf, i progenitori dei podociti e del collo sono disposti

in un’esile curva a livello del terzo-quarto somite, con il limite anteriore del

tubulo convoluto prossimale a livello del quinto somite. Dalle 48 hpf, i progenitori

dei podociti si fondono alla linea mediana, a livello del terzo somite, e la

presuntiva regione del collo, che forma un estensione laterale, si collega con il

tubulo convoluto prossimale, situato anch'esso a livello del terzo somite. Durante

questo tempo, la lunghezza dei segmenti, costituiti dai tubuli convoluti e dritti

prossimali e del tubulo precoce distale, aumenta, probabilmente a causa della

divisione cellulare di ciascun segmento. Questa crescita potrebbe essere la fonte di

forza responsabile dello slittamento dal quinto al terzo somite del limite anteriore

del tubulo convoluto prossimale, tra le 24 e le 48 hpf, e della formazione del

groviglio morfogenetico del tubulo convoluto prossimale tra le 72 e le 144 hpf. Al

contrario, il segmento del tubulo precoce distale non subisce variazioni di

lunghezza tra le 24 e le 48 hpf, ad indicare che non ci sono espansioni uniformi di

tutti i segmenti durante lo sviluppo. Dopo le prime due, tre settimane, il tubulo

tardivo distale si presenta proporzionalmente più largo degli altri segmenti,

suggerendo che la sua espansione è predominante negli stadi più tardivi dello

sviluppo. E' interessante notare che, a 24 hpf, la sovrapposizione del tubulo

tardivo distale e del dotto pronefrico a livello del diciassettesimo somite, indica la

presenza di un ulteriore segmento, probabile equivalente del dotto collettore dei

mammiferi (Fig. 7), (Wingert et al., 2007).

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Fig. 7 Espressione genica del pronefro di Zebrafish e del metanefro dei

mammiferi

Al fine di mappare i cambiamenti morfologici tra le 24 e le 48 hpf, sono stati

analizzati i diversi livelli di espressione di alcuni geni all’interno dei vari

segmenti. E' stato così dimostrato che, ad esempio, alcuni trasportatori di soluti,

come, slc13a1 (inorganic sulphate transporter), slc13a3 (sodium-dicarboxylate

carrier) e slc22a6 (organic anion transporter) non sono espressi prima delle 48hpf;

che trpm7 (divalent cation-selective ion channel) e slc41a1 (Mg 2þ transporter)

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iniziano a marcare le cellule del CS a 48 hpf. Queste osservazioni evidenziano

come la maturazione degli epiteli dei segmenti avvenga solo in seguito all'inizio

della filtrazione del sangue, in Zebrafish intorno alle 40 hpf (Drummond et al.,

1998; Majumdar et al., 2000), e ben prima che il glomerulo sia completamente

maturo (4 dpf).

Di seguito sono descritti alcuni geni nefrogenici ed ematopoietici utilizzati come

marcatori in questo studio:

Ret1

Il gene c-ret proto-oncogene è un membro della superfamiglia dei recettori

tyrosine kinase che gioca un ruolo essenziale durante lo sviluppo del sistemo

escretorio e del sistema nervoso enterico e autonomo dei mammiferi. Il recettore

ret possiede un dominio ricco in cisteina nella regione C-terminale del dominio

extracellulare e 23 cisteine residue che sono conservate in Zebrafish.(Gutiérrez et

al., 1997). La funzione del locus c-ret è stata studiata nei vertebrati inferiori e il

suo omologo ret1 è stato isolato in Zebrafish. Il profilo di espressione durante

l'embriogenesi ha mostrato la presenza dell'mRNA del gene ret1 durante la

somitogenesi iniziale in quello che è il presunto sistema nervoso, nella corda

spinale e nel sistema escretorio. Questi dati hanno rivelato una sostanziale

similitudine di espressione di c-ret nei vertebrati superiori e inferiori che ha

suggerito che la funzione di questo locus è conservata nell'evoluzione dei

vertebrati. Bisgrove et al. (1997) hanno individuato l'espressione del trascritto di

c-ret in numerosi tessuti, incluso i motoneuroni spinali, i dotti pronefrici, i gangli

craniali, gli archi faringei e il sistema nervoso enterico durante lo sviluppo di

Zebrafish. C-ret gioca un ruolo importante nella specificazione delle cellule CaP e

del destino cellulare a partire dall'espressione di geni cellule specifici come islet2.

Gata3

Il fattore di trascrizione gata3 è uno dei sei membri di una famiglia di fattori di

trascrizione che lega il motivo consenso A/TGATAA/G e che regola i passi critici

del differenziamento durante lo sviluppo embrionale (Tsai et al., 1994; Pandolfi et

20

al., 1995; Kuo et al., 1997). Gata3 è prevalentemente espresso nei precursori delle

cellule linfoidi ed è implicato nel differenziamento dei linfociti T. Esperimenti di

ibridazione in situ su embrioni di uomo e topo, hanno mostrato un'elevata

conservazione di gata3 durante lo sviluppo embrionale. In embrioni di uomo il

trascritto di gata3 è stato osservato a partire dalla quarta settimana di gestazione,

equivalente allo stadio di 8.5 dpc (days post coitum), in cui il gene è stato

ugualmente osservato nel tubo neurale, nell'endoderma dell'intestino e nel dotto di

Wolffian. Grote et al. (2005) hanno inoltre dimostrato che gata3 è un regolatore

chiave della morfologia del dotto nefrico e del passaggio a rene pro/mesonefrico.

In Zebrafish l'omologo di gata3 di topo è stato isolato e il trascritto è stato

osservato nel segmento del PD, regione analoga al dotto collettore di topo in cui il

gene è espresso (Wingert et al., 2007).

Slc12a1

Il trasportatore di soluti slc12a1 è una proteina di membrana che media il

trasporto di sodio, potassio e cloro attraverso la membrana plasmatica ed è rene

specifico. Nei mammiferi è stato individuato sulla membrana apicale dell'ansa di

Henle e nella macula densa. Simon et al. (1996) hanno isolato la forma

predominante di uomo NKCC2 da una libreria di cDNA umano e hanno visto che

si tratta di una proteina di 1,099 amminoacidi che mostra una forte similarità di

sequqnza con NKCC2 di coniglio e ratto (95% e 93%, rispettivamente). Quaggin

et al. (1995) notarono che nel rene dei mammiferi, un co-trasportatore di Na-K-Cl,

precedentemente chiamato NKCC2, media il riassorbimento attivo di sodio

cloride nell'ansa di Henle e che rappresenta il sito di azione di diuretici

clinicamente importante quali la furosenide e la bumetanide. Il gene slc12a1 in

uomo e topo è strutturalmente correlato a un altro co-trasportatore Na-K-Cl,

slc12a2, che diversamente da slc12a1 rene specifico, è espresso in diversi tessuti,

tra cui la membrana basolaterale dell'epitelio secretorio, dove media la secrezione

del cloro. A partire da questi risultati l'ortologo di Zebrafish è stato clonato e

analizzato attraverso esperimenti di ibridazione in situ da cui è emerso che il

trascritto è localizzato nella regione del DE del pronefro di Zebrafish, regione

corrispondente a quella in cui il gene è espresso in topo, suggerendone il grado di

21

conservazione.

Trpm7

Si tratta di un membro della famiglia dei canali potenziali recettori transienti

(TRP) che sono implicati nel controllo dell'entrata del calcio nella cellula. I canali

TRP non mostrano selettività cationica, ma risultano permeabili al Ca2+.

Contrariamente alle altre proteine TRP, TRPM7 permeabilizza i cationi divalenti

come Mg2+ e Ca2+ nella cellula. Il dominio di TRPM7 è strettamente collegato

con il putativo soppressore tumorale, melastatina, suggerendo che la sottofamiglia

TRPM potrebbe essere il più nuovo gruppo con potenziali ruoli nel signaling del

Ca2+, nel controllo della progressione del ciclo cellulare e della motilità cellulare.

La proteina trpm7 è stata isolata anche in Zebrafish e dall'analisi dell'espressione è

stato visto che trpm7 espresso nel rene mesonefrico e inoltre, attraverso l'utilizzo

di mutanti è stato dimostrato che in assenza del gene trpm7 gli embrioni

manifestavano disfunzioni renali.

Hbbe1

Le globine sono proteine dell'eme che legano e trasportano l'ossigeno. Si tratta di

proteine che sono conservate nel corso dell'evoluzione sia nei vertebrati superiori

che in quelli inferiori e negli invertebrati.

Tfr1a

La transferrina, una sieroproteina con due siti di legame per il ferro, è uno dei

maggiori trasportatori di ferro ferrico nel plasma umano ed è necessario per

recapitare il ferro alle cellule eritroidi in crescita e ad altre cellule.

In Zebrafish 2 recettori della transferrina dei mammiferi sono stati identificati ed è

stato dimostrato che il ruolo biochimico della tfr1a di Zebrafish per mediare

l'acquisizione cellulare del ferro è conservata con le trf1s dei mammiferi. Al

contrario, la tfr1b di Zebrafish non è necessaria per l'eritropoiesi. Piuttosto la

funzione della tfr1b è indispensabile per la crescita e lo sviluppo dei tessuti non

ematopoietici nell'embrione. Queste due funzioni insieme equiparano la funzione

22

della singola trf1 dei mammiferi (Wingert et al., 2004).

Gata1

Gata1 è un fattore di trascrizione necessario per il differenziamento eritroideo

terminale ed è stato dimostrato che la sua perdita trasforma i primitivi precursori

sanguigni in cellule mieloidi (Galloway et al., 2005). Inoltre geni eritroidei non

risultano più espressi nei morfanti di gata1.

1.3. Eme ed ematopoiesi

L'eme è un complesso chimico, membro di una famiglia di composti, le porfirine,

che contengono un atomo di ferro. Esso costituisce la parte non proteica di una

serie di proteine, tra cui l’emoglobina, la mioglobina e i citocromi, e deve la sua

importanza proprio al fatto che può legare l’ossigeno, sia in forma molecolare che

in altri composti, grazie alla presenza dell’atomo di ferro. L'importanza dell'eme

dal punto di vista biologico è dovuta alla sua funzione, basata sull’atomo di ferro,

che essendo in grado di legare in maniera irreversibile l’ossigeno, lo utilizza per

trasportare elettroni nella catena respiratoria, per ridurre specie reattive

dell’ossigeno quali catalasi e perossidasi, ma anche semplicemente trasportandolo

nel sangue sottoforma di emoglobina, o immagazzinandolo nei muscoli come

mioglobina. Un gran numero di malattie sono associate alle deficienze degli

enzimi usati nella sua biosintesi.

La sintesi dell'eme ha luogo nel citoplasma e nel mitocondrio della cellula. Il

processo enzimatico che produce l'eme va sotto il nome di sintesi porfirinica e gli

enzimi che ne fanno parte, sono molto conservati tra le varie specie. Nell'uomo,

questa via di sintesi serve quasi esclusivamente a produrre eme; in altre specie

serve anche a produrre sostanze simili come la vitamina B12. La sintesi dell'eme

ha inizio dalla sintesi di acido (delta)-aminolevulinico dall'amminoacido glicina e

dal Succinil-CoA proveniente dal ciclo di Krebs (ciclo dell'acido citrico). L'attività

dell'enzima responsabile di questa reazione (Ala sintetasi) è regolato dal livello

intracellulare di ferro e dalla concentrazione di eme (Fig. 8). Gli organi

principalmente coinvolti nella sintesi dell'eme sono il fegato e il midollo osseo,

23

sebbene tutte le cellule lo richiedano per funzionare bene.

Fig. 8 Biosintesi dell’eme

L’eme viene degradato con un processo enzimatico che porta alla formazione

della bilirubina, un potente agente antiossidante, in particolare quello dei globuli

rossi viene degradato nella milza. Difetti degli enzimi responsabili della sintesi o

della degradazione dell'eme sono responsabili di disordini ereditari o acquisiti, tra

cui anche gravi alterazioni del rene, chiamati porfirie, un gruppo di malattie rare,

per la maggior parte ereditarie, dovute ad un'alterazione dell'attività di uno degli

enzimi che sintetizzano il gruppo eme nel sangue.

Nei vertebrati, le cellule ematopoietiche derivano da cellule staminali

multipotenziabili autorinnovabili la cui specificazione avviene precocemente

durante lo sviluppo del mesoderma ventrale. L’induzione è dipendente da una

cascata di fattori BMP (bone morphogenetic proteins) (Zon et al., 1998). Le

24

cellule risultanti possono avere sia un attività ematopoietica che vascolare.

L’ematopoiesi coinvolge la proliferazione cellulare e il differenziamento che

porterà alla formazione di cellule con diverso destino.

Nello Zebrafish l'ematopoiesi ha luogo durante la gastrulazione precoce, in strisce

bilaterali di mesoderma che convergono nel tronco posteriore e nella coda (Al-

Adhami et al., 1977; Davidson et al., 2004). Queste regioni del mesoderma

parassiale note come Intermediate Cell Mass (ICM) sono corrispondenti al sito di

localizzazione extraembrionale dei progenitori ematopoietici dei vertebrati

superiori. Questa regione contiene almeno 300 pro-eritroblasti che esprimono i

geni necessari alla sintesi dell’eme e delle globine.

A 20 hpf le due componenti mesodermiche si fondono in un’ unica regione

ematopoietica intra-embrionale, localizzata tra la notocorda e l’endoderma, che

contiene due subpopolazioni di progenitori dei globuli rossi esprimenti diversi

markers molecolari: una sub-popolazione più differenziata derivante

dall’ematopoiesi primitiva, che esprime i fattori di trascrizione ematopoietici

gata1, gata2 e scl, che è localizzata nella zona anteriore della ICM (A-ICM), e

una seconda sub-popolazione di precursori eritroidei, che esprime solo gata2 e

scl, localizzata nella ICM posteriore (P-ICM).

Allo stadio di 25 somiti, ha inizio la biosintesi dell’eme nei mitocondri. I

progenitori degli eritrociti embrionali primitivi si sviluppano fino allo stadio di

pro-eritroblasti e sono rilasciati nella circolazione a 48 hpf. Tuttavia, solo le

cellule dell'A-ICM entreranno in circolazione, mentre quelle provenienti dalla P-

ICM rimarranno localizzate nell’aree mesodermiche. I progenitori A-ICM

andranno a insediarsi nelle nicchie ematopoietiche che daranno origine al sangue

definitivo.

Lo sviluppo continua nei cinque giorni successivi, periodo durante il quale queste

cellule sono sottoposte simultaneamente ad una seconda ondata di

differenziamento, da cui si formano gli eritrociti embrionali.

I precursori cellulari che portano all’ematopoiesi definitiva e alle linee di

differenziamento a lungo termine, emergono da un dominio intracellulare che in

Zebrafish corrisponde alla parete ventrale dell’aorta dorsale, mentre nei vertebrati

25

superiori è chiamato AGM (Aorta-Gonad-Mesonephros), le cui cellule staminali

vanno a popolare il fegato e la milza fetali (Davidson et al., 2004) (Fig. 9). Le

prime cellule ematopoietiche compaiono nel pronefro a 4 dpf, si organizzano in

cordoni cellulari che circondano i vasi sanguigni tra i tubuli ed i glomeruli renali.

Con la formazione dei tubuli renali addizionali, comprendenti il mesonefro, la

quantità di tessuto ematopoietico nel rene aumenta (Fig. 9).

Infine il rene mesonefrico dell’animale adulto è attivo per quanto riguarda

l’ematopoiesi, e presenta una complessità cellulare paragonabile al midollo osseo

dei mammiferi.

Fig. 9 Ematopoiesi

1.3.1 Malattie renali ed ematopoietiche

L’omeostasi del ferro è mantenuta dalla regolazione meticolosa dell'assorbimento

di quest’ultimo dall‘intestino. L‘assorbimento del ferro è modulato sia in risposta

al livello del ferro immagazzinato e sia all’ammontare del ferro necessario

all’eritropoiesi. La piccola quota di ferro perduta giornalmente deve essere

ricostituita per mantenere l'omeostasi. Se ciò non avviene, o perché le perdite sono

eccessive, o perché la quantità di ferro assorbita è insufficiente, si sviluppa uno

26

stato di carenza di ferro che, con il tempo, porterà allo sviluppo dell'anemia,

perché senza ferro non può essere prodotta l’emoglobina. Inoltre, si riconoscono

diversi difetti legati al malfunzionamento dei geni delle globine, che danno

origine alla talassemia, malattia molto comune in Italia e nel bacino mediterraneo.

La deficienza di ferro può anche essere provocata da un raro difetto ereditario

nell’assorbimento del ferro, ma i geni responsabili di questa malattia non sono

ancora stati identificati. In condizioni di deficienza del ferro, i precursori degli

eritrociti hanno la priorità nell’utilizzo di quest’ultimo, e la produzione di globuli

rossi continua a discapito degli altri tessuti. L'eritropoiesi sarà limitata quando i

depositi di ferro saranno esauriti (Andrews, 1999 - 2000).

Viceversa il ferro in eccesso lentamente si accumula nell'organismo, in

particolare, nel fegato, e successivamente nei miocardiociti, nelle cellule acinose

del pancreas, determinando l’apparizione di sideroblasti. L'eccesso di ferro è quasi

sempre causata da una tendenza ereditaria ad assimilare troppo ferro. Nel

complesso quadro di meccanismi che intervengono nel trasporto del ferro si

ritiene che al ciclo del ferro legato alla trasferrina (TBI) devono affiancarsi altri

meccanismi di importo ed esporto del ferro non legato alla trasferrina (NTBI).

Infatti topi ipotrasferrinici, e umani atrasferrinici, hanno dei disturbi severi

nell’ematopoieisi ma sono comunque vitali. L’NTBI è di solito presente in livelli

importanti negli organismi che presentano un sovraccarico di ferro. In questo caso

l‘eritropoiesi continua normalmente (Andrews, 1999 - 2000). Esistono anche

difetti a carico dell'eme, che si realizzano in una malattia che va sotto il nome di

porfiria (Wang et al., 1998).

Una delle malattie genetiche umane che colpisce fino a 1000 individui l'anno, in

particolare negli USA, è quella del rene policistico (Calvet et al., 2001). Le cisti

renali sono il risultato dell’allargamento dei lumi del tubulo renale e quando si

presentano in grosso numero e dimensioni, portano alla fibrosi renale e quindi al

fallimento della funzione renale. Recentemente, i risultati di uno screening

mutazionale su larga scala, ha identificato dieci geni in Zebrafish che, quando

mutati, causano cisti renali (Sun et al., 2004). L’esigenza di un ampio numero di

geni, necessari per mantenere la struttura del tubulo, è in accordo con l’idea che il

mantenimento della grandezza del lume del tubulo e delle cellule epiteliali che lo

27

compongono, è un complesso processo controllato da diverse proteine cellulari.

Altri difetti renali comuni a tutti i vertebrati riguardano la formazione dei

glomeruli e le sindromi nefroniche. In alcune forme patologiche, vi è un aumento

della permeabilità dei glomeruli a diverse molecole, che può determinare

proteinuria, cioè alla presenza di proteine nelle urine oltre una certa soglia. Questo

difetto è stato osservato anche in mutanti di Zebrafish, rendendoli oggetto di

studio per il trattamento di questa patologia umana.

Nonostante alcune differenze morfologiche tra il rene dei mammiferi e quello dei

teleostei, esistono dei parallelismi a livello cellulare e molecolare che possono

essere sfruttati per meglio capire lo sviluppo del rene e i suoi difetti congeniti. Gli

stessi geni e tipi cellulari sono usati durante lo sviluppo embrionale e per la

funzione renale, in tutti i vertebrati. Infatti geni mutati durante le malattie renali

dei mammiferi, sono essenziali quelle per la formazione e la funzione del pronefro

di Zebrafish, il che fa di questo organismo un modello rilevante per studi inerenti

lo sviluppo e le patologie renali.

1.4. I geni Soul

Tra le proteine che legano l’eme e partecipano al suo metabolismo, il ruolo dei

fattori appartenenti alla famiglia Soul in questo processo è ancora poco

conosciuto. Partendo da studi sulla biosintesi dell'eme, il gruppo di Taketani

(1998) identificò una proteina di ventidue kDa, estratta dal fegato di topo e

denominata p22HBP. Questa proteina non mostrava avere omologia di sequenza

con le altre proteine che legano l’eme (HBP). Tuttavia, l'espressione ubiquitaria

dell'RNA messaggero di p22HBP in vari tessuti e in particolare nel fegato, sito

principale della sintesi di eme, ne suggeriva un possibile coinvolgimento nel

legare l’eme. Successivamente, uno studio sui geni coinvolti nella generazione del

ritmo circadiano, permise di scoprire un gene omologo di p22HBP, il cui trascritto

è presente nella retina e nella ghiandola pineale di pollo (Zylka e Reppert, 1999).

La proteina fu battezzata col nome di Soul, in virtù dell'attività trascrizionale nella

ghiandola pineale, sede dell'anima secondo Cartesio (Descartes, 1649). Studi

biochimici e su colture cellulari di p22HBP e Soul indicano che esse agiscono da

amplificatore citosolico per l'eme e le porfirine, contro l'intossicazione delle

28

cellule da parte dei prodotti del ferro. Con gli omologhi di p22HBP e soul di topo,

mHBP ed mSOUL, strettamente correlati tra di loro, è stata costituita una nuova

famiglia di proteine denominata SOUL/HBP. A questa famiglia è stato attribuito

un coinvolgimento nel trasporto del coproporfirinogeno verso i mitocondri, e

dell’eme citosolico. Tuttavia, il gruppo di Blackmon (2002) ha dimostrato che

p22HBP di uomo e topo, pur presentando un’elevata affinità per molecole

mitocondriali quali la protoporfirina, il coproporfirinogeno e la bilirubina, non

presenta localizzazione mitocondriale, agendo più come buffer intracellulare che

come trasportatore di porfirinogeno.

L'analisi strutturale di p22HBP di topo e di SOUL ha mostrato le differenti

proprietà di queste proteine, identificando anche il probabile sito di legame con

l’eme e con gli aminoacidi coinvolti in quest'ultimo. La posizione del sito di

legame con le porfirine indica un ruolo di trasportatore di eme/ferro nella cellula,

piuttosto che un ruolo dell’eme come cofattore nella proteina (Gell et al., 2006).

Inoltre, si è visto che, mentre p22HBP agisce come monomero legando o meno

l'eme, SOUL opera come esamero legando eme e ferro insieme (Dias et al., 2006).

Quindi le proteine SOUL/HBP consistono di fattori tetrapirrolici con alta affinità

per le porfirine e l’eme.

Un recente studio sul “cleavage” della proteina umana HBP1/SOUL1, ha

dimostrato il ruolo dei meccanismi post-traduzionali nella chemioattrazione di

cellule dendritiche e monociti (Migeotte et al., 2006), e che HBP2/SOUL2, oltre a

legare l’eme, promuove la morte cellulare inibendo il potenziale di membrana

mitocondriale (Szigeti et al., 2006).

L'analisi del proteoma dell'alga unicellulare Chlamydomonas reihardtii, ha

evidenziato la presenza di trascritti di Soul nell’ocello, suggerendo un

coinvolgimento nel processo di fotorecezione (Kreimer et al., 2007). In

conclusione, la caratterizzazione biochimica lascia ancora inevasi diversi quesiti

relativi al comportamento e alla funzione di questa famiglia durante lo sviluppo

embrionale.

1.5. Zebrafish come sistema modello nella ricerca

Per studiare le funzioni di queste proteine, da un punto di vista molecolare oltre

29

che morfologico, nell’ambito dell’ematopoiesi e più in particolare della

nefrogenesi, ci siamo avvalsi di Danio rerio, più comunemente conosciuto come

Zebrafish, uno dei sistemi modello più importanti nella biologia dello sviluppo,

riconosciuto come tale dal National Institute of Health (NIH) americano.

Zebrafish si è affermato e continua a farlo sempre di più nell'ambito della ricerca

scientifica, non solo in quella di base, nelle neuro-degenerazioni (Taylor et al.

2004), nella ricerca farmaceutica e in particolare nello studio delle malattie

congenite ed ereditarie (Ernest et al. 2000; Neely et al. 2002; Bassett and Currie

2003; Prouty et al. 2003; Wang et al. 1998). Di piccole dimensioni (2-3 cm di

lunghezza in età adulta), lo Zebrafish entra nella storia della Biologia grazie alla

trasparenza dell'embrione, una grande capacità proliferativa, la fecondazione

esterna e un breve intervallo tra una generazione e quella successiva. Inoltre la

possibilità di indurre mutazioni puntiformi nei singoli geni, di isolare i mutanti, di

creare linee transgeniche e di utilizzare tecnologie avanzate di biologia cellulare,

trapianti di cellule e l'eliminazione selettiva di attività geniche specifiche, hanno

fatto sì che lo Zebrafish potesse essere utilizzato in uno spettro scientifico sempre

più ampio. Sulle orme del progetto genoma umano, è in via di completamento il

sequenziamento dell'intero genoma di Zebrafish ad opera del Sanger centre

(http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio).

Lo Zebrafish si sviluppa velocemente e la maggior parte dei suoi organi è

osservabile sin dai primi giorni di sviluppo. Le sue dimensioni embrionali (pochi

millimetri a cinque giorni dalla nascita) e la numerosità della progenie (circa 200

uova per accoppiamento), permettono di manipolarlo in maniera quasi del tutto

automatizzata, garantendo il trattamento e l'analisi di molti embrioni

contemporaneamente e soprattutto una quantità di unità sperimentali vastissima.

E' stato principalmente utilizzato in passato come modello per meglio

comprendere l'embriologia, grazie all'alta fecondità, alla fecondazione esterna e

alla trasparenza ottica degli embrioni che permettono sia la visualizzazione diretta

dei vari destini cellulari, sia la visualizzazione di proteine fluorescenti (GFP, green

fluorescent protein). Allo scopo di isolare mutanti, sono stati eseguiti due grandi

screening che hanno portato a una collezione di migliaia di mutanti Zebrafish: uno

screening chimico, attraverso l'utilizzo dell' ENU (etil nitroso urea) come agente

30

mutageno (Brand et al., 1996), e uno screening per inserzione (Amsterdam et al.,

2004). Interessanti risultati sono stati ottenuti ai fini dell'investigazione delle

funzioni geniche, in particolare è stato possibile effettuare il “knock down”,

ablazioni geniche funzionali, attraverso l’uso del fosforodiammidato morfolino

oligonucleotide (morpholino), capace di bloccare in maniera sequenza specifica la

traduzione degli RNA messaggero (Nasevicius and Ekker, 2000).

Di rilevante importanza è il recente utilizzo dello Zebrafish come sistema

emergente per lo studio di modelli neurodegenerativi e neuromuscolari come

l'Alzheimer (Tomasiewicz et al., 2002), la distrofia muscolare Duchenne e diverse

miopatie (Bassette and Currie, 2003).

Inoltre, la possibilità di utilizzare mutanti chimicamente indotti e ablazioni

funzionali ha fatto in modo che lo Zebrafish venisse usato come sistema modello

per lo studio di diverse malattie umane, che coinvolgono il sistema ematopoietico,

cardiovascolare ( Stainier et al., 1996; Xu et al., 2002), visivo (Goldsmith and

Harris, 2003) e i disordini renali (Drummond et al., 1998). Naturalmente un tale

modello presenta anche qualche svantaggio, come ad esempio il non disporre di

metodi per fare il knock-out di geni tramite ricombinazione omologa, o la

ridondanza genetica del genoma di Zebrafish, che è dovuta alla probabile

duplicazione genomica o sub genomica tipica della storia evolutiva di questa

specie.

1.5.1 Zebrafish: sviluppo embrionale

In natura lo sviluppo dello Zebrafish avviene in un ambito di temperature che va

dai 25° ai 32°centigradi. In laboratorio, per convenzione, la temperatura

selezionata per lo sviluppo embrionale dello Zebrafish è 28,5°C (Streisinger et al.,

1981). L’uovo appena fecondato si trova nel periodo zigotico fino a 40 minuti

dopo la fecondazione e ha un diametro di 0,7 mm. Dopo la prima divisione di

segmentazione, le successive avvengono ad intervalli di 15 minuti. Le divisioni

citoplasmatiche sono parziali perché lo zigote ed i successivi mesociti

inizialmente vengono completamente separati, e solo col progredire del processo

di segmentazione (con piani tangenziali) si formano veri blastomeri. Questo tipo

di divisione è chiamata discoidale e porta alla formazione di un mucchio di cellule

31

al polo animale. Queste cellule costituiscono il blastoderma. Inizialmente, tutte le

cellule mantengono alcune connessioni aperte tra l’una e le altre e con le cellule

sottostanti del vitello, in modo che molecole di moderata taglia (17-kDa) possano

passare liberamente da un blastomero all’altro (Kimmel and Law, 1985).

All’inizio della decima divisione cellulare, è possibile osservare l’inizio del

passaggio allo stadio di midblastula: la trascrizione di geni zigotici inizia, le

cellule si dividono più lentamente, comincia ad essere evidente il movimento

cellulare (Kane and Kimmel, 1993), si forma lo strato sinciziale del vitello (YSL)

e inizia l’epibolia con un assottigliamento e un’estensione sia dello YSL che del

blastodisco sopra le cellule del vitello. Ha quindi inizio la gastrulazione con

movimenti morfogenetici comprendenti involuzione, convergenza ed estensione,

che determina la formazione dei foglietti embrionali e dell’asse embrionale. La

gastrulazione inizia 5 ore dopo la fecondazione (hpf) e dura fino a 10 hpf. Ad essa

segue il periodo della segmentazione del mesoderma durante il quale si

sviluppano circa 30somiti, cominciano a essere visibili i rudimenti degli organi

primari, la coda inizia ad essere più prominente e l’embrione si allunga. In questo

periodo sono inoltre evidenti il primordio ottico, i placodi otici alla base del

mesencefalo primordiale, la vescicola di Kupffer e il primordio del pronefro,

cominciano le contrazioni muscolari e il sacco vitellino si estende posteriormente.

Al periodo della metamerizzazione dei somiti segue lo stadio di faringula (dalle

24 alle 48 hpf), durante il quale l’embrione di Zebrafish mostra le caratteristiche

morfologiche tipiche dei vertebrati: è possibile riconoscere gli occhi, gli otoliti, le

cellule del sangue, il sistema vascolare, i placodi olfattivi, le aree principali del

sistema nervoso centrale e il pronefro.

A 48hpf, inoltre, si osserva la pompa cardiaca e la dinamica delle cellule del

sangue, nonché il primordio delle pinne pettorali.

Dalle 48 alle 72 hpf l’embrione continua ad accrescersi e si formano tutti gli

organi ad eccezione dell’apparato gastrointestinale e degli organi annessi. Dal

terzo giorno in poi la larva avrà completato la maggior parte della sua

morfogenesi e continuerà ad accrescersi rapidamente. Prominenti cambiamenti

riguardano la vescica natatoria e la protrusione antero–dorsale della bocca. Il

32

canale digerente diviene più facilmente visibile, mentre l’estensione del vitello si

assottiglia. Gradualmente la larva inizia a nuotare più attivamente e a muovere la

bocca, gli opercoli, le pinne pettorali e gli occhi (Fig. 10).

Fig. 10 Sviluppo embrionale di Zebrafish

33

2. Materiali e metodi

2.1. Nomenclatura

I quattro geni omologhi di p22HBP e Soul identificati nel genoma di Zebrafish

sono qui denominati semplicemente soul (soul1-4), in attesa che uno studio

approfondito di filogenesi molecolare permetta di chiarire la nomenclatura in

maniera definitiva.

2.2. Analisi delle sequenze proteiche

Le sequenze di cDNA dei quattro geni p22HBP e soul di Zebrafish sono state

confrontate con quelle di altri omologhi individuati nelle collezioni di sequenze

depositate nelle varie banche dati disponibili in rete, GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) e TIGR (www.tigr.com) in

primis. La caratterizzazione delle proteine per quanto concerne i profili di

idrofobicità e idrofilicità, e la presenza di eventuali domini transmembrana, è stata

realizzata utilizzando i programmi in rete SWISSPROT (http://www.expasy.ch/) e

TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/), rispettivamente. Per

analizzare i rapporti filogenetici tra i vari membri della famiglia, e individuare

eventuali cladi, o subraggruppamenti, è stato adoperato il programma Neighbour

Joining nel workpackage CLUSTALW.

2.3. Sintesi degli oligonucleotidi

Tutti gli oligonucleotidi sintetici impiegati sono stati preparati con un apparecchio

Beckman SM-DNA Synthesizer dal Servizio di Biologia Molecolare della

Stazione Zoologica Anton Dohrn di Napoli.

2.4. Preparazione di RNA totali da embrioni e tessuti di Zebrafish

Gli embrioni e i tessuti raccolti sono stati congelati in azoto liquido e pestati fino

allo stato di polvere. I tessuti selezionati e i vari stadi embrionali utilizzati sono i

seguenti: milza (mi), ovario (o), cuore (c), muscolo (mu), cervello (ce), intestino

(i), testicolo (t), fegato (f), 4 - 16 cellule ( 4 - 16), bud (b), shield (s), 70% epibolia

34

(70), 24 hpf (24), 5 hpf (5), 3 settimane (3), 1 mese (1), 2 mesi (2), 45 giorni (45) e

60 giorni (60). Il protocollo seguito per l’estrazione dell’RNA è quello del RNasy

Mini Procedure della Qiagen.

2.5. Sintesi del cDNA

La sintesi del cDNA viene effettuata a partire da RNA totali a diversi stadi di

sviluppo embrionale e da alcuni tessuti. Il cDNA è stato sintetizzato con il sistema

“Taq Man kit” (PE Biosystem) preparando una miscela composta da RNA

proveniente da circa 100 embrioni (1µg di RNA totale), oligonucleotidi esamerici

“random” (2.5µM), tampone di reazione (50mM KCl, 10mM Tris-HCl, pH 8.3),

una miscela di dNTP (0.5mM dATP, 0.5mM dTTP, 0.5mM dCTP, 0.5mM dGTP),

MgCl2 (5.5mM), inibitore delle Rnasi (0.4 U/µL) e l’enzima “MultiScribeTM

Reverse Trascriptase”(1.25 U/µL).

La miscela è stata sottoposta alle seguenti condizioni termiche:

Incubazione oligonucleotidi 10 minuti a 25°C

Trascrizione inversa 60 minuti a 37°C

Disattivazione enzima RT 5 minuti a 95°C

I campioni di cDNA sono stati conservati a – 20 °C fino all’uso.

2.6. Amplificazione mediante PCR

La PCR è una tecnica che permette l’amplificazione di una regione di DNA

compresa tra due oligonucleotidi. Il DNA stampo è denaturato per far sì che ai

singoli filamenti prodotti possano associarsi due inneschi complementari alle

sequenze che delimitano la regione che si desidera amplificare.

Una DNA polimerasi termoresistente utilizza questi inneschi per polimerizzare il

secondo filamento e le doppie eliche così ottenute sono nuovamente denaturate per

essere riutilizzate come stampi per la reazione successiva.

35

La reazione si ripete per il numero di volte desiderato, producendo una grande

quantità di una molecola corrispondente alla regione di DNA compresa tra i due

inneschi.

I due inneschi sono, nel caso di soul1, un oligo al 5’ corrispondente alla sequenza

nucleotidica dedotta dalla regione amminoacidica V L G E I Q L S I, e un oligo al

3’ corrispondente alla sequenza nucleotidica dedotta dalla regione amminoacidica

L W K L T L L H H. Nel caso di soul2, l’oligo al 5’ corrisponde alla sequenza

amminoacidica V G H Q K W, mentre l’oligo al 3’ corrisponde alla sequenza

amminoacidica Q W W L T H Q T .

Ogni reazione è stata condotta in un volume totale di 50µL con i seguenti

componenti:

• DNA 100ng

• Tampone di sintesi 10x (Tab.5) 5µL

• dNTP 10mM 5µL

• Innesco 2 (100 pmol/µL) 1µL

• Innesco 1 (100 pmol/µL) 1µL

• Taq DNA polimerasi (0.5U/µL) 1µL

La miscela è stata conservata alla temperatura di denaturazione di 94°C per 5

minuti. I successivi cicli di amplificazione, di seguito descritti, sono stati condotti

mediante un Thermal Cycler Perkin-Elmer-Cetus. Dopo la denaturazione, la

miscela è stata portata per due minuti alla temperatura di “annealing” (54°C)

compatibile con gli oligonucleotidi usati, l’allungamento è avvenuto a 72°C per

due minuti. Tale ciclo di amplificazione è stato ripetuto 35 volte. Inoltre per

migliorare l'efficienza di amplificazione (quantità elevata del prodotto) e la

specificità (nessun prodotto non specifico) del prodotto di PCR, si è aggiunto

DMSO (dimetilsolfossido) pari al 5% del volume finale. Ovviamente, come

36

controllo del programma PCR, su ciascuno dei campioni è stata fatta una PCR per

amplificare il gene EF1α (elongation factor 1 alpha), un fattore codificante per

una proteina implicata nell’allungamento della catena peptidica durante la

biosintesi delle proteine, e quindi ubiquitariamente espresso in tutte le cellule.

Al termine dei 35 cicli, 20µL della reazione sono stati analizzati su un gel di

agarosio 1% in TAE 1X. Il rimanente della miscela è stato conservato a 4°C.

2.7. Clonaggio di soul1 in pBluescript SK- vector

Un clone IMAGE contenente una sequenza di cDNA annotata come gene hbp2 è

stato acquistato dalla ImaGenes in Berlino come frammento di cDNA clonato nel

vettore pME18S-FL3 (Fig.11). Per verificare l’identità del clone abbiamo

proceduto al sequenziamento e dal BLAST della sequenza abbiamo confermato la

presenza, all’interno del clone, dell’intera regione codificante un gene omologo di

hbp2, che è stato quindi successivamente subclonato nel vettore pBluescript SK-

con l’enzima di restrizione EcoRV (Fig.12) attraverso una reazione di ligasi:

• Tampone Ligasi 10X 1µL

• DTT 100mM 0.5µL

• ATP 10mM 0.5µL

• vettore pBluescript SK- (50ng/mL) 1µL

• DNA 2µL

• T4 DNA ligasi 0.5µL

• H2

La reazione di ligasi T4 è stata incubata a 16°C tutta la notte e in seguito inattivata

a 65°C per 10 minuti.

0 sterile 4.5µL

37

Fig.11: Vettore pME18s-FL3-cDNA

38

Fig.12: Vettore pBluescript SK-

2.8. Clonaggio di soul2 pCR® II-TOPO

Il gene soul2 è stato amplificato e clonato nel vettore pCR

®

® II-TOPO® (Fig.13)

direttamente da prodotto PCR utilizzando la temperatura di 37°C per 30’:

• TOPO Cloning 1µL

• Prodotto PCR 2µL

• Soluzione salina 1µL

• H2

O sterile 5µL

39

Fig.13: Vettore pCRII-TOPO

40

2.9 Clonaggio di soul3 e soul4

Due cloni IMAGE contenenti sequenze di cDNA annotate come geni Soul/heme-

binding protein 1 sono stati acquistati dalla ImaGenes in Berlino. All’origine,

entrambi i frammenti di cDNA di soul3 e soul4 sono inseriti nel vettore pME18S-

FL3 (Fig.11). Per verificare l’identità dei cloni si è proceduto al sequenziamento e

dal BLAST della sequenza si è potuto confermare la presenza, all’interno dei due

vettori, dell’intera regione codificante di geni appartenenti alla famiglia hbp1.

Successivamente, il cDNA di soul3 è stato trasferito nel vettore TopoTA (Fig.13)

con l'enzima BamHI, e quello di soul4 nel vettore pBluescript SK- con l’enzima

di restrizione EcoRI (Fig.12), attraverso una reazione di ligasi:

• Tampone Ligasi 10X 1µL

• DTT 100mM 0.5µL

• ATP 10mM 0.5µL

• Vettore pBluescript SK- (50ng/mL) 1µL

• DNA 2µL

• T4 DNA ligasi 0.5µL

• H2

0 sterile 4.5µL

La reazione di ligasi T4 è stata incubata a 16°C tutta la notte e in seguito inattivata

a 65°C per 10 minuti come da protocollo.

2.10. Trasformazione di DNA plasmidico in cellule batteriche

mediante elettroporazione

Questa tecnica permette di inserire costrutti di DNA in cellule batteriche

competenti, le quali sono sottoposte a shock elettrico per provocare l’apertura dei

pori della membrana plasmatica. Per le trasformazioni sono stati usati circa 10µL

delle reazioni di ligasi, precedentemente inattivate a 65°C per 10 minuti,

raffreddate in ghiaccio e microdializzate con dH2O sterile per un’ora. Si è

41

utilizzata un’elettrocuvetta Bio-Rad Gene Pulser contenente il DNA plasmidico e

le cellule batteriche del ceppo Escherichia coli “TOP 10” competenti per

l'elettroporazione, posizionata nell’apposito alloggio dell’elettroporatore Bio-Rad

Gene Pulser. Dopo l’impulso elettrico a voltaggio costante di 1.7 V, le cellule sono

state risospese in 800µL di terreno di coltura Luria-Bertani (LB) e poste a 37°C

per 1 ora; in seguito, aliquote di 10-200µL sono state piastrate su substrato solido

(agar e LB) con l’antibiotico per il quale il plasmide mostra resistenza, e messe a

crescere tutta la notte a 37°C. Successivamente sono stati preparati gli inoculi nei

tubicini da batteri aggiungendo LB con l’antibiotico, utilizzando punte sterili per

prelevare le colonie dalla piastra e metterle nel tubicino nell'agitatore a 37°C per

16 h.

2.11. PCR colony

Al fine di selezionare i cloni contenenti il plasmide, le colonie presenti sulle

piastre sono state sottoposte a PCR colony.

Per effettuare la PCR colony sono stati adoperati due oligonucleotidi, M13

Reverse ed M13 Forward, le cui sequenze complementari sono presenti su

entrambi i plasmidi pCRII-TOPO e pBluescript SK-

Per ogni colonia la reazione di amplificazione è stata eseguita in un volume totale

di 20µL, contenente gli oligonucleotidi (1pmol/µL), una miscela di dNTP

(0.2µM), tampone di reazione 1X (Roche 10X PCR buffer) e Taq Polimerasi

(0.01U/µL). In ogni miscela è stata immersa un’ansa in precedenza passata sulla

colonia da controllare. Inoltre le stesse anse sono state adoperate per fare una

replica su di una nuova piastra (terreno LB minimo contenente ampicillina

0.1µg/mL) e poste infine in tubi da inoculo contenenti ciascuno 3 ml di brodo di

coltura LB con ampicillina (0.1µg/mL). Le piastre così ottenute sono state poste in

un incubatore a 37 °C per 12 ore. I tubi da inoculo sono stati posti in un incubatore

a 37°C per 12 ore, sotto agitazione (240 rotazioni per minuto, rpm).

dove fiancheggiano

l’inserto.

La PCR colony è stata condotta sottoponendo le reazioni di amplificazione ai

seguenti cicli:

42

• Denaturazione (1 ciclo): 5 minuti a 95°C

• Denaturazione (30 cicli): 1 minuto a 94°C

• Annealing: 1 minuto a 52°C

• Polimerizzazione: 2 minuti a 72°C

• Elongazione (1 ciclo): 5 minuti a 72°C

La presenza di bande di amplificazione della lunghezza attesa è stata osservata

analizzando i campioni su gel di agarosio (1,2% in tampone TAE) per mezzo di

uno standard di riferimento.

Da alcuni inoculi corrispondenti alle colonie positive è stata fatta una mini

preparazione di DNA plasmidico facendo uso del sistema “Qiagen Plasmid Mini

Kit”, seguendo la procedura consigliata.

2.12. Maxipreparazione di DNA plasmidico

La maxipreparazione di DNA plasmidico è stata eseguita ponendo a crescere a

37°C, per circa 2 ore, in agitazione (240 rpm), un pre-inoculo costituito da 10mL

di brodo sterile LB (1% triptone, 1% NaCl, 0.5% estratto di lievito), ampicillina

(0.1µg/mL) e un’ansa previamente strisciata sulla rispettiva colonia. Al termine

delle 2 ore, il pre-inoculo è stato trasferito in una beuta contenente 250mL di

brodo sterile LB ed ampicillina (0.1µg/mL). L'inoculo così composto è stato

incubato a 37 °C, sotto agitazione (240 rpm), per 12 ore.

La purificazione del DNA plasmidico è stata eseguita avvalendosi del sistema

“Qiagen Plasmid Maxi Kit”, seguendo il protocollo fornito dalla casa produttrice.

Dello stesso campione è stato inoltre preparato uno stab prelevando 800µl di

coltura batterica dall’inoculo ed aggiungendovi 200µL di glicerolo sterile. Tale

miscela è stata agitata generosamente e conservata a –80 °C.

A purificazione avvenuta, il campione è stato quantificato allo spettrofotometro.

43

2.13. Sequenziamento del DNA plasmidico

I campioni sono stati esaminati allo spettrofotometro leggendone l’assorbanza ai

valori di 260nm, per la quantificazione del DNA, e a 280nm, per verificarne la

purezza (il valore del rapporto 260nm/280nm deve essere compreso tra 1.6 e 2.0).

Il sequenziamento del DNA plasmidico è stato fatto preparando la seguente

miscela per ciascun campione:

• DNA plasmidico 12.5pM in H2O

• Primer 1.25µM in H2O

in un volume finale di 10µL.

Le sequenze sono state realizzate dal Servizio SBM di Biologia Molecolare della

Stazione Zoologica utilizzando il metodo di marcatura “Dye Terminator” ed il

sequenziatore automatico ad elettroforesi capillare ad alta capacità "Applied

Biosystems 3730 DNA Analyzer".

Le sequenze sono state analizzate utilizzando il programma SeqMan-DNAStar.

2.14. Trascrizione in vitro di ribosonde

I plasmidi sono stati linearizzati per digestione con appropriati enzimi, per

ottenere rispettivamente i templati per la sintesi delle ribosonde senso ed

antisenso. Le digestioni sono state effettuate preparando una miscela contenente

10μg di plasmide, 5U di enzima di restrizione, buffer di reazione; gli enzimi di

restrizione utilizzati per i quattro geni sono stati XhoI e BamHI per soul1 in

pBluescript SK-, EcoRV e BamHI per soul2 in pCR® II-TOPO®, EcoRV e

BamHI per soul3 in pCR® II-TOPO®, e EcoRI e SpeI per soul4 in pBluescript

SK-. Tali plasmidi possiedono a monte e a valle del sito di clonaggio due

promotori, T3 e T7 in pBluescript SK-, e SP6 e T7 in pCR® II-TOPO®, siti che

vengono riconosciuti da specifiche RNA polimerasi che possono produrre, perciò,

trascritti del frammento contenuto nel vettore ricombinante. Le digestioni sono

state eseguite in un volume finale di 50μL e sono state poste in incubazione a 37°C

per tutta la notte. La completa linearizzazione dei plasmidi è stata controllata

44

mediante analisi elettroforetica su gel d’agarosio (1% in tampone TAE). I

campioni linearizzati sono stati sottoposti a una reazione con Proteinase K (PK)

così condotta: plasmide linearizzato, Tris 0.1M pH 7.4, SDS 0.5%, PK (40μg), in

H2O DEPC, in un volume complessivo di 200μL. La reazione è stata posta per 30

minuti alla temperatura di 42°C. I plasmidi linearizzati e trattati con PK sono stati

purificati mediante estrazione con un volume di fenolo-cloroformio-alcool

isoamilico (25:24:1) e centrifugazione a 14000 rpm per 1 minuto. La fase acquosa

è stata estratta con un volume di cloroformio ed il sovranatante precipitato con due

volumi di etanolo 100%, Na acetato 0.3 M pH 5.2 e glicogeno (0.05μg/μL)

(Ambion). I campioni sono stati posti a – 80 °C per 1 ora. Sono quindi stati

centrifugati a 14000 rpm per 30 minuti. Si è provveduto a lavare i pellets in

etanolo 70% ed in seguito a centrifugare a 14000 rpm per 15 minuti. Infine i

pellets sono stati liberati dall’etanolo, fatti asciugare all’aria e risospesi in H2

La trascrizione in vitro è stata effettuata utilizzando il “DIG RNA labeling kit“

(Roche). Con questo sistema è stato possibile marcare l’RNA messaggero prodotto

in vitro usando la digossigenina, un composto steroide isolato dalla pianta

Digitalis planaria, il quale funziona come aptene legato covalentemente,

attraverso un braccio spaziatore contenente undici atomi di carbonio, alla

posizione C-5 dell’UTP. Il precursore DIG-UTP sarà incorporato nel frammento di

RNA sintetizzato poiché riconosciuto come un "comune" nucleotide dalle RNA

polimerasi utilizzate, producendo così sonde di RNA marcate. Per produrre gli

RNA senso ed antisenso, è stata dunque preparata la seguente miscela di reazione:

O

DEPC.

• DNA plasmidico linearizzato 1µg

• Miscela di NTP 10X 2µL

• Tampone di trascrizione 10X 2µL

• Inibitore delle RNAsi (20U/µL) 1µL

• T7 RNA polimerasi (20U/µL) 2µL

Oppure

• T3 RNA polimerasi (20 U/µL) 2µL

45

Oppure

• SP6 polimerasi 2µL

• H2

La reazione di sintesi è stata effettuata alla temperatura di 37°C per 2 ore,

successivamente sono stati aggiunti 2µL di DNasi I (10U/µL) priva di attività

RNAsica, ed il tutto incubato ancora a 37°C per 20 minuti, per eliminare il DNA

stampo. La reazione è stata, infine, bloccata mediante aggiunta di 2µL di EDTA

0,2 M pH 8. Le ribosonde sono state purificate tramite cromatografia per

esclusione molecolare su Sephadex G50 con l’ausilio delle colonnine “mini Quick

Spin RNA Columns” (Roche) e conservate alla temperatura di –80 °C fino all’uso.

O trattata con DEPC fino ad un volume finale di 20µL.

Le sonde sintetizzate sono:

• per Soul1 un frammento di 800 bp;

• per Soul2 un frammento di 600 bp;

• per Soul 3 un frammento di 1471 bp;

• per Soul4 un frammento di 1172 bp.

Plasmidi Enzimi di restrizione Polymerase

Soul1 XhoI T3

Soul2 EcoRV Sp6

Soul3 BamHI T7

Soul4 EcoRI T7

Plasmidi ed enzimi usati per preparare sonde antisenso a RNA per ISH

46

2.15. Quantizzazione delle sonde a RNA

Per valutare la concentrazione degli RNA prodotti per trascrizione in vitro, è stato

utilizzato un saggio immunoenzimatico (Dot Blot) ricorrendo all’utilizzo di

anticorpi anti-digossigenina coniugati con l’enzima fosfatasi alcalina.

La quantificazione delle ribosonde digossigenina-coniugate è avvenuta facendo

delle diluizioni seriali 1:4 dei campioni da analizzare e di un campione di RNA di

riferimento (100ng/μL), in un tampone di diluizione composto da SSC 6X,

Formaldeide, H2

Trascorso tale periodo, il filtro è stato sottoposto a due lavaggi consecutivi della

durata di 15 minuti ciascuno, con tampone MBT. Quindi è stato effettuato un

lavaggio in tampone AP pH 9.5. La soluzione di rivelazione è stata preparata in

ghiaccio e al riparo da fonti luminose aggiungendo al tampone AP pH 9.5 i

composti NBT (100mg/mL) e BCIP (50mg/mL) (Sigma). La membrana è stata

incubata in tale soluzione al riparo dalla luce, per circa 10 minuti. A rivelazione

avvenuta, il filtro è stato lavato sotto acqua corrente per bloccare la reazione ed è

stato asciugato all’aria ponendolo su carta 3MM. Quindi si è provveduto alla stima

delle concentrazioni delle ribosonde rispetto al campione di RNA di riferimento.

O DEPC (3:2:5). Un microlitro di ogni diluizione è stato posto su

di una membrana di nylon (HybondTM-N+, Amersham Life Science); la

membrana è stata fatta asciugare all’aria. In seguito le ribosonde e l’RNA di

riferimento sono stati fissati alla membrana esponendola a raggi UV per 1 minuto.

La membrana è stata quindi lavata per 30 minuti a temperatura ambiente in

agitazione, con una soluzione costituita da tampone MBT e soluzione di

bloccaggio, nelle proporzioni di 9:1. In seguito la membrana è stata incubata con

anticorpo anti-digossigenina coniugato a fosfatasi alcalina (1:5000), nella

medesima soluzione, lasciando in agitazione per 1 ora a temperatura ambiente.

2.16. Preparazione degli animali

Il lavoro è stato svolto su adulti ed embrioni di Zebrafish allevati seguendo le

procedure standard (Westerfield, 2000). Gli embrioni fatti crescere alla

temperatura ottimale di 28.5°C, sono stati fissati a diversi stadi di sviluppo (hpf e

dpf). Sia gli embrioni usati come controllo che quelli per fini sperimentali sono

47

stati posti a crescere in “embryo medium” contenente phenylthiourea (PTU), una

sostanza in grado di inibire lo sviluppo della pigmentazione. Gli embrioni e le

larve sono stati decorionati manualmente e anestetizzati in tricaina.

Successivamente sono stati fissati per tutta la notte (ON) a 4°C, in 4%

paraformaldehyde (PFA) in phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 per gli

esperimenti di ibridazione in situ e immunoistochimica. Dopo il fissaggio sono

stati lavati in PBS 1X contenente 0.1% Tween20 (PBT) e sono stati conservati in

metanolo assoluto a -20°C.

2.17. Ibridazione in situ

L’ibridazione in situ con gli RNA sintetici marcati con digossigenina è stata

effettuata utilizzando il protocollo Maleico.

Dopo reidratazione mediante lavaggi in scala di metanoli al 75%, 50%, e 25% in

PBS 1X + Tween20 (PBT), gli embrioni sono stati lavati in PBT e poi sottoposti a

trattamento con PK che ha il compito di denaturare tutte le proteine dell’embrione

e permeabilizzare i tessuti. Al termine dell’esposizione alla PK, gli embrioni sono

stati dapprima post-fissati in PFA al 4% in PBS 1X per 20 minuti e poi lavati

ripetutamente in PBT.

Gli embrioni sono stati messi in una soluzione d’ibridazione opportunamente

preparata per 2 ore in un bagnetto termostatato alla temperatura di annealing della

sonda ad RNA (calcolata in base al numero di basi Guanina e Citosina presenti

nella sequenza della sondache si sta utilizzando), che è stata aggiunta al termine

delle 2 ore di pre-ibridazione in quantità tra i 50ng per soul4 e i 300ng totali per

gli altri tre geni per mL di soluzione di ibridazione (HM), e lasciata a ibridare tutta

la notte.

Il giorno seguente la sonda è stata recuperata e conservata a una temperatura di –

80°C per essere riutilizzata (fino a 8 volte), e gli embrioni sono stati lavati con la

soluzione di ibridazione, nuovamente preparata, e successivamente con il 75%,

50%, 25% di HM in 2X SSC alla temperatura di ibridazione. In seguito i lavaggi

sono stati eseguiti con 2X SSC e 0,2X SSC a temperatura ambiente per aumentare

la stringenza e rimuovere i legami aspecifici della sonda. I campioni sono stati

48

incubati in una soluzione per bloccare legami specifici per almeno un’ora e poi

lasciati tutta la notte in presenza di un anticorpo legato alla fosfatasi alcalina (AP

anti-DIG) diluito 1:5000 nella soluzione di blocking alla temperatura di 4°C.

Il terzo giorno l’anticorpo è stato rimosso dai tubini ed è stata effettuata una serie

di lavaggi per allontanare i residui prima di passare alla “detection” del segnale

con BM Purple (Roche), passaggio da compiere al buio per evitare che il substrato

sottoposto alla luce precipiti. Una volta rivelato il segnale nel tessuto atteso, la

colorazione è stata stoppata con diversi lavaggi in PBT e PBS 1X + EDTA 10Mm

e i campioni sono infine stati conservati in PFA 4% in PBS 1X a 4°C per tutta la

notte. Dopo la post-fissazione sono stati effettuati ulteriori lavaggi in PBT per

allontanare la paraformaldeide e si è proceduto con lavaggi in scala di glicerolo

fino al 90% in PBS 1X per fotografare gli embrioni, utilizzando un microscopio

composto AxioImager M1 (Zeiss).

2.18. RT-PCR

Per confermare l'espressione spazio-temporale dei geni Soul, opportuni

oligonucleotidi sono stati disegnati e si è proceduto con l'estrazione di RNA e

sintesi di cDNA da tessuti e dagli stadi di sviluppo utilizzati per gli esperimenti di

ibridazione in situ.

2.19. Microiniezioni di oligonucleotidi antisenso (morfolino) in uova

fecondate

I morfolino sono oligonucleotidi antisenso di lunghezza variabile tra le 18 e 25 basi

nucleotidiche complementari alla sequenza del gene di interesse. La funzione

principale è quella di bloccare la traduzione dell’mRNA e quindi la sintesi della

proteina.

In questi oligonucleotidi, il deossiribosio è sostituito con un anello N-morfolino,

che conferisce grande stabilità e consente di ottenere effetti più specifici rispetto

ad altri analoghi antisenso. I morfolino si legano all'mRNA e ne prevengono la

traduzione, soprattutto se disegnati in corrispondenza del codone di inizio, o

interferiscono con la maturazione dell’mRNA se sono diretti contro un sito di

49

splicing. Per la scelta del tipo di morfolino da adottare e della sua sequenza, è

necessario conoscere la sequenza completa del cDNA di interesse, in particolare la

regione al 5'.

Nel caso specifico del gene soul2, gli oligonucleotidi sono stati disegnati e forniti

come prodotto liofilizzato dalla Gene Tools, LLC, a partire dalla sequenza proteica

del gene:

• Morfolino di soul2 spl site: 5’ AGTATTTTTGTGTACTTACTCTCCT 3’

• Morfolino di soul2 ATG: 5’ GCAGAAGCCACAATACATCGCCATTT 3’

Il knock-down dei geni è avvenuto attraverso le microiniezioni di morfolino,

seguendo il protocollo di Gilmour et al., 2000. L’intero settaggio strumentale è

formato da uno stereomicroscopio Zeiss, un micromanipolatore modello serie MN

della Narishige e da un Picospritzer® III della Parker Instrumentation.

Le uova appena fecondate sono state raccolte, pulite e orientate col polo animale

verso il capillare. Gli aghi utilizzati per la microiniezione, sono ricavati da tubi

capillari (Microcaps da Drummond Sci. Co., Broomall, PA, USA),

opportunamente tirati con uno strumento specifico “microelectrode puller” (Model

PN-3, Narishige, Tokyo) scegliendo condizioni di pressione e temperatura idonee

alle esigenze di microiniezione.

Una volta preparati gli aghi, questi sono stati riempiti con una soluzione

contenente un range di concentrazione di morfolino tra 100µM e 300µM in acqua

sterile contenente come marcatore colorante 0,5% di rosso fenolo (Sigma) e

microiniettati nelle uova fecondate. Il volume iniettato è stato stimato essere circa

il 5% del volume delle uova controllando la quantità di rosso fenolo co-iniettato.

I due morfolino RNAs sono stati iniettati prima separatamente a diverse

concentrazioni (0.1 mM, 0.3 mM e 0.5 mM), e poi insieme. Le soluzioni sono

state microiniettate nel citoplasma del singolo blastomero o nel vitello, calibrando

il volume della soluzione pari a circa 1/20 del volume dell’uovo fecondato, per

non danneggiare la cellula. Come controllo negativo è stato iniettato anche un

morfolino di controllo (standard control); in questo modo è stato possibile

osservare gli effetti endogeni e aspecifici del morfolino. Un altro gruppo di

50

embrioni è stato iniettato con la sola soluzione di Danieu e rosso fenolo priva del

morfolino, come ulteriore controllo negativo per escludere effetti dovuti

all'iniezione nell'osservazione del fenotipo. Gli esperimenti sono stati ripetuti

diverse volte e si è proceduto ogni volta a contare il numero di animali morti per

ogni gruppo di iniezione. Dal confronto della mortalità degli embrioni di controllo

con quella degli embrioni iniettati con il morfolino di soul2 è stato possibile

arrivare alla giusta concentrazione di morfolino che produce effetti abbastanza

rilevanti con una ridotta mortalità.

La quantità di morfolino non tossica per gli embrioni che ha prodotto la più bassa

mortalità e un fenotipo più evidente è stata di 0.3 mM.

Il fenotipo è stato studiato prima molecolarmente, attraverso l'analisi

dell'espressione di marcatori rene e sangue specifici, e successivamente

biochimicamente attraverso saggi enzimatici e colture cellulari.

Gli embrioni non iniettati sono stati raccolti e usati come controllo positivo. Un

primo gruppo di embrioni selvatici e iniettati è stata decorionato e fissato in

paraformaldeide 4% in PBS 1X a 24 hpf per essere sottoposti a esperimenti di

ibridazione in situ.

2.20. Clonaggio e sintesi di sonde di marcatori ematopoietici e

renali

Marcatori ematopoietici e renali sono stati clonati a partire sia da cloni IMAGE

acquistati dalla ImaGenes in Berlino, sia attraverso PCR utilizzando gli oligo

specifici disegnati sulla base delle sequenze disponibili in rete, sia da plasmidi già

disponibili. Tutti i geni sono stati clonati nei vettori pBluescript SK- e TopoTA

(Fig 12 e Fig.13) su descritti. I marcatori renali utilizzati sono: ret1, gata3,

slc12a1, trpm 7, mentre quelli ematopoietici sono: hbbe1.1 e tfr1a.

Per i seguenti marcatori sono state utilizzate le stesse procedure di clonaggio,

trasformazione, preparazione di DNA plasmidico, digestioni e sintesi di ribosonde

precedentemente descritte.

51

Plasmidi Enzimi di restrizione Polymerase

gata3 EcoRI T7

ret1 BamHI Sp6

slc12a1 EcoRI T7

trpm 7 NotI Sp6

hbbe1.1 KpnI+XmaI T7

tfr1a ClaI T7

Plasmidi ed enzimi usati per preparare sonde antisenso a RNA per ISH

La caratterizzazione dei morfanti di soul2 con le ribosonde ottenute, è stata

effettuata mediante ibridazione in situ, la cui procedura è già stata descritta, su

embrioni interi a 24 hpf. La temperatura di ibridazione utilizzata per tutte le sonde

è stata di 65°C e la concentrazione di 300ng totali in un mL di soluzione di

ibridazione.

2.21. Iniezione del morfolino gata1 in uova fecondate

La microiniezione del morfolino gata1 è stata realizzata utilizzando

l’oligonucleotide modificato gentilmente donato dal Dott. Alan J. Davidson

(Simches Research Building, MGH, Boston). Tale morfolino è stato disegnato

contro il sito di attivazione trascrizionale contenente il codone ATG. Le

concentrazioni utilizzate sono state 1mM e 0.4mM (Jenna L. et al., 2006), e sono

state iniettate in embrioni agli stadi da una a quattro cellule. I morfanti sono stati

caratterizzati mediante ibridazione in situ con la sonda di soul2 e hhbe1 seguendo

il protocollo standard già descritto a una temperatura di ibridazione di 62°C.

52

2.22. Clonaggio di soul1 in pEGFP/N1 per mRNA

Al fine di creare un costrutto che contenga l'intera sequenza codificante del nostro

gene al fine di produrre un eccesso di proteina nelle cellule embrionali, l’inserto

presente nel vettore pME18S/FL13 è stato subclonato nel vettore pEGFP-N1

(Fig.14). L’amplificazione dell’inserto in pME18S/FL13 è stata realizzata

utilizzando due oligo specifici per soul1, uno posizionato sull’ATG, e l’altro al 3’,

disegnato in modo da eliminare il codone stop. Per facilitare la ligazione nel

vettore pEGFP-N1, entrambi gli oligo contengono la cassetta di restrizione per

l’enzima XhoI:

Oligo forward:

5’CGAGCCTCGAGCCACCATGCTTAAAGCCATCGGTC3’

Oligo reverse:

5’CGAGCCTCGAGCTCCTCATCTTTGATGAGC3’

Dopo l’amplificazione la soluzione è stata fatta correre su gel per determinare

l’avvenuta amplificazione e la lunghezza dell’inserto, a cui è seguita una

estrazione da gel.

In seguito sia l’inserto sia il vettore sono stati digeriti con XhoI e si è eseguita la

reazione di ligasi.

53

Fig.14: Vettore pEGFP-N1

2.23. Clonaggio di soul1 nel vettore pCS2+ per mRNA

Il vettore pEGF-N1 non è adatto alla trascrizione di RNA poiché è privo di

promotori per le RNA polimerasi. E’ stato pertanto necessario rimuovere l’inserto

soul1/GFP da tale vettore per un ulteriore subclonazione in un plasmide idoneo,

pCS2+ (Fig.15) appunto (gentilmente distribuito da D. Turner, Univ. Washington).

Si è dunque estratto l’inserto tagliando il plasmide con due enzimi di restrizione,

BglII che taglia a monte di soul1, e NotI che taglia a valle della GFP. Si è in

seguito effettuato il “fill-in” dell’inserto e del pCS2+GFP, digerito con XhoI, per

poi effettuare la reazione di ligasi.

54

Fig.15: Vettore pCS2+

2.24. Clonaggio di soul2 nel vettore pCS2+GFP per mRNA

Per la preparazione di un costrutto soul2-GFP è stato possibile utilizzare il vettore

pCS2+GFP, incompatibile con soul1 in quanto recante siti di restrizione per il

subclonaggio presenti anche nella sequenza di soul1. Viceversa, la sequenza

nucleotidica di soul2 è risultata idonea a un subclonaggio effettuato mediante

NcoI, enzima di restrizione che taglia a monte e a valle della ORF (open reading

frame) della GFP. Si è dunque ipotizzata una strategia di clonaggio, con la GFP a

valle di soul2, disegnando una coppia di oligo:

Oligo forward contenente il sito per NcoI:

5‘ GGATCCATGGCGATGTATGTGGCTTC 3’

Oligo reverse senza codone stop e contenente il sito per NcoI:

5’ CCATGGCGGGTGCATGGACCCAAACTT 3’

55

Sono state pertanto compiute un'amplificazione e una reazione di ligasi, digerendo

inserto e plasmide con BamHI e XhoI. Si è verificato la direzione dell’inserto e la

correttezza della sequenza mediante sequenziamento.

Per ottenere l'mRNA di soul2-GFP, il plasmide è stato digerito con NotI e l'mRNA

è stato sintetizzato usando il kit “mMessage mMachine Sp6” (Ambion), seguendo

il protocollo standard.

2.25. Clonaggio di soul2-FlagTag nel vettore pCS2+ per

transfezione e mRNA

Per individuare la localizzazione citoplasmatica di soul2 si è proceduto con la

preparazione di un costrutto soul2-FlagTag, utilizzando il vettore pCS2+. La

sequenza nucleotidica di soul2 è stata idonea a un subclonaggio effettuato

mediante oligo contenenti la sequenza Kozak, ovvero una sequenza consenso per

l'inizio della traduzione (ACCAUGG) con un sito di legame per la subunità

piccola del ribosoma (Kozak, 1986), e i siti BamHI e EcoRI. Si è dunque

ipotizzata una strategia di clonaggio, con FlagTag a valle di soul2, disegnando la

seguente coppia di oligo:

Oligo forward, contenente la sequenza Kozak e il sito per BamHI:

5‘GGATCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGATGGCGATGTAT

GTGGCTT3’

Oligo reverse senza codone stop e contenente il sito per EcoRI:

5' GAATTCTCAGGGTGCATGGACCCA 3’

Si è pertanto proceduto con l'amplificazione mediante PCR a una temperatura di

dissociazione (melting) pari a 62° ottenendo un frammento di 600bp. Il prodotto

PCR ottenuto è stato purificato con il kit “QIAquick PCR Purification” (Qiagen).

Cinque volumi di Buffer PB sono stati aggiunti al volume di prodotto PCR. La

mix ottenuta è stata caricata su apposita colonnina QIAquick spin column e il tutto

è stato centrifugato a una velocità di 13000 rpm per un minuto. La colonnina è

56

stata lavata con il Buffer PE in centrifuga a 13000 rpm per un minuto e infine il

DNA è stato eluito in un volume finale di 50µL e conservato a -20°C.

Successivamente si è proceduto con la digestione dell'inserto e del vettore pCS2+

(Fig.15) con gli enzimi BamHI ed EcoRI. La reazione di ligasi è stata effettuata

utilizzando il protocollo già descritto in precedenza (vedi paragrafo 2.7.). Il

prodotto di ligasi è stato amplificato mediante trasformazione chimica, utilizzando

piastre con terreno di coltura LB, come previamente descritto, con resistenza

all'ampicillina. Si è verificato la direzione dell’inserto e la correttezza della

sequenza mediante sequenziamento.

L'mRNA è stato ottenuto utilizzando il kit “mMessage mMachine” (Ambion)

utilizzando l'Sp6 polimerasi.

2.26. Transfezione di soul2-Flag-pCS2+ in cellule epiteliali umane

293T

Le cellule 293T sono state incubate in un mezzo, “Dulbecco's modified Eagle's

medium”, contenente 10% siero fetale di bovino e 0.1% gentamicina a 37°C. Si è

proceduto con la preparazione di una miscela contenente medium più diverse

diluizioni di reagente di trasfezione (MIRUS) e la si è incubata per 10 minuti a

temperatura ambiente. Alla miscela precedentemente preparata è stato aggiunto un

microgrammo di DNA e l'incubazione è durata 20 minuti a temperatura ambiente.

La miscela contenente il DNA è stata aggiunta alle cellule e lasciata in

incubazione per due giorni a 37°C.

2.27. Immunofluorescenza su cellule

Dopo aver lavato le cellule con PBS 1X, si è proceduto con la fissazione in

paraformaldeide 4% in PBS 1X. Le cellule sono state nuovamente lavate nel

buffer e incubate in una soluzione di Blocking per 20' a temperatura ambiente. Un

anticorpo anti-Flag è stato usato ad una concentrazione di 1:100 e incubato nelle

cellule per un'ora. Per allontanare l'anticorpo le cellule sono state lavate con una

soluzione TBS triton 0.1%. L'incubazione in presenza dell'anticorpo secondario è

stata effettuata utilizzando un anti-rabbit 488, dal momento che il primario anti-

57

Flag disponibile era in coniglio. L'incubazione è stata effettuata al buio per evitare

la precipitazione della fluorescenza, per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo

ulteriori lavaggi in TBS triton 0.1%, le cellule sono state sottoposte ad un'ulteriore

incubazione con DAPI per evidenziare i nuclei. Il DAPI è stato usato a una

concentrazione di 1:10000. Dopo aver lavato le cellule con H2

2.28. Immunoprecipitazione e spettrometria di massa

O, si è proceduto al

montaggio dei vetrini contenenti le cellule con la soluzione Mounting Media.

L'osservazione e le immagini sono state ottenute mediante utilizzo di un

microscopio composito a fluorescenza.

Per ottenere informazioni circa il legame della proteina soul2 con altre proteine, si

è proceduto con esperimenti di immunoprecipitazione e spettrometria di massa.

Le cellule sono state transfettate come precedentemente descritto (vedi Paragrafo

2.26.) e cresciute in piastra con liquido di Dulbecco a 37°C per due giorni. Un kit

di estrazione e immunoprecipitazione della Active Motif è stato utilizzato

seguendo il protocollo suggerito dal kit stesso. Le cellule sono state prima lavate

con il buffer PBS/Inhibitors e poi sono state estratte utilizzando il buffer di lisi

Complete Whole-cell Lysis Buffer. Si è così proceduto alla co-

immunoprecipitazione utilizzando 5µg di anticorpo combinato con 500µg di

cellule estratte. Successivamente a lavaggi per allontanare l'anticorpo, le cellule

sono state incubate con proteine G ancorate magneticamente a “beads”. Dopo

ulteriori lavaggi per allontanare le proteine G, le proteine estratte sono state

caricate su gel di poliacrilammide per osservare la presenza di eventuali proteine.

Un'altra parte è stata sottoposta a esperimenti di Western Blotting per verificare

ulteriormente la presenza della proteina Soul2.

2.29. Colorazione dell’emoglobina embrionale con benzidina

Gli embrioni microiniettati con il morfolino specifico di soul2, sono stati tenuti a

28°C in H2O di fecondazione e lasciati sviluppare. Allo stadio di 48 hpf, sono stati

incubati in una soluzione di benzidina (620µg/mL), NaOH (10mM a pH 4.5) e

H2O2 (0.65%), sostanza che permette di rilevare la quantità di emoglobina

58

prodotta colorandola di rosso scuro. L’esposizione è durata 5 minuti, dopodiché

l’emoglobina contenuta nel sangue ha subito una reazione cromatica più o meno

forte a seconda della quantità di o-dianisidina ossidata che si è legata

all’emoglobina.

Il perossido d’idrogeno presente nella miscela si è ossidato in una reazione

catalizzata da una perossidasi, l'o-dianisidina, che nella sua forma ossidata è

colorata e presenta un massimo di assorbimento a 440 nm:

H2O2

In seguito, gli embrioni sono stati lavati in embryo medium, fissati in

paraformaldeide 4% in PBS 1X e conservati in glicerolo al 70% in PBS 1X. Gli

embrioni sono stati successivamente osservati al microscopio e fotografati.

+ o-dianisidina -------- > o-dianisidina ossidata

2.30. Esposizione degli embrioni a succinil acetone

Embrioni incubati a 28,5°C in embryo medium, sono trattati con succinil acetone,

sostanza che inibisce l'espressione del gene ALA-D (amino levulinato deidratasi) e

che quindi blocca la biosintesi di eme, 7.5mM o 15mM diluito in MBS 1X a inizio

somitogenesi (11 hpf) e a somitogenesi più avanzata (13 hpf).

Una parte degli embrioni utilizzata come controllo è stata incubata in MBS 1X

senza succinil acetone.

Si è proceduto con l'osservazione del corretto sviluppo degli embrioni fino alle 24

e 48 hpf, dopo di che gli embrioni sono fissati in paraformadeide 4% in PBS 1X e

conservati in metanolo 100% a –20°C. Gli embrioni sono stati osservati e

fotografati al microscopio Zeiss precedentemente descritto.

2.31. Purificazione di proteine

Due anticorpi monoclonali di coniglio sono stati acquistati dalla società Primm srl

(Milano) per le proteine soul1 e soul2.

I due anticorpi sono stati purificati a partire dall'antigene ottenuto mediante

l'unione del peptide sintetico fornito dalla ditta con la glutaraldeide legata alla

59

proteina BSA, a formare un complesso:

peptide – glutaraldeide – BSA

Il complesso è stato incubato per 2 ore a temperatura ambiente. Una membrana

Hybond-P è stata preparata ed equilibrata con 100% MeOH per 5 minuti e MeOH

50% in PBS 1X per altri 5 minuti. Successivamente la membrana è stata incubata

con l'antigene per un'ora a temperatura ambiente. Si è proceduto con la

preparazione dei sieri di Soul1 e Soul2 da purificare (2mL di siero in 8mL di PBS

1X). Dopo ripetuti lavaggi in PBS 1X, la membrana è stata incubata nell'anticorpo

per 30' a temperatura ambiente. Per staccare l'anticorpo dalla membrana, si è

proceduto con l'incubazione in 0.1 M citrato fosfato a pH 3. Il tampone è stato

prelevato e portato subito a pH 7.4 con Tris 2M e conservato a -20°C.

2.32. Saggio Elisa

Il test Elisa (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) è un saggio biochimico che

permette di rilevare la presenza di un antigene, grazie all'uso di uno specifico

anticorpo. Dopo aver rimosso gli antigeni dalla piastra e averli conservati a -20°C,

i pozzetti sono stati riempiti di una soluzione di blocking al 10% e incubati per 30

minuti a temperatura ambiente in agitazione. Dopo ripetuti lavaggi in PBS 1X per

allontanare la blocking, si è proceduto con l'incubazione in diverse concentrazioni

di anticorpo primario per 3 ore a temperatura ambiente. Dopo aver allontanato

l'anticorpo primario con lavaggi in PBS 1X, è stato aggiunto un anticorpo

secondario, anti-rabbit nel caso specifico, e lasciato in incubazione per un'ora.

Dopo aver allontanato l'anticorpo secondario con diversi lavaggi in PBS 1X, si è

proceduto con la detection utilizzando l'ABTS, un substrato di colore verde che

rivela la presenza dell'antigene. Opportuni controlli sono stati utilizzati.

2.33. Analisi mediante Western blotting

Per testare la specificità delle proteine, si è effettuata un'analisi mediante Western

blotting. In pratica le proteine sono state separate mediante un gel di

poliacrilamide contenente SDS per denaturarle. Le proteine sono state trasferite

60

dal gel ad una membrana (Hibond P) mediante blotting. Il principio del

“sandwich” si basa sul legame all'antigene presente sulla membrana da parte di un

anticorpo non marcato (anticorpo primario), per cui dopo aver incubato la

membrana in presenza di latte in polvere (milk powder) 5% per 30 minuti, si è

proceduto con l'incubazione negli anticorpi primari in diluizioni da 1:500 a 1:2000

a 4°C per tutta la notte. Per evidenziare il primo anticorpo è stato usato un secondo

anticorpo marcato (anticorpo secondario), nel caso specifico anti-rabbit, ad una

concentrazione di 1:10000 per un'ora a temperatura ambiente. Dopo diversi

lavaggi per allontanare l'anticorpo secondario, si è proceduto con la rivelazione,

mediante una soluzione ECL, su lastra.

2.34. Immunoistochimica

Dopo reidratazione degli embrioni e lavaggi in PBS 1X per allontanare il

metanolo, essi sono stati incubati in 10% H2O2

Gli embrioni sono stati incubati prima nell'anticorpo secondario diluito 1:200 in

3% NGS e successivamente nel complesso A-B (avidina – biotina), presente nel

kit Vectastain utilizzato. Dopo ulteriori lavaggi in PBT, si è proceduto con la

rivelazione del segnale mediante DAB (di-amino-benzidina). Gli embrioni sono

stati lavati, montati ed esaminati al microscopio.

in PBT per eliminare l'attività

delle perossidasi endogene. Successivamente gli embrioni sono stati

permeabilizzati con PK per diversi minuti a seconda dello stadio di sviluppo e

post-fissati in paraformaldeide 4% in PBS 1X. Dopo ripetuti lavaggi in PBS 1X,

gli embrioni sono stati incubati in 300µL di anticorpo primario diluito in 3% NGS

(normal goat serum) in PBT per tutta la notte.

2.35. Apoptosi

L'apoptosi è uno dei principali tipi di morte cellulare programmata negli organismi

multicellulari e comprende una serie di eventi biochimici che porta la cellula a

presentare determinate caratteristiche morfologiche e infine alla sua morte. Per

valutare se i cambiamenti morfologici del pronefro dei morfanti di soul2 era

dovuto a morte cellulare, è stato utilizzato il kit ApopTag (Apoptag Peroxidase In

61

Situ Apoptosis Detection Kit, Chemicon Cat# S7100). E' stata usata la fosfatasi

alcalina coniugata con la digoxigenina invece che la perossidasi fornita dal kit. Gli

embrioni morfanti sono stati fissati in paraformaldeide come da protocollo e

disidratati in EtOH. Successivamente gli embrioni sono stati incubati in una

soluzione di bleaching costituita da 2X SSC + 1% H2O2

+ 1% formammide. Dopo

ripetuti lavaggi in PBS 1X, sono stati sottoposti al trattamento con PK e post-

fissati in paraformaldeide per 20 minuti. Successivamente a lavaggi in PBS 1X, gli

embrioni sono stati incubati in Equilibration Buffer fornito dal kit. Sono stai poi

lasciati tutta la notte in Reaction Buffer + l'enzima TdT. Dopo aver rimosso la

soluzione di reazione, si è proceduto con lavaggi in tampone maleico (MAB) e

all'incubazione in una soluzione di blocking (Boehringer #1096176) con una

concentrazione di anticorpo anti-DIG (Roche) pari a 1:2000 per 4 ore. Gli

embrioni sono stati lavati abbondantemente con MAB e il segnale è stato rivelato

mediante incubazione in AP buffer più NBT/BCIP e monitorati al microscopio

Zeiss precedentemente descritto.

62

Tabelle delle soluzioni

Tampone della T4 Polinucleotide Chinasi (10x):

Tamponi impiegati per reazioni di Marcatura terminale, PCR e Ligasi

Tris-HCl (pH 7,5) 500 mM

MgCl2

DTT 50 mM

100 mM

Spermidina 1 mM

Tampone di Sintesi (10x):

Tris-HCl (pH 8,4) 200 mM

KCl 500 mM

Tampone di Ligasi (10x):

Tris-HCl (pH 7,6) 200 mM

MgCl2

DTT 50 mM

50 mM

BSA 500 mg/ml

LB – Mezzo di Luria Bertani (1 l)

Terreni di Coltura

NaCl 10 gr

Bacto-Triptone 10 gr

63

Estratto di lievito 5 gr

SOB

Triptone 20 gr

Estratto di lievito 5 gr

NaCl 5 M 2 ml

KCl 1 M 2,5 ml

H2

SOC

O fino ad 1 litro

Aggiungere al SOB per un litro :

MgSO4

MgCl

1 M 10 ml

2

Glucosio 1 M 20 ml

1 M 10 ml

TBE 10x (1 l)

Soluzioni per elettroforesi e per solubilizzare il DNA plasmidico

Tris 108 gr

Acido Borico 55 gr

EDTA 0,5 M (pH 8,0) 40 ml

TE

Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM

64

EDTA 1 mM

Tampone QBT

Soluzioni impiegate per mini- e maxi-preparazioni di DNA plasmidico

NaCl 0,75 M

MOPS (pH 7,0) 50 mM

Etanolo 15 %

Triton X-100 0,15 %

Tampone QC

NaCl 1 M

MOPS (pH 7,0) 50 mM

Etanolo 15 %

Tampone QF

NaCl 1,25 M

MOPS (pH 8,2) 50 mM

Etanolo 15 %

Tampone 1 -MBT-

Tamponi impiegati per la trascrizione in vitro, l’immunorivelazione e l’ibridazione

in situ

Acido maleico (pH 7,5) 0,1 M

65

NaCl 0,15 M

Blocking Solution

Blocking solution preparata secondo protocollo Thisse

PBT / 2% sheep serum / 2 mg per ml BSA

Tampone 2

"Blocking stock solution" diluita 1:10

Tampone 3

Tris-HCl (pH 9,5) 100 mM

NaCl 100 mM

MgCl2

Tampone di Diluizione

50 mM

H2

NTP (Nucleotidi Trifosfati)

O DEPC : SSC 20x : Formaldeide (5:3:2)

ATP 10 mM

CTP 10 mM

GTP 10 mM

UTP 6,5 mM

DIG-UTP 3,5 mM

66

Tampone di Trascrizione

Tris-HCl (pH 8,0) 400 mM

MgCl2

DTT 100 mM

60 mM

Spermidina 20 mM

Soluzione di Ibridazione

Formammide 50 %

SSC 5x

tRNA 500 µg/ml

Acido citrico fino a pH 6,0

Tween 20 0,1 %

Eparina 50 µg/ml

Staining buffer (tampone di colorazione)

NaCl 0,5 M

Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM

EDTA 5 mM

Tween 20 0,1 %

67

Tampone AP

NaCl 100 mM

MgCl2

Tris-HCl (pH 9,5) 100 mM

60 mM

Tween 20 0,1 %

PBS (Tampone Salino Fosfato)

NaCl 200 mM

KCl 3 mM

Na2HPO4

KH

10 mM

2PO4 2 mM

Stock salt solution 1l

Soluzioni per gli embrioni

Instan ocean sea salts 40g

H2O distillata 1l

Embryo medium 1l

Stock salts solution 1,5 ml

H2O distillata 998,5 ml

Blu di metilene 0,1%

68

MBS 10X stock solution

NaCl 0,88M

KCl 10mM

MgSO4 10mM

HEPES 50mM

NaHCO3 25mM

MBS 1X

MBS stock 1X

CaCl2 7mM

Gentamicina 50 µg /ml

Abbreviazioni

DEPC: Dietilpirocarbonato

SSC: Sodio Salino Citrato

69

3. RISULTATI

3.1. Analisi delle sequenze degli ortologhi soul1, soul2, soul3 e

soul4 di Zebrafish

La struttura cromosomica dei quattro omologhi di Zebrafish dei geni soul è riportata

in Fig.18. Le sequenze codificanti e le proteine corrispondenti mostrano,

rispettivamente, una lunghezza di 573bp e 191aa per soul1, 597bp e 199aa per

soul2, 597bp e 198aa per soul3 e 1172bp e 227aa per soul4. Di seguito sono state

riportate le sequenze nucleotidiche della regione codificante a partire dall’ATG di

inizio e le relative sequenze amminoacidiche a partire dalla metionina di inizio.

soul1

atgcttaaagccatcggtcaaactctgttttctactggactccaaaaccccaaatacacagctcaggagagtaagggtg

atgactatgaagtccgcacctaccaagcaacaaactgggtaagcacagttgtgactggcatggagcaggaccaagc

catgagcacaggctttagaagactcttcaaatacattcagggcagtaatgaaaagaagagtaaggtggagatgacga

caccggtgagttgtttgattgaccctggagcgggacctgcatgtgaaagcaccttcactgtgtccttttacatccctgag

gaacatcaagctgaccctcccaaacccactgacccagatgtttttatcgagagcagaaaagagctcactgcattcgtca

ggacctttggtggctttgctaacagtgagagctgctgtgaggagattctcaagctcatagaaagcctcaagagggatg

gcatgaaattcaaagaggcaccatattaccgagcaggatacgacagtcccttcaaactcaccggccgcaggaacga

agtctggctcatcaaagatgaggagtaa

Proteina:

MLKAIGQTLFSTGLQNPKYTAQESKGDDYEVRTYQATNWVSTVVTGMEQ

DQAMSTGFRRLFKYIQGSNEKKSKVEMTTPVSCLIDPGAGPACESTFTVSF

YIPEEHQADPPKPTDPDVFIESRKELTAFVRTFGGFANSESCCEEILKLIESLK

RDGMKFKEAPYYRAGYDSPFKLTGRRNEVWLIKDEE

soul2

atggcgatgtatgtggcttctgctctgtgtctccttgtcggacttgtatgtttcacagctacagaatgttggcaagcaccct

ggttttgccatcaaaaggactgccctgtgtacactgtggtaaaccaatatgaaatagaagaacgcaactatgaaatgag

caactggattaccaccgatattttaagcacaggcaaggatgatgtatcaactggattttggaaactatactattttattcaa

70

gggcaaaacaaggagaagcagattgctatgaccaggcctgtggtggtctcagtaaaggatggtgcggaggggcga

cgcgtctccatttctgtctttcagcaagaccccaacatccccgatccagttgacacgactatcagaaaaacagttgttcc

ggctggtactgtctatgtcaggtcatttggtgggtggccatctgatcaagacgcccaagataatgtgcagaagctaaag

gaggagctcaaggctgccggaaagcagtttattgaagaccaatttgaagcagctgggtacgactcaccattggagttg

ctcaacaggcacaatgaagtttgggtccatgcaccctga

Proteina:

MAMYVASALCLLVGLVCFTATECWQAPWFCHQKDCPVYTVVNQYEIEER

NYEMSNWITTDILSTGKDDVSTGFWKLYYFIQGQNKEKQIAMTRPVVVSV

KDGAEGRRVSISVFQQDPNIPDPVDTTIRKTVVPAGTVYVRSFGGWPSDQD

AQDNVQKLKEELKAAGKQFIEDQFEAAGYDSPLELLNRHNEVWVHAP

soul3

atgttctgaacactttctgtctgcggtaaacacggtcctgcggtaaactcgatggatagcggcgggtgtcggatgagcg

gcggcggcggaggactagacatgatcagcctggaggatctggagtcggtgtcggaggagcagctggagctggag

gaaccggaaccggagatggaggaggaggatctagatcagggcggcagactcctgcagtactggagggacgcgg

cccgcggacaccaggtggaggtgccgacagacatggcacaacccatccagcagatcacctccaataatgatggcg

cacacacacgggaaccagttccctacacactcatcacacgcaaggagaagtgtggcgaggtgctgtacgagaagc

ggcactatgagaaagcacactgggcctgcatcacggttcacgaggacacgtatgaacagagcgtctgctacggcttc

atgaagatcatgaggttcatctgccagcagaactcagcaggcagttatctgggcatgacgatacccatcgtgacggtg

gtgcgcacagatgagagtaacaccactctgtcccgcgccgtcactgtggcctattacctgcccacaccgtaccagaa

cgacccaccgcgaccgtacgacccagatatcctcattgaacagtggcccgctgcgatagtctacagtcggtcgttcac

gggcgccactaacgagctgtcgatcctccatgagctgcgcagcctggtcgaggctctggactgtcccgctctgggga

gcgactccttcatcgtggccggatacacgaaccctgcggccgcacaccgacacaacgagatctggttcctggagag

accctgagcccaccccttacctccagcggcgctgctgattggccgagtctgtctcatgtatatgcctaacacggattata

agctaaacccaaacacacaccaaaactggagaatcactgacgagccacaacactgatgctgaacgacaatcatgtg

cgcgccatcatcatgagcgcacacacacacacagagatgcacatagaaatacgtttctagaaatacatattcatgtaat

gaatccacaaatctataacacacacacacacacacacacacacacatttatatatatatgaatatattccgtcatagtgct

atttttgtgaaatatttttgtagccaaatgtgtcctcctgtgtacctgctgtaagtgcagatgtgaagcagtgaaataaacc

gctgttctgtcctctcagagtgtgtgtgaacgctgtcctcagaccagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttttccagcctcat

gtacagagcgctgtgaatgtaaacgccactgtgaccaggcttcatgtttctcttctgatctgaataataaactcactgaaa

tgaaaaaaaaaaaaaaaaa

71

Proteina:

MAQPIQQITSNNDGAHTREPVPYTLITRKEKCGEVLYEKRHYEKAPSTVFF

MHERTLKNRLFYFFSIVMNMTVDLCPAGSYLGMTIPIVTVVRTDESNTTLS

RAVTVAYYLPTPYQNDPPRPYDPDILIEQWPAAIVYSRSFTGATNELSILHEL

RSLVEALDCPALGSDSFIVAGYTNPAAAHRHNEIWFLERP

soul4

atgcgcagtatgaggctgtaaaatccccagcgctttaagctgtgtcgtgcgtttgttgtgtctgtcggagcttctggttga

cgtcaggacgatggctctgatccctttcgaggatctggagggattggatgacgagcaggtggacgatgatgtcactga

cagctctgagccaatggatgatgaggagcaggaccgaatgtacgcccactggcaggcggtgggacgaacgcatca

cgtggcggtgcctacagagatgagagcaccaatagaagagatgacgcggaggaaccagagcgcatgtgtttgtact

gtgggggaaaccggagcacccagacgaaacccacaccaacacggcgagaacatgcaaactccacactgaaaccc

caactgttccagccgaggctcgaactccgctaaccactgagccactgtttttagccgtctcaatcccagatatgccttga

acttcattaaggggatctggatctgttggctcatgtcagattgttgaaaatgtcagcaaaatactgagccaaaattgacttt

attaatgaaagcagcacactttttgttagttgtctgtaaaatgcttgttgatttaagagtttttcaatatttagactcgaaactg

gaccaaaactgtgtgttttatcagtctaaagcacagatgtcgggctcggttcctggagggccgcagctctgcacagttt

agttccaaccctaattaaacacacctgatcaaactaattgagtccttcaggcttgtttgaaacctacaggtgagtgtgttg

gagcagggttggaactaaactgtgcggggcttcggccctccagggattgagtttgacacccctgctctaaagcatcca

gcatcagtgcattttgattttgtgtttgatgtccacacatcgggcgactcttttacagcacagtttgagtattgttgaacatga

ttccttgcttttgtgacatgttaatggcttaggttgtacttgcttgtcacagtattttaaaaacctgcactccccttcagcgcct

gtaataataatgataataaagtttatttatagagcatctggcgtatgaacagtagcttgacgtgcttttcagacagtttaata

aatgtatgcaaataaacaaaaatgtgtttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Proteina:

MDDEEQDRMYAHWQAVGRTHHVAVPTEMRAPIEEMTRRNQSAEREQVPF

VTISRHEKLGEVLYEERVYPPGKWACVSKADALYEQSISNGFMKLMRFICK

ENSTGRYLGMSVPVVNEITMADDGTNFMKDVLTAYYLPAEYQDVPPQPTD

PDIHIIQRDSIRVITRVFFGTTTEETISRQISNLWELLGNSEDLLRDRYMIAVY

ENPGVPQRRNEIWFIRRG

Dall’allineamento delle proteine soul individuate in diverse specie è stato possibile

riconoscere alcuni motivi strutturali conservati (Fig.16), grazie anche all'utilizzo

del software LOGO (http://weblogo.berkeley.edu//logo.cgi), utile per valutare il

72

grado di conservazione degli amminoacidi per ogni posizione della sequenza

laddove le dimensioni della lettera indicativa dell’amminoacido è direttamente

proporzionale alla frequenza dello stesso. E’ stato così possibile osservare la

presenza di diversi amminoacidi conservati lungo l’intera sequenza. In particolare

sono state individuate sei proline in posizione 79, 97, 125, 134, 136 e 208 e

inoltre, è risultato conservato il dominio idrofobico solo per due coppie di

amminoacidi, una metionina e una treonina in posizione 76 e 77, ed una prolina ed

una valina in posizione 79 e 80. Quasi tutte le proteine presentano un tetrapeptide

N-E-V\I-W\M all’estremità 3’ (Fig.17).

Alla ricerca di possibili domini strutturali di natura funzionale, si è proceduto con

un'analisi bioinformatica delle sequenze dei geni soul, ottenendo un risultato

negativo. Attraverso l'utilizzo di programmi è stato possibile predire la presenza di

domini transmembrana (TMHMM e TMAP nel pacchetto EMBOSS) (Fig.18).

Questi programmi hanno evidenziato la presenza di un dominio amminoterminale

in posizione 4-32 del fattore soul2 e per confermare ulteriormente questo dato è

stato utilizzato, inoltre, un programma Kyte-Doolittle, che attraverso un grafico di

idrofilicità-idrofobicità ha confermato l’elevata idropatia del medesimo settore

(Fig.19).

Per dimostrare i rapporti filogenetici tra le proteine soul, ci si è serviti del

programma Neighbour-Joining applicandolo all’intero set di sequenze proteiche

individuate dai database. Le medesime sequenze sono state allineate utilizzando il

programma ClustalW. La cladistica molecolare delle proteine soul ha generato tre

principali cladi filogenetici. Il primo raggruppamento raccoglie le proteine soul di

origine batterica, oltre ad altre di origine vegetale; il secondo raggruppamento

contiene le proteine soul di vari organismi animali e vegetali, senza particolari

limitazioni sistematiche; il terzo, infine, è composto dalle proteine soul dei Cordati

(Fig.20).

73

Fig.16 Profilo di idropatia di soul1 (in alto) e di soul2 (in basso).

74

Fig.17 Profilo idropatico di soul1 (in alto) e soul2 (in basso).

75

Fig.18 Sequenza consenso “LOGO” della famiglia delle proteine soul. In

rosso, i residui conservati della regione idrofobica, in celeste il tetrapeptide

carbossiterminale.

76

Fig.19 Allineamento delle proteine soul mediante ClustalW.

77

Fig.20 Albero filogenetico dei geni soul

78

3.2. Analisi dell'espressione degli ortologhi soul durante lo

sviluppo di Zebrafish

L'ibridazione in situ, utilizzando sonde specifiche corrispondenti all’inserto di

cDNA dei geni di interesse, soul1, soul2, soul3 e soul4, ha mostrato il profilo di

espressione spazio-temporale di ciascun gene in diversi tessuti e organi di

embrioni interi di Zebrafish a vari stadi di sviluppo e in ovario e rene di adulto.

Sonde ad RNA antisenso e senso, marcate con digossigenina (Dig11-UTP), di

lunghezza compatibile con una buona specificità di ibridazione sono state

sintetizzate per i quattro geni soul.

3.2.1. Profilo di espressione di soul1

L’ibridazione in situ su sezioni di ovario di Zebrafish adulto ha confermato la

presenza del trascritto di soul1 (Fig.21). In particolare l’mRNA è risultato essere

presente in tutti gli stadi di differenziamento degli ovociti, da quelli immaturi (OI)

nei quali il segnale è più intenso e omogeneamente distribuito nell’ooplasma, a

quelli maturi nei quali il segnale è circoscritto alla zona periferica, suggerendo un

eventuale segnale associato alla membrana cellulare (MC).

Durante lo sviluppo embrionale, è emersa l'espressione di soul1 fin dai primi stadi

di sviluppo e infatti dallo stadio di 1 cellula allo stadio di 8 cellule, l’mRNA

endogeno è distribuito nel citoplasma di tutti i blastomeri, con un’evidente

gradiente verso il polo animale dei blastomeri, in prossimità dello strato sinciziale

che separa l’embrione dal vitello. Nel periodo di gastrulazione il segnale scompare

progressivamente dalle cellule del polo animale e appare circoscritto al margine

della gastrula, nel territorio endomesodermico posto in prossimità della regione

equatoriale. La formazione dell'organizer, centro embrionale di induzione degli

assi corporei, corrispondente allo stadio di shield in Zebrafish, coincide con un

ulteriore cambiamento nella distribuzione dell’mRNA di soul1 che appare

concentrato nelle regioni rostrale e caudale. Durante la somitogenesi il segnale è

presente solo all’interno della regione caudale dell’estensione del vitello. Sezioni

trasversali di questa regione allo stadio di 25 somiti mostrano come l’mRNA sia

concentrato perifericamente lungo l’intera circonferenza dell’estensione del

79

vitello. Allo stadio di 24 hpf, nuovi domini di espressione sono evidenti nel

sistema nervoso centrale, in particolare nel mesencefalo dorsale (tetto), e nei

somiti ad eccezione di quelli più anteriori. Inoltre, allo stesso stadio di sviluppo, è

rilevabile un ulteriore dominio di trascrizione in cellule ematiche localizzate nella

regione anteriore e ventrale del vitello (Fig.22).

80

Fig.21 mRNA di soul1 in ovario.

Fig.22 Ibridazione in situ whole-mount per soul1 in embrioni di Zebrafish a

diversi stadi di sviluppo. A: Espressione nell'embrione a 8 cellule; B:

Espressione nello strato sinciziale del vitello (YSL) a 6 ss.

81

Fig.22 C, D, E (sezione): Espressione nell'estensione del vitello (YE) dalle 16

alle 24 hpf; F: Espressione negli isolotti sanguigni sul vitello, estensione del

vitello e cellule del sangue posteriori a 30 hpf.

Fig.22 G: Espressione nei placodi olfattivi, ghiandola pineale e strato sinciziale

del vitello a 40 hpf; H: Espressione nei placodi olfattivi e nella ghiandola

pineale; I: Espressione nell'estensione del vitello a 60 hpf.

82

3.2.2. Profilo di espressione di soul2

Il trascritto di soul2 nell'ovario di Zebrafish adulto è distribuito uniformemente in

tutto l'ooplasma degli ovociti immaturi, contrariamente a quanto osservato negli

ovociti maturi dove è risultato circoscritto alla membrana cellulare (Fig.23). Nel

corso dello sviluppo embrionale l'espressione di soul2 è evidente in diversi

territori citologici ed embrionali, tra cui i placodi olfattivi e la regione degli archi

faringei. Interessante è risultata la presenza del trascritto nella zona antero-ventrale

del vitello allo stadio di 24 hpf, zona marcante le cellule ematopoietiche.

Inizialmente ristretto alla regione della cloaca, l'espressione di soul2 si estende

anteriormente alla zona del PD allo stadio di 24 hpf fino alla regione del DL a 48

hpf. Il segnale nel corso dello sviluppo regredisce posteriormente alla zona del PD

allo stadio di 72 hpf (Fig.24).

83

Fig.23 mRNA di soul2 in ovario.

Fig.24 Ibridazione in situ whole-mount per soul2 in embrioni di Zebrafish a

diversi stadi di sviluppo. A: Espressione nell'embrione a 4 cellule; B:

Espressione nella regione della cloaca a 18 ss; C (sezione): Espressione nel

pronefro a 24 hpf.

Fig.24 D, E: Espressione nel pronefro nella regione del DL a 36 e 60 hpf.

84

Fig.24 F e G: Espressione nei placodi olfattivi e archi faringei a 36 hpf.

Fig.24 H e I: Espressione nei placodi olfattivi e archi faringei a 44 hpf a 60 hpf.

85

3.2.3. Analisi dell'espressione di soul3 e soul4

Per quanto concerne il profilo di espressione del gene soul3, il trascritto è presente a

partire dallo stadio di gastrula a livello dell’anello germinale. A circa 10 hpf si è

rilevata la trascrizione di soul3 nella porzione rostrale dell’embrione. Durante la

somitogenesi, è stato osservato un abbassamento del livello di espressione di soul3

fino alle 24 hpf, periodo in cui non è stato possibile rilevarne la presenza

nell’embrione. Dalle 36 hpf e fino alle 70 hpf il segnale di soul3 è stato evidenziato

in diverse regioni del sistema nervoso: assoni, nervo ottico, retina e dalle 65 hpf,

ghiandola pineale (Fig.25).

Fig.25 Ibridazione in situ whole-mount per soul3 in embrioni di Zebrafish a

diversi stadi di sviluppo. A: Espressione nell'anello germinale in embrione al 75%

di epibolia; B: Espressione nella porzione craniale e caudale dell'embrione a 10

ss.

86

Fig.25 C-F: Espressione nel sistema nervoso: assoni, nervo ottico, retina dalle 36

hpf fino alle 65 hpf dove è visibile un segnale anche nella ghiandola pineale.

L'espressione di soul4 è stata rilevata a inizio somitogenesi (circa 10 hpf) e fino alle

65 hpf, solo a livello del sistema nervoso. In particolare, il trascritto ha mostrato una

specifica localizzazione nella commissura anteriore del diencefalo e nel

romboencefalo (Fig.26).

La dinamica spazio-temporale dei geni soul nel corso dello sviluppo di Zebrafish è

stata confermata attraverso RT-PCR (Fig.27). L'RT-PCR che ha documentato la

presenza dei trascritti agli stadi di sviluppo utilizzati per la caratterizzazione, ha

permesso inoltre di valutare il diverso grado di espressione dei quattro geni nel corso

dello sviluppo.

87

Fig.26 Ibridazione in situ whole-mount per soul4 in embrioni di Zebrafish a

diversi stadi di sviluppo. A-E: L'espressione del trascritto è ristretta solo al sistema

nervoso a partire dallo stadio di 10 hpf fino alle 65 hpf, in particolare nella

commissura anteriore del diencefalo e nel romboencefalo.

88

Fig.27 Dinamica spazio-temporale dei geni soul mediante RT-PCR

Il profilo di espressione del gene soul2 nei dotti pronefrici, di particolare interesse

per lo studio del metabolismo del ferro, ha ad approfondire le conoscenze su questo

gene nello sviluppo di Zebrafish. Per questo dopo aver studiato l'intera famiglia dal

punto di vista filogenetico, strutturale e di espressione genica, è stata condotta

un’analisi di tipo funzionale ristretta al solo gene soul2.

3.3. Espressione del gene soul2 nei morfanti ematopoietici

Per avere informazioni sulle possibili vie di segnale in cui il gene soul2 può essere

coinvolto sono stati effettuati esperimenti di ibridazione in situ utilizzando la

sonda specifica per soul2 su embrioni morfanti per il gene gata1 a diversi stadi di

sviluppo.

In tutti gli esperimenti effettuati ed esaminati, non sono stati osservate particolari

alterazioni nell'espressione del gene soul2, né di intensità né di distribuzione della

colorazione allo stadio di 24 e 40 hpf nei morfanti rispetto al controllo (Fig.28 A-

D).

Per confermare la bontà del morfolino gata1 gli embrioni iniettati sono stati

ibridati con un marcatore eritropoietico hbbe1 che non è più espresso nelle cellule

del sangue dei morfanti (Fig.28 E, F)

Questi dati di caratterizzazione molecolare hanno dimostrato che soul2 in

89

Zebrafish non è regolato da fattori di trascrizione ematopoietici.

Ctrl Wild type gata1 MO

Fig.28 Ibridazione in situ whole-mount in embrioni gata1 morfanti. A-D:

L'espressione del trascritto del trascritto di soul2 nel pronefro di embrioni wild

type e morfanti a 24 e 40 hpf; E-F: Espressione del gene hbbe1 nei morfanti

ematopoietici gata1 a 24 hpf.

90

3.4. Studi di gain-of-function mediante iniezione di mRNA

Dopo avere indagato la regolazione di soul2 da parte di geni coinvolti in alcune tra

le vie di segnalazione più importanti per lo sviluppo embrionale, è stato intrapreso

uno studio di sovraespressione genica mediante iniezione di mRNA sintetizzato in

vitro in embrioni allo stadio di una o due cellule.

In questi studi di sovraespressione è stata effettuata un’ibridazione in situ con geni

marcatori del pronefro ed ematopoietici. L’espressione di questi geni negli

embrioni iniettati con l’mRNA di soul2, analizzata a 48 hpf, è apparsa distribuita

in modo paragonabile a quella rilevata in embrioni non iniettati o iniettati con il

solo mRNA. L’intensità della colorazione, però è apparsa diversa, nonostante la

colorazione degli embrioni durante l’ibridazione in situ sia avvenuta per lo stesso

intervallo di tempo; negli embrioni in cui soul2 è sovraespresso, il segnale dei

diversi marcatori è presente con intensità minore (Fig.29).

Una parte degli embrioni in cui soul2 è stato sovraespresso è stata trattata con o-

dianisidina per verificare cambiamenti nella distribuzione di emoglobina rispetto

al controllo. Gli embrioni appaiono morfologicamente normali, anche se il livello

di emoglobina nel sangue sembra essere più marcato allo stadio di 48 hpf (Fig.30).

Questi esperimenti preliminari, che dovranno esser confermati e validati con altri

studi, suggeriscono che la sovraespressione di soul2 nei primi stadi di sviluppo

possa modificare il normale sviluppo del pronefro dell’embrione e la distribuzione

delle cellule sanguigne.

91

Ctrl wild type soul2 mRNA

Fig.29 A-L: Espressione dei trascritti gata3, slc12a1, trpm7, tfra1 e hhbe1 in

embrioni selvatici e overespressi rispettivamente allo stadio di 48 hpf.

92

wild type

soul2 mRNA

Fig.29 Embrioni overespressi trattati con o-dianisidina

3.5. Studi di loss-of-function mediante iniezione di morfolino

Per stabilire il ruolo funzionale dell'ortologo soul2 di Zebrafish durante lo

sviluppo del rene pronefrico e per analizzare l’effetto a carico della maturazione

eritrocitaria., sono stati condotti esperimenti di knock down mediante iniezioni di

oligonucleotidi antisenso (morfolino) in embrioni di Zebrafish allo stadio di una o

due cellule.

I morfanti di soul2 trattati con 0.3 mM di morfolino mostrano un aumento di

espressione del gene ret1 circoscritto alla zona della cloaca e del PD a livello del

17° e 18° somite allo stadio di 24 hpf, al contrario degli embrioni non iniettati in

cui il gene si esprime fino alla regione del DL a livello del 14-16° somite (Fig.31

A, B).

L'espressione del gene gata3 nei medesimi morfanti si restringe alla zona della

cloaca e il gene non appare più espresso nel corpuscolo di Stannio, contrariamente

a quanto avviene negli embrioni selvatici non trattati, in cui esso è localizzato fino

a livello del 14° somite, all'altezza del corpuscolo e del DL, allo stadio di 24 hpf

(Fig.31 C, D).

93

Mentre negli embrioni selvatici di Zebrafish il gene sc12a1 è espresso nella

regione del DE tra il 12° e il 13° somite, in quelli microiniettati con il morfolino di

soul2, allo stadio di 24 hpf, il trascritto appare regresso ed esteso anteriormente

(Fig.31 E, F).

Il gene trpm7 negli embrioni di 24 hpf non iniettati è localizzato nella regione del

PST tra il 9° e l'11° somite, mentre la sua espressione nei morfanti appare ristretta

anteriormente al 9° somite ed appare evidente un decremento dell'espressione del

gene allo stesso stadio di sviluppo (Fig.31 G, H).

L'insieme di questi dati suggerisce che soul2 non svolga un ruolo rilevante nelle

fasi iniziali del differenziamento del rene embrionale di Zebrafish, ma che possa

essere coinvolto, piuttosto, in un processo di migrazione cellulare.

94

Fig.31 Ibridazione in situ whole-mount in embrioni soul2 morfanti. A-H:

Espressione dei trascritti gata3, ret1, trpm7 e slc12a1 in embrioni selvatici di

Zebrafish e soul2 morfanti rispettivamente allo stadio di 24 hpf.

95

Per quanto concerne l'analisi di marcatori ematopoietici per analizzare l’effetto a

carico della maturazione eritrocitaria, sono stati usati geni come la beta globina1

e la transferrina 1a.

Dal confronto tra embrioni non trattati e quelli iniettati con 0.3mM di morfolino di

soul2 si è osservato un aumento delle cellule del sangue marcate con la globina1

nella regione posteriore della coda e negli isolotti sanguigni del sacco vitellino

(Fig.32 A, B).

Gli embrioni soul2 morfanti presentano un aumento dell’attività trascrizionale del

gene tfr1a rispetto ai controlli, suggerendo un eventuale ruolo di partecipazione a

meccanismi di trasporto ferro\eme (Fig.32 C, D).

Questi dati che mostrano come, in assenza di soul2, il livello di espressione di geni

ematopoietici aumenti, indicano che il gene soul2 possa in qualche modo essere

coinvolto nell’inibizione della biosintesi di eme.

96

wild type

soul2 morphant

Fig.32 Ibridazione in situ whole-mount in embrioni soul2 morfanti. A-B:

Espressione del fattore di trascrizione hbbe1 in embrioni selvatici di Zebrafish e

soul2 morfanti rispettivamente allo stadio di 26 hpf; C-D: Espressione del

trascritto tfr1a in embrioni selvatici e morfanti allo stesso stadio di sviluppo.

3.6. Rescue mediante co-iniezione di morfolino ed mRNA

Per testare la capacità del morfolino di bloccare la traduzione di soul2, è stato

preparato un costrutto con la GFP a valle di soul2. L'mRNA di soul2-GFP-pCS2+

è stato iniettato nella stessa quantità, espressa in molarità, di morfolino negli

embrioni a una cellula. Gli embrioni non iniettati sono stati usati come controllo

positivo. A 5 hpf, l'mRNA di soul2-GFP-pCS2+ ha mostrato l'espressione della

GFP nel blastoderma embrionale, a confermare il funzionamento dell'mRNA. Gli

embrioni coiniettati con morfolino e messaggero sono apparsi morfologicamente

normali a conferma della specificità del morfolino.

3.7. Effetti del morfolino sulla produzione di emoglobina

Un secondo gruppo di embrioni microiniettato con entrambi gli oligo morfolino è

stato trattato a 48 hpf e 72 hpf con o-dianisidina.

Nei morfanti di soul2 si è ottenuto un effetto rilevante con la concentrazione di

97

0.3mM. La colorazione è risultata molto attenuata sui morfanti rispetto ai controlli.

Col procedere dello sviluppo embrionale l’attenuazione della colorazione

dell’emoglobina sui morfanti è apparsa sempre più netta rispetto ai controlli in

conseguenza del maggiore numero di eritrociti che hanno generato una più

marcata colorazione nei controlli.

Questi dati suggeriscono che l’effetto del morfolino di soul2 sugli embrioni

microiniettati provoca una diminuzione dell'espressione di emoglobina nel sangue,

confermandone il coinvolgimento nell'eritrogenesi (Fig.33).

98

wild type

soul2 morphant

Fig.33 Embrioni microiniettati con morfolino di soul2 e trattati con benzidina.

99

3.8. Esposizione farmacologia degli embrioni al succinil acetone

Embrioni di Zebrafish sono stati sottoposti a trattamenti farmacologici con succinil

acetone.

Tutti gli embrioni sottoposti a tale trattamento non hanno mostrato alterazioni

importanti nello sviluppo. Gli embrioni fissati sono stati ibridati con la sonda per

soul2 (24 hpf). L’unica differenza tra gli embrioni trattati e i controlli la si è

riscontrata nei dotti pronefrici, dove l’mRNA di soul2 appare meno esteso

anteriormente (Fig.34 dati da riconfermare).

Fig.34 Effetto del succinil acetone sul differenziamento dei dotti pronefrici. A:

Controllo; B: embrione trattato con 15mM. Espressione del gene soul2 nei dotti

pronefrici (freccia rossa) e nelle cellule del sangue (freccia blu).

100

3.9. Localizzazione e funzione del gene soul2

Per confermare un coinvolgimento della proteina soul2 nella biosintesi dell'eme

sono stati effettuati esperimenti di transfezione in cellule endoteliali umane 293T.

In alcune cellule l'espressione della proteina soul2 sembrava essere estesa oltre che

nel mitocondrio anche ad altre regioni della cellula. Per verificare la localizzazione

nel mitocondrio, ho utilizzato un anticorpo mitocondrio specifico, gentilmente

acquistato dal Dott. Alan J. Davidson, MGH, Boston. Dalla sovrapposizione dei

due segnali è stato possibile confermare la presenza della proteina soul2 sia nel

mitocondrio che nel citoplasma come mostrato in Fig.35. Ulteriori indagini

dovranno essere effettuate per poter confermare tale dato, che suggerisce

l'eventuale partecipazione della proteina soul2 alla sintesi dell'eme.

101

Fig.35 Localizzazione della proteina soul2 in cellule 293T

102

3.10. Immunoprecipitazione della proteina soul2

Da preliminari esperimenti di immunoprecipitazione, da ripetere e sottoporre a

spettrometria di massa, è stato possibile osservare il legame tra la proteina soul2

con un'altra proteina la cui identificazione sarà rivelata da esperimenti di

spettrometria di massa. La conoscenza del legame della proteina soul2 con un altre

proteine nella cellula potrebbe essere essenziale per attribuire a soul2 un ruolo

funzionale.

103

4. Discussione

Le proteine soul costituiscono una famiglia poco conosciuta di molecole in grado

di legare eme (heme binding protein), e il loro ruolo durante lo sviluppo non è

ancora stato studiato. Nel 1998, Taketani e collaboratori hanno studiato il gene

p22HBP, descrivendone alcuni aspetti biochimici. La proteina p22HBP sembra

essere coinvolta nel metabolismo del ferro, e in particolare nella biosintesi

dell’eme in diverse tipologie di organi e cellule. Alla ricerca di geni coinvolti nella

regolazione del ritmo circadiano, Mark J. Zylka e Steven M. Reppert

individuarono nella retina e nella ghiandola pineale di pollo e topo la presenza di

RNA codificati da un gene, da loro battezzati soul, molto simile a p22HBP, e

istituirono la famiglia soul/HBP (Zylka e Reppert, 1999). Si ritiene che queste

proteine regolino la concentrazione di porfirine o di eme, la cui produzione in

eccesso può risultare tossica per la cellula (Blackmon et al., 2002). In particolare,

un dominio idrofobico di dieci amminoacidi in posizione 73-82 sarebbe

responsabile del legame con eme (Sato et al., 2004).

Nel corso del presente lavoro di dottorato, l’analisi delle banche dati di sequenze

nucleotidiche e amminoacidiche ha dimostrato che i geni soul sono presenti in tutti

gli organismi viventi, dai batteri alle piante agli animali (Fig.17).

Dall’allineamento delle varie proteine soul al quale è stata applicata l’analisi del

software LOGO, è stata individuata una sequenza consenso nella quale è possibile

riconoscere un pattern di residui tipico della famiglia proteica. Dal confronto tra i

membri della famiglia, è emerso che il dominio idrofobico è principalmente

caratterizzato dalla presenza di due coppie altamente conservate di amminoacidi,

ovvero metionina e treonina in posizione 78 e 79, e prolina e valina in posizione

81 e 82, per le quali è lecito ipotizzare un ruolo specifico di legame con eme

(Taketani et al., 1998; Sato et al., 2004). La sequenza consenso ha permesso anche

di riconoscere una sequenza di 4 amminoacidi posti all’estremità carbossilica (N-

E-V/I-M/W), e numerosi amminoacidi isolati, in prevalenza proline (Fig.16). Per

tali residui conservati è stato possibile ipotizzare un eventuale valore funzionale

e/o strutturale.

104

Lo studio della filogenesi molecolare delle proteine soul ha permesso non solo di

confermare l’identità dei geni di Zebrafish, ma anche di distinguere l’esistenza di

diversi raggruppamenti, o sotto-raggruppamenti. In particolare, un’analisi

preliminare dei rapporti filogenetici realizzata mediante il programma Neighbour-

Joining ha evidenziato tre principali cladi: il primo caratterizzato da omologhi di

batteri e piante, il secondo contenente geni distribuiti lungo l'intero arco

sistematico ad eccezione dei batteri, ed il terzo specifico dei Cordati (Fig.20).

Questo risultato permette di evidenziare come nuove copie di geni soul siano

apparse per duplicazione genica o genomica.

Per isolare i geni soul presenti nel genoma di Zebrafish, sono state consultate varie

banche dati, incluso il portale del sequenziamento del genoma e quelli di differenti

progetti di sequenziamento di EST, consentendo l'individuazione di quattro

membri della famiglia in questione. Il confronto delle sequenze dedotte delle

proteine soul di Zebrafish con quelle di altre specie ha confermato l’appartenenza

dei quattro geni alla famiglia dei geni soul. In assenza di un chiaro quadro

nomenclaturale riguardante questa famiglia, per la quale sono utilizzati nomi

diversi (soul, placental protein 23, p22HBP, HEBP1 o HEBP2), gli omologhi di

Zebrafish sono stati preliminarmente chiamati: soul1, soul2, soul3 e soul4.

Mediante programmi bioinformatici, le proteine di Zebrafish sono state analizzate

per identificare eventuali domini funzionali. Da questi studi è emersa la presenza

di un dominio transmembrana, situato all’estremità amminoterminale di soul2,

caratterizzato da un elevato grado di idrofobicità (scala di Kyte-Doolittle)

(Fig.17), suggerendo un meccanismo di ancoraggio della proteina alla membrana

cellulare.

L’analisi dell’espressione spazio-temporale dei quattro geni soul di Zebrafish

durante lo sviluppo embrionale ha evidenziato l’attività di questi geni in diversi

domini citologici ed embrionali, in parte condivisi.

In particolare tre sono gli aspetti che associano i geni soul1 e soul2 da un

punto di vista citologico:

Entrambi i geni sono espressi durante l’oogenesi come contributo materno (Fig.21

e Fig.23); durante l'embriogenesi, la prima evidenza di coespressione si riscontra

105

nella zona antero-ventrale del vitello dove è ristretta alle cellule ematopoietiche,

anche se il segnale di soul1 risulta meno intenso (Fig.22 e Fig.24); un’altra

regione di coespressione dei due ortologhi è evidente nel mesoderma somitico del

tronco.

Viceversa, tre principali motivi distinguono l’attività di soul1 da quella di soul2:

soul2 presenta un dominio di espressione nei dotti pronefrici del rene embrionale

(Fig.24), dove un iniziale segnale circoscritto alla porzione distale posteriore, nella

regiona cloacale, si estende anteriormente col procedere dello sviluppo embrionale

(Fig.24) fino a raggiungere l’estremità anteriore del rene embrionale a 72hpf

(Fig.24); soul1 è espresso nella testa e nell’estensione del vitello.

L’espressione di soul1 e soul2 durante la maturazione dei gameti femminili di

Zebrafish evoca l’attività del gene omologo RHBP, una heme binding protein

coinvolta nella proliferazione e nel differenziamento degli oociti nell’insetto

Rhodnius prolixus. In particolare, alla luce dell’interazione di RHBP con la

membrana cellulare, la restrizione periferica nell’ooplasma dell’mRNA di soul1 e

soul2, e la presenza di un dominio transmembrana in soul2, suggeriscono come

anche per le proteine soul di Zebrafish possa esistere un rapporto con la membrana

cellulare (Braz et al., 2001).

L'espressione di soul1 e soul2 nelle cellule del sangue poste sul vitello, similmente

all’espressione di alcuni geni coinvolti nell'ematopoiesi e nel metabolismo del

ferro, permette di ipotizzare un coinvolgimento di queste proteine nel processo di

differenziamento degli eritrociti, sia nei meccanismi di tipo “Non Transferrin

Bound Iron (NTBI)”, che in quelli di tipo “Trasferrin Bound Iron (TBI)”,

attraverso un coinvolgimento nella sintesi dell'eme. Inoltre la presenza del

trascritto di soul2 nel pronefro embrionale di Zebrafish evoca un probabile ruolo

morfogenetico di questa proteina, avvalorando allo stesso tempo l'ipotesi di un

ruolo ematopoietico, essendo il rene di Zebrafish il sito ematopoietico definitivo.

Per determinare con precisione in quale di questi processi (eritrogenesi e

nefrogenesi) sia direttamente coinvolto il gene soul2, è stata inibita la traduzione

delle proteine (“knock-down”) mediante microiniezione di oligonucleotidi di tipo

morfolino in uova appena fecondate di Zebrafish (Wang et al., 1998). Dal punto di

106

vista molecolare gli embrioni morfanti non hanno presentato marcate differenze

nell'espressione di geni ematopoietici e renali rispetto al controllo, suggerendo che

il gene soul2 non svolga un ruolo morfogenetico e differenziativo fondamentale

durante lo sviluppo del rene e del sangue. Tuttavia, per ciò che concerne il rene

embrionale, l’evidente anteriorizzazione dei domini di espressione di alcuni geni

espressi lungo i dotti autorizza ad ipotizzare un’implicazione del gene soul2 nella

migrazione delle cellule del pronefro. Ulteriori studi, quali doppie ibridazioni in

situ con marcatori renali e studi di cell migration dovranno pertanto essere

condotti al fine di poter attribuire con certezza tale funzione al gene soul2.

Nella ricerca di un collegamento con l'ematopoiesi, tra le varie ipotesi formulate

nella programmazione degli esperimenti, la partecipazione all’internalizzazione

del ferro associata al ciclo della transferrina è uno dei possibili ruoli considerati. In

quest’ottica, gli embrioni morfanti per il gene soul2 dovrebbero presentare difetti

di differenziamento delle cellule del sangue, quali eritrociti ipocromici o

alterazioni nell’espressione delle globine. Oppure, si attenderebbe di riscontrare

anomalie nell’espressione di soul2 in embrioni di linee mutanti ematopoietiche. In

altre parole, l'ipotesi più accreditata era quella relativa al ruolo di soul2 nella

biosintesi o nel trasporto dell’eme, per il quale erano facilmente prevedibili dei

fenotipi legati al momento in cui il gene avrebbe interagito con l'eme (Harigae et

al., 1998; Wang et al., 1998). In particolare, nel caso in cui soul2 fosse stato

direttamente coinvolto nella biosintesi di eme, erano attesi degli embrioni morfanti

con porfirie, malattie facilmente identificabili perché caratterizzate da eritroblasti

fluorescenti. Al contrario, se il legame con l'eme fosse avvenuto durante il

trasporto dal mitocondrio, si sarebbero dovuti osservare dei problemi nella sintesi

dell’emoglobina, e quindi nella maturazione degli eritrociti. Se, invece, il fattore

soul2 fosse stato coinvolto nel processo di degradazione dell’eme e quindi avesse

agito a livello dei macrofagi, si sarebbe dovuto ottenere un fenotipo caratterizzato

da vasi sanguigni piccoli e otturati, in particolare nel rene (Drummond, 2000).

Gli embrioni sono stati dunque microiniettati con l'oligo morfolino di soul2 e una

parte di questi embrioni è stata successivamente trattata con o-dianisidina (Fig.33),

mentre un’altra è stata caratterizzata con sonde specifiche per il sangue (Fig.32),

107

utilizzando come verifica embrioni morfolinati con gata1 (Fig.28). L’effetto della

microiniezione ha determinato un abbassamento della colorazione negli embrioni

trattati con o-dianisidina rispetto ai controlli, indicando una diminuzione

dell’emoglobina del sangue nei morfanti di soul2. Questo risultato è coerente con

l'ipotesi di un ruolo di questa proteina nell’ematopoiesi. L'ibridazione in situ sui

morfanti gata1 con la sonda per soul2 non ha mostrato un aumento dell’attività

trascrizionale del gene, suggerendo che soul2 non sia regolato da fattori

trascrizionali eritropoieitici (Fig.28), dato confermato dall'utilizzo del gene hbbe1

che non è più espresso nei morfanti gata1 come noto in letteratura (Galloway et

al., 2005 ).

Per ulteriormente avvalorare l’ipotesi di un ruolo nella biosintesi dell’eme si è

proceduto con l'individuazione della localizzazione del gene in cellule. La

presenza della proteina soul2 nel mitocondrio ha permesso di avvalorare l'ipotesi

di un coinvolgimento nella sintesi di eme, essendo il mitocondrio la sede in cui

avviene la produzione e l’immagazzinamento dell'eme. Altri esperimenti dovranno

tuttavia essere effettuati per confermare a livello funzionale il dato di

localizzazione.

L’espressione di soul2 nei dotti pronefrici ha permesso anche di postulare per

questo gene un ruolo di trasportatore di ferro durante la nefrogenesi.

Dal momento che per il differenziamento del rene è necessaria un’elevata quantità

di ferro (Yang et al., 2003) soul2 potrebbe intervenire da cofattore delle lipocaline

nel meccanismo di riciclo del ferro liberato dal catabolismo dell’eme a seguito

della lisi dei globuli rossi da parte dei macrofagi (Yang et al., 2003; Taketani et al.,

2005), processo attivo nel territorio embrionale posto dorsalmente all’estremità

posteriore dei dotti pronefrici.

Per avvalorare questa correlazione tra la disponibilità di eme e l’espressione di

soul2 durante la formazione del rene embrionale, gli embrioni sono stati trattati

con diverse concentrazioni di succinil acetone, una sostanza che inibisce l’enzima

ALA-D bloccando così la sintesi di eme. Tale blocco determina una minore

produzione di RHBP, lasciando presupporre un nesso tra la disponibilità di eme e

l’espressione genica (Braz et al., 2001). Tuttavia, il trattamento con succinil

108

acetone degli embrioni di Zebrafish non sembra impedire l’attivazione

trascrizionale di soul2 nei dotti pronefrici, escludendo un ruolo diretto di eme in

tale processo (Fig.34). La riduzione dell'estensione del dominio trascrizionale di

soul2 nel pronefro potrebbe essere spiegata come conseguenza dell’effetto

dell’assenza di eme, e quindi del riciclo del ferro, nella formazione dell'epitelio del

rene embrionale. Questa ipotesi lascia aperta la possibilità che soul2 possa essere

coinvolto durante lo sviluppo del rene embrionale in un meccanismo di tipo NTBI.

I dati fin qui acquisiti saranno ulteriormente verificati mediante esperimenti tesi

all'individuazione di proteine con cui si lega soul2, in modo da poterne meglio

caratterizzare la funzione mediante il collegamento con meccanismi molecolari

noti.

Da questo studio è stato possibile evidenziare il coinvolgimento del gene soul2

nello sviluppo del rene embrionale di Zebrafish. Pur non essendo tale

coinvolgimento determinante per la morfogenesi del primordio renale,

l’implicazione nel processo ematopoietico rappresenta una valida ipotesi per un

rapporto con il differenziamento terminale del suddetto organo. Ulteriori studi

saranno necessari per determinare in quale preciso momento di tale processo

l’attività del gene soul2 interviene in maniera determinante.

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