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Quaderno di istologia. Indagini istochimiche e

citochimiche.Scritto da Fabrizio Crisafulli

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Prima revisione (maggio 2007)

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Indice generale1 Introduzione..........................................................................................................................................................4

Strumenti e tecniche............................................................................................................................................42 Gli strumenti dell'indagine citoistologica.............................................................................................................6

I microscopi ottici...............................................................................................................................................7Le aberrazioni cromatiche nei microscopi.....................................................................................................7

I microscopi elettronici.......................................................................................................................................7I microscopi a fluorescenza................................................................................................................................8I microtomi.........................................................................................................................................................9

3 La preparazione di un campione.........................................................................................................................11Preparazione di un campione nella microscopia ottica.....................................................................................12

Prelievo........................................................................................................................................................12Fissazione.....................................................................................................................................................12

Fissazione con metodi fisici....................................................................................................................12Freeze drying dei tessuti biologici......................................................................................................13

Fissazione con metodi chimici................................................................................................................13Fissativi chimici primari.....................................................................................................................13Fissativi chimici secondari.................................................................................................................13

La colorazione..............................................................................................................................................13Struttura chimica di un colorante............................................................................................................14

Classificazione dei coloranti in base alla loro produzione.................................................................14Classificazione dei coloranti in base all'auxocromo ed al gruppo cromoforo...............................14

Tecniche di colorazione......................................................................................................................14La reazione PAS.............................................................................................................................14

4 Indagine delle molecole biologiche....................................................................................................................17Carboidrati........................................................................................................................................................17

Tecniche di localizzazione dei lipidi............................................................................................................17Lipidi.................................................................................................................................................................18

Tecniche di analisi dei lipidi.........................................................................................................................18Nucleotidi, DNA e RNA...................................................................................................................................20

Tecniche di analisi dei nucleotidi, del DNA e dell' RNA.............................................................................20Estrazione del DNA.....................................................................................................................................20

5 Immunoistochimica............................................................................................................................................22Anticorpi primari e anticorpi secondari............................................................................................................23I tipi di marcatori..............................................................................................................................................23

L'amplificazione del segnale........................................................................................................................23Il complesso biotina-avidina....................................................................................................................24I saggi ELISA..........................................................................................................................................24

6 I marcatori tumorali............................................................................................................................................26

Metodologie di indagine citologiche ed istologiche

1 Introduzione.Esistono diversi tipi di indagine medica o biologica. La sfera della vita, in ogni sua forma, tocca differenti punti che possono essere molto diversi tra loro. L'analisi di un organismo animale, in particolare, si pu svolgere su differenti fronti. L'animale infatti vive in comunit e interagisce con l'ambiente circostante ed compito dell'ecologia studiare tali rapporti. Un altro tipo di indagine pu essere quella di tipo comportamentale che sempre si svolge nell'ambito di pi organismi che idealmente condividono lo stesso spazio. Sappiamo che i delfini si muovono in branco, che i cani in genere sono i migliori amici dell'uomo, che l'istinto materno di una specie pu esplodere quando la madre adotta un cuccio di un'altra specie proprio grazie a tanti studi etologici effettuati nel corso di diversi secoli.

Dal punto di vista strettamente biosanitario le indagini si svolgono ad esempio su fronti di infettivologia/patogenesi e conseguente prevenzione che studiano la diffusione su un campione di popolazione l'incidenza e la prevalenza di malattie, di infezioni e come prevenirle. Ma una patologia, oltre che un evento possibile in una comunit, in prima istanza una realt che colpisce il singolo individuo.

Il virus dell'influenza stagionale colpisce, nel mondo, decine di milioni di persone ma per essere rilevato in modo preciso l'analisi viene fatta sul singolo e non sulla popolazione, che diretta conseguenza delle indagini effettuate. Quando una patologia manifesta, o quando si sospetta sia in corso od in fase di formazione, possibile individurarla mediante l'analisi dei tessuti (istoanalisi), delle singole cellule (citoanalisi) o dei fluidi corporei da questi prodotti. Nonostante la complessit dell'organismo relativamente facile diagnosticare una patologia.

Il tessuto costituito da una variet di elementi di caratterizzazione morfologica, chimica e funzionale differente ma la cui unit base, ovvero la pi piccola unit funzionale che ricalca la fisiologia del tessuto

stesso, la cellula. Dagli studi citologici, ovvero dagli studi sulla cellula, si evince la sua struttura e l'ultrastruttura interna, dando uno sguardo alle sue entit interne ad essa . Il citoplasma, il nucleo, il REL, i mitocondri e i corpi del Golgi sono soltanto alcune delle strutture che hanno una specifica funzionalit.

L'indagine del tessuto in modo globale, ovvero l'analisi della sua morfologia e della sua funzionalit, in diretta correlazione con l'analisi morfofunzionale delle cellule che lo compongono. La necrosi di un tessuto, ad esempio,

l'effetto globale che si vede nel tessuto ma la cui causa da ricercare nella cellula che formano il tessuto. Ci sono tanti altri esempi per comprendere come indagine tissutale e citologica vanno di pari passo e si svolgono per fini curativi, come ad esempio la ricerca di tumori, o per fini esclusivamente diagnostici come avviene nella ricerca della sclerosi laterale amiotrofica per la quale non ci sono, al momento, cure.

Strumenti e tecniche.Per poter effettuare l'indagine istologica ci si deve affidare a strumenti e tecniche. Gli strumenti sono tutti i mezzi con i quali viene fatta l'indagine mentre con il termine tecniche si indicano le varie procedure con le quali mettere in atto l'indagine. Il microscopio uno strumento mentre la colorazione del campione una tecnica. Con il microscopio, che uno strumento, si osserva ci che si colora, mediante la tecnica..

Esistono differenti tipi di strumenti e, per ognuno di essi, possono esistere differenti modelli proprio come esistono diverse tecniche, usate perlopi con protocolli simili. I microscopi, ad esempio, rappresentano una classe eterogenea di strumenti per vedere il piccolo contraddistinta da differenti modelli (microscopi ottici, elettronici, a fluorescenza). Ogni microscopio, inoltre, ha una propria peculiarit in quanto pu essere formato da lenti di diversa qualit, o elementi solidi che assicurano una maggiore precisione nell'analisi.

Quaderno di istologia: metodologie di indagine citologiche ed istologiche. Pagina 4/ 26

La sclerosi laterale amiotrofica.La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) una patologia dalla bassa incidenza la cui eziologia non chiara. L'esame per stabilire se un paziente affetto da SLA, dopo ogni accertamento volto ad escludere altre patologie, consiste nell'analisi del tessuto midollare, effettuato mediante risonanza magnetica nucleare, e la successiva biopsia che analizza il tessuto, nella morfologia, e le cellule nella struttura evidenziando, con opportune tecniche, le zone danneggiate.


Di per s il solo microscopio non serve a molto se non si adottano delle metodologie con le quali possibile la visualizzazione del preparato cito-istologico. Vedremo in avanti in dettaglio questi protocolli con i quali possibile osservare pi o meno in dettaglio i compartimenti tissutali o cellulari e, per adesso, possiamo limitarci nel dire che utilizzando diverse tecniche possiamo fare in modo di immobilizzare l'attivit tissutale, per prevenire i fenomeni di autolisi, colorare opportune zone in base a determinati fattori che possono essere la presenza di lipidi, di zuccheri, di acidi nucleici o di proteine in genere.

Mediante gli strumenti e le tecniche possibile includere il tessuto in un ambiente adatto ad essere conservato per anni, se non decenni, preservandone per lo stato per garantire una sufficiente qualit di analisi dello stesso nel corso degli anni.



2 Gli strumenti dell'indagine citoistologica.Abbiamo gi parlato, nell' introduzione, del fatto che per poter effettuare un'indagine citoistologica necessario osservare alcuni particolari del tessuto (indagine istologica) o delle cellule che lo formulano (indagine citologica). Abbiamo anche detto che quanto osserviamo nel tessuto , di solito, correlato a quanto possiamo osservare nella sua unit funzionale pi piccola, ovvero la cellula, per cui variazioni della fisiologia della cellula possono corrispondere a variazioni della morfologia, e della fisiologia del tessuto.

I tessuti sono insiemi di cellule che hanno in comune particolari caratteristiche. Il tessuto ghiandolare, ad esempio, composto da cellule che in gran parte condividono la funzionalit di sintetizzare delle macromolecole quali gli ormoni. Se gli organi, fatti da tessuti, sono solitamente grandi a sufficienza da poter essere visti ad occhio nudo la stessa cosa non la si pu dire per i tessuti o per le cellule. La cellula, in particolare, pu avere una dimensione media di 20M (20 micrometri) pari a 20 milionesimi di metro. A questi livelli l'occhio umano non capace di distinguere nulla in quanto la sua risoluzione massima, ovvero la capacit di distinguere due corpi in modo univoco se posti sullo stesso piano, di circa 0,2mm. Per questo motivo necessario usare degli strumenti che ingrandiscono, tramite lenti, la superficie da analizzare oppure mostrano un equivalente visivo della superficie su un monitor. Nel primo caso parliamo di microscopi ottici mentre nel secondo di

microscopi elettronici.

In realt l'indagine citologica non si limita semplicemente a vedere l' interno della cellula, o la sua organizzazione, ma sovente si rende necessario

sapere se un determinato elemento presente nel tessuto per cui si usa un indicatore che mostra, con un sufficiente grado di precisione, la presenza o meno del corpo sul quale verte lo studio all'interno del campione.

E' il caso della immunofluorescenza2 dove particolari microscopi captano radiazioni non necessariamente appartenenti allo spettro visivo che dimostrano la presenza di un complesso molecolare solitamente antigenico3.

Quella dell'indagine microscopica, sia ottica che elettronica o a fluorescenza, senza dubbio la fase pi importante in quanto il momento nel quale si osservano e si verificano le ipotesi precedentemente fatto, ovvero i motivi per i quali si reso necessario operare una indagine citoistologica. Questo passo tuttavia l'ultima operazione del lavoro che si svolge adoperando

altri strumenti. Il preparato presente nel microscopio, infatti, deve essere molto sottile altrimenti non potrebbe essere correttamente visualizzato, specialmente nella microscopia ottica, e per questo si rende necessario un microtomo ovvero uno strumento capace di tagliare sottili fette del tessuto.

Come facile intuire il tessuto animale, ed anche quello vegetale, non sempre ha consistenza tale da poter essere sezionato in modo facile ed immediato. La lama a

2 http://www.lacellula.net/appunti/immunologia/immunofluorescenza_citofluorimetria.html

3 Antigenico:Capace di scatenare una risposta immunitaria.


Il metedo scientifico e l'indagine.Fu Galileo Galilei, nel XVII secolo a mettere delle solide basi per il pensiero scientifico. Nell'indagine citoistochimica, a distanza di secoli, si utilizzano ancora le riflessioni dello scienziato in quanto l'osservazione e la verifica di una ipotesi seguono ancora i criteri di Galilei. Prendiamo a titolo di esempio il test dell'AIDS:

1) Ipotesi: Il soggetto positivo all' HIV?2) Osservazione: Saggi ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay) hanno un grado di affidabilit sufficientemente valido per verificare la presenza o meno dell' virus responsabile della sindrome da immunodeficienza acquisita.3) Metodologia: Si effettua il saggio immunoenzimatico con gli strumenti e le tecniche proprie dell' ELISA.4) Diagnosi: Il test negativo o positivo e, con un sufficiente grado di sicurezza, il soggetto sua volta positivo o negativo.5) Test di controllo: Si esegue un ulteriore test (che per la ricerca del virus HIV corrisponde all'analisi chiamata western blot) per aumentare ulteriormente il margine di sicurezza


contatto con zone molli potrebbe ridurre in poltiglia il tessuto e vanificare l'opera di estrazione. Per questo motivo necessario includerlo in un mezzo che da un lato fornisca una solidit tale da poter essere processato dalle lame di un microtomo e dall'altro deve presentare una grado di invasivit minimo tale da non precludere le operazioni di visualizzazione. La ricerca e la sperimentazione di oltre cento anni ha fornito diversi elementi che date le loro propriet chimiche si prestano bene a fornire strutture di sostegno ai tessuti. Stiamo parlando delle sostanze di inclusione che, spesso, sono delle emulsioni liquide di materiali che possono essere utilizzate solo se preriscaldate e successivamente lasciate raffreddare nel tessuto da esaminare.

I microscopi ottici.Il microscopio ottico uno strumento utilizzato per osservare preparati istologici con un modesto ingrandimento. La capacit visiva in un microscopio ottico si attesta mediamente sui 100-400 ingrandimenti per cui in un tessuto formato da cellule di media dimensione, circa 20 M, queste verranno ingrandite di 100-200 volte. Tali valori sono grossomodo sufficienti per apprezzare il nucleo con la cromatina condensata ed altre strutture endocellulari.

Il funzionamento del microscopio ottico molto simile a quello di una comune macchina fotografica dotata di zoom ottico. Una lampadina emette un fascio di luce che passa attraverso un condensatore. Generalmente il condensatore ha il compito di convogliare la luce verso il vetrino, dove apposto il preparato, e eventualmente filtrare alcune componenti cromatiche per colorare indirettamente il tessuto. Il vetrino posto su un piano che, attraverso alcuni sistemi meccanici, pu essere traslato in verticale o in orizzontale e in alcuni casi anche in obliquo. La luce che passa attraverso il tessuto viene incanalata verso una prima serie di lenti che prendono il nome di obiettivo. L'immagine ottenuta dalla luce che passa nell'obiettivo viene ingrandita per la prima volta e successivamente passa attraverso un tubo,

o canna del microscopio, fino a giungere ad una seconda serie di lenti che prendono il nome di oculare. Per garantire differenti livelli di ingrandimento esistono vari obiettivi posti in un disco rotabile che prende il nome di revolver attraverso il quale possibile scegliere l'ingrandimento desiderato semplicemente girando il revolver ed innestando un differente obiettivo.

La messa a fuoco della zona da visualizzare resa possibile grazie all'azione meccanica delle viti macrometriche e micrometriche che, rispettivamente, operano aggiustamenti pi o meno accentuati della distanza del piano rispetto alla canna contenente l'obiettivo.

Nei microscopi ottici moderni possibile usare una microcamera per poter registrare o fotografare il tessuto e, in altri microscopi, possibile adattare l'obiettivo per l'uso con comuni macchine fotografiche.

Le aberrazioni cromatiche nei microscopi.L'utilizzo di lenti di scarsa qualit, sia per l'obiettivo sia per l'oculare, pu produrre l'effetto dell'aberrazione cromatica ovvero un viraggio scomposto della

componente cromatica che si manifesta in particolare lungo i contorni degli elementi del campione che vengono visualizzati. Le aberrazioni, inoltre, possono in alcuni i casi portare alla visualizzazione di corpi inesistenti nel quadro visivo e alla formulazione di esiti falsati.

Le aberrazioni cromatiche in genere avvengono a causa delle scarsa qualit delle lenti o della costruzione del microscopio. La scelta di lenti migliori, inevitabilmente, comporta un maggiore costo del microscopio ma permette di ottenere risultati di maggiore qualit.

I microscopi elettronici.Il microscopio elettronico, a differenza di quanto abbiamo visto per il microscopio ottico, non visualizza

l'immagine in base ad un fascio di luce che passa


Illustrazione 1: Testa di una formica visualizzata con il microscopio elettronico.(Immagine di pubblico dominio)


attraverso il preparato ma usa una tecnica differente.

Nel microscopio a scansione un fascio di elettroni, generato da un apposita struttura, viene condensato in due o tre stadi e convogliato contro il preparato opportunamente realizzato e trattato. Gli elettroni rimbalzano sul preparato e vengono intercettati da un rivelatore che, in base al punto di contatto, genera un segnale. Tale impulso viene amplificato elettronicamente e visualizzato grazie ad un monitor.

Il vantaggio della microscopia elettronica , indubbiamente, rilevabile nella grandissima potenza di ingrandimento che pu toccare oltre i 50.000X. Gli svantaggi, per, sono notevoli. Il microscopio elettronico uno strumento dal costo non indifferente e, inoltre, i metodi di preparazione dei tessuti per l'osservazione comportano un tempo ed un costo di diverse misure maggiore rispetto all'analisi effettuata con il microscopio ottico.

I microscopi a fluorescenza.Il principio di funzionamento del microscopio a fluorescenza riconducibile alle propriet di assorbimento di diverse lunghezze d'onda di alcuni gruppi chimici e la loro restituzione dopo pochi istanti.

Alcuni molecole, come ad esempio l'isocianato di fluoresceina o la rodamina, se stimolate attraverso lunghezze d'onda comprese nello spettro della luce visibile (400-700nM) o di quella immediatamente inferiore (ultravioletto) e o superiore (infrarosso) assorbono parte della radiazione e la restituiscono con una lunghezza d'onda superiore di circa 20-40nm. In altre parole se ad una molecola dalla propriet fluorescenti si veicola della luce viola e questa molecola nello spettro di 400-420nm, che corrisponde proprio alla luce viola, ha il proprio range di assorbimento dopo un periodo di tempo, che si misura in sottomultipli del

millesimo di secondo, questa restituisce la radiazione con minore intensit ma con uno shift 4 pari a circa 20-40nM. Veicolando luce viola si ottiene luce blu, veicolando luce verde si ottiene rossa, mentre con l'ultravioletto si visualizza della luce viola.

Il microscopio a fluorescenza perlopi usato nelle indagini di immunoistochimica dove anticorpi marcati si

legano ad antigeni tissutali o, in alternativa, anticorpi marcati si legano ad altri anticorpi che, a loro volta, sono legati all'antigene.

Il vantaggio dovuto dall'utilizzo del microscopio a fluorescenza individuato nella facile visualizzazione di gruppi di molecole bersaglio. L'indagine antigenica in immunofluorescenza, ad esempio, mostra i focolai di infezione di un tessuto mentre l'indagine biomolecolare o tissutale, ovvero i test che si eseguono per vedere se un particolare composto biologico (glucidico, proteico) o una intera struttura (nervo, collagene) presente nel tessuto possiedono un'alta specificit.

Gli svantaggi della microscopia a fluorescenza, sono quelli dovuti al costo di preparazione del campione e alla necessit di veicolare verso lo stesso una luce pulita ovvero cromatograficamente priva delle lunghezze d'onda non necessarie. Per evitare questo si utilizzano filtri ad alto rendimento uniti a particolari sistemi di controllo elettronici che, nei microscopi pi evoluti, sono direttamente integrati nel corpo.

4 Shift: spostamento. In biologia sovente l'uso del termine shift per indicare delle variazioni lungo una scala


Illustrazione 2: Principio di funzionamento del microscopio a fluorescenza


I microtomi.I microtomi sono strumenti meccanico-elettronici il cui compito quello di sezionare parti di tessuto gi fissato ed incluso nel mezzo di inclusione.

Il microtomo seziona fette sufficientemente sottili del preparato pronte per essere osservate al microscopio ottico. Per quanto riguarda l'indagine in microscopia elettronica, invece, il microtomo non ha largo uso in quanto il preparato viene montato e ricoperto in modo differente.

Il microtomo, inoltre, uno strumento che viene utilizzato per sezionare campioni di tessuto animale ma va bene anche per essere utilizzato con campioni di origine vegetale.

Esistono differenti tipi di microtomo che si basano su diversi principi. Il microtomo a slitta, ad esempio, uno strumento manuale dove l'operatore fa scorrere il preparato che viene a contatto con la lama sezionatrice avendo, ovviamente, cura di utilizzarlo in modo opportuno per evitare lesioni personali.

Nel microtomo a rotazione, invece, la lama seziona il preparato mediante rotazione.

I microtomi elettronici sono molto pi costosi rispetto ai microtomi manuali ma permettono di ottenere sezioni di gran lunga pi raffinate grazie ai controlli integrati nelle circuiterie elettroniche.

Il microtomo elettronico , infatti, coadiuvato da elettromotori e sensori che regolano con precisione la distanza della lama dal preparato, la velocit di taglio in base alla consistenza del tessuto e dell'inclusione ed altri parametri spesso gestibili

dall'utente.

Un altro tipo di microtomo, definito microtomo congelatore, rappresenta la diretta evoluzione del microtomo elettronico con la possibilit di sezionare il preparato a temperature inferiori allo zero. Di solito l'ambiente nel quale avviene l'operazione e lama vengono portati a circa 40C e, a queste temperature, viene operato il taglio.

La necessit di operare sezionamenti a basse temperature si rende necessaria in alcuni campi della ricerca medico-biologica dove, in base al tipo di tessuto o di fissazione, opportuno operare a temperature inferiori per evitare la degradazione e la conseguente inutilizzabilit del preparato.

I campioni conservati a temperature basse, come ad esempio quelli posti in azoto liquido, in genere devono essere sezionati mediante l'ausilio del microtomo congelatore.


Illustrazione 3: Microtomo elettronico (Copyright www.otticaturi.it, si ringrazia l'azienda per la concessione dell'immagine)

I vari tipi di microtomo: Manuale

A slitta

Rotativo

Elettronico

Congelatore

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Riepilogo:Gli strumenti pi importanti utilizzati per l'indagine citologica ed istologica sono i microtomi, che sezionano parti di tessuto, ed i microscopi che visualizzano un immagine ingrandita del preparato.

Parole chiave:Microscopio, potere di ingrandimento, potere di risoluzione, microtomo, fluorescenza, spettro visivo.


3 La preparazione di un campione.La preparazione di un campione un passo fondamentale nell'analisi citologica. Dei buoni risultati finali si ottengono prestando attenzione alle fasi iniziali del processo.

Preparare un campione vuol dire effettuare una serie di procedimenti atti a conservare nel tempo il substrato cellulare.

Il tessuto vivo, una volta prelevato, tende ad autodistruggersi andando in contro ad una serie di processi che, a livello endocellulare, portano al digerimento progressivo di alcune strutture mediante fenomeni proteolitici. Il tessuto appena asportato, inoltre, viene privato di una serie di elementi necessari per la sua sopravvivenza. Le cellule, infatti, necessitano di nutrienti esogeni, di ossigeno, di segnali biochimici per poter sopravvivere e, inoltre, devono in qualche modo portare fuori i prodotti di scarto. Il tessuto asportato non pu fornire alle proprie cellule tali nutrienti che, anche per questo motivo, cessano di vivere. In ultima analisi qualsiasi tessuto pu venir danneggiato dall'azione dell'ossigeno dell'atmosfera che un potente ossidante o essere preda di batteri o microorganismi vari. Alla luce di ci si rende necessario fissare il campione.

Fissare un campione vuol dire fare una fotografia istantanea e prevenire che il tessuto stesso possa andare in degenerazione. E' un passo necessario per poter visualizzare, anche a distanza di tempo, il campione nella sua completezza. Un campione viene fissato a prescindere dal tipo di analisi realizzata o dagli strumenti necessario per poterla a termine.

E', invece, necessario operare diverse metodologie in base al tipo di indagine microscopica quando si deve

colorare un campione nella microscopia ottica o ricoprire un campione, per poter essere scansionato, nella microscopia elettronica a scansione.

La colorazione di un campione rende possibile l'osservazione delle sue pi piccole parti marcando, con

gli opportuni coloranti, gli organuli o particolari agglomerati di biomolecole interne.

La copertura di un campione, che si effettua nell'analisi con il microscopio elettronico a scansione, consiste nell' apporre uno strato di metallo pesante, quale l'oro od il palladio, per rendere possibile la repulsione degli elettroni lungo la superficie. Il metallo posto sopra il campione deve essere sufficientemente spesso da respingere gli elettroni ma, allo stesso tempo,

deve evitare una copertura totale che potrebbe compromettere i rilievi dello stesso eliminando particolari dettagli da apprezzare nella fase di osservazione.

Nella fase di copertura di un campione per l'utilizzo con il microscopio elettronico il metallo viene nebulizzato sulla superficie preferibilmente in modo perpendicolare giusto per farne risaltare i rilievi.


Perch la colorazione si effettua esclusivamente con le indagini mediante microscopia ottica e non con quella elettroniche a scansione?Perch i due sistemi utilizzano metodi differenti per la visualizzazione del campione. Nella microscopia ottica, infatti, la luce che viene convogliata verso il preparato vira di colore a seconda del colore del punto che colpisce. Un po' come avveniva nei vecchi proiettori di diapositive. Il microscopio elettronico a scansione, invece, utilizza un metodo che pi simile a quello usato dai radar . Un fascio di elettroni non passa attraverso il preparato ma rimbalza lungo la sua superficie e viene rilevato da un apposito strumento interno al microscopio. Colorare un preparato per la SEM, dunque, non ha senso in quanto importante ricoprire tale campione di sostanze proprio per permettere agli elettroni di rimbalzare


Preparazione di un campione nella microscopia ottica.

Prelievo.Il prelievo di un campione di tessuto consiste nell'asportazione di un piccolo frammento dall'animale vivo.

Gli strumenti del prelievo sono, solitamente, il bisturi, l'ago aspirato od il raschietto.

Il bisturi uno strumento chirurgico molto utilizzato formato da un manico e da una lama alquanto affilata. Mediante il bisturi possibile sezionare una parte di tessuto la cui forma pu essere ragionevolmente varia e, in linea generale, pu essere pi o meno invasiva in base al tipo di tessuto esportato ed alla sua dimensione.

Con la tecnica dell'ago aspirato viene introdotto un ago di dimensione ridotta all'interno di una ghiandola, solitamente la tiroide od un testicolo, con lo scopo di aspirare verso l'esterno il suo prodotto di sintesi, o eventualmente dell'essudato. L'ago aspirato un esame invasivo in quanto si rende necessaria la penetrazione epiteliale e ghiandolare.

Mediante il raschiamento possibile staccare piccoli frammenti di tessuto epiteliale formati da pochi strati cellulari. La tecnica del raschiamento fortemente utilizzata in ginecologia nell'esame del pap-test.(Si veda il box Pap-Test)

Fissazione.Subito dopo il prelievo necessario immobilizzare il tessuto per i motivi che abbiamo gi illustrato.

Immobilizzare il campione vuol dire bloccare i processi autolitici della cellula.

Per la microscopia ottica si utilizzano metodi fissativi fisici e chimici e la scelta viene operata in base al tipo di studio ed al tipo di tessuto da analizzare. La forza di determinati fissativi, intesa come la capacit chimica di degradare le molecole, potrebbe irrimediabilmente rendere inutilizzabile il campione

Fissazione con metodi fisici.I metodo fisici per bloccare la degradazione tissutale possono essere riassunti in tecniche che usano:

1. Il calore

2. Il freddo

3. Le microonde

Il calore solitamente un mezzo chimico drastico che attua il proprio lavoro su due fronti. Da un lato viene tolta parte dell'acqua presente nel tessuto mentre dall'altro si modifica la struttura quaternaria delle proteine, ovvero il loro ripiegamento tridimensionale, per cui buona parte del complesso endocellulare delle proteasi viene inibito. Gli strisci di sangue possono essere fissati mediante l'utilizzo del

calore.

Mediante le microonde si operano dei processi fisici molto simili a quelli prodotti dal calore. Le microonde sono radiazioni elettroniche ad altissima frequenza e bassa energia. La frequenza si attesta a circa 2,4GHZ mentre l' energia assorbita dal sistema generatore arriva al massimo ad 2-4kW.

Nonostante gli alti indici l'alta frequenza fa si che a pochi centimetri dall'emettitore, che generalmente un magnetron di brevetto statunitense, sia apprezzabile un campo energetico non capace di ionizzare le molecole, ovvero strappare loro degli idrogeni o degli elettroni dal guscio, modificandone le caratteristiche fisico-chimiche.


Il pap-test. Un esame salvavita.Il pap-test un esame non invasivo che pu salvare la vita alla popolazione femminile. Il nome deriva dall'ideatore, George Papanikolau, che nel 1943 mise a punto questa tecnica di osservazione e di colorazione delle cellula dell'utero per scopi medico-diagnostici.

Attraverso un raschietto, mediante l'aiuto di un divaricatore, viene estratto un campione di cellule della cervice uterina che viene poi colorato mediante il metodo Pap.

La colorazione del campione pu rilevare, con una efficacia prossima al 90-95%, eventuali neoplasie del collo dell'utero provocate, nella stragrande maggioranza dei casi, dal virus HPV (Human Papillomae Virus) e, per questo motivo, un ottimo strumento di indagine precoce.


Il principio del microonde semplice. La radiazione colpisce le molecole di acqua presenti nel tessuto e, in minor parte, alcuni gruppi di proteine, acidi grassi e lipidi. Queste molecole vibrano ed il movimento di frizione contro altri composti, e eventuali urti nel sistema, producono calore.

Di per s le microonde non sono ionizzanti e, ci, non rompono i legami chimici delle molecole. Per questo motivo il folding delle proteine non dovrebbe modificarsi ma, in realt, l'alta temperatura raggiunta dal processo pu denaturare il ripiegamento tridimensionale dei peptidi.

Il freddo non un vero e proprio mezzo di fissazione. Se un campione viene congelato e poi scongelato i fenomeni ossidativi e proteolitici avvengono comunque. Fintanto che il campione rimane sotto bassa temperatura, meglio se prossima allo zero assoluto, questo non si degrada per cui sarebbe pi opportuno definire il metodo fisico del freddo come metodo conservativo.

Freeze drying dei tessuti biologici.Mediante la tecnica del congelamento- essicazione (freeze drying per usare i termini inglesi) possibile conservare a temperatura molto bassa un campione di tessuto.

La procedura per effettuare il congelamento e la seguente essicazione la seguente:

1. Congelamento ultrarapida del tessuto a temperatura di circa -160 C. A questo punto l'acqua si trasforma in ghiaccio senza la formazione di cristalli che potrebbero inficiare sulla struttura cellulare

2. Essiccazione del tessuto che viene esposto a temperature di circa -40C.

La colorazione, che avviene dopo l'inclusione, dei tessuti processati avviene mediante l'utilizzo di particolari coloranti nebulizzati sul substrato.

E' importante comprendere che il rapido congelamento del campione ottenuto mediante temperatura inferiore ai 150C non permette all'acqua di formare cristalli che potrebbero danneggiare la struttura del tessuto. L'acqua, infatti, ha una propriet particolare per la quale alle basse temperature tende ad espandere il proprio volume

e questa peculiarit potrebbe causare del danno meccanico endocellulare o tissutale.

Fissazione con metodi chimici.L'utilizzo di fissativi chimici rappresenta la tecnica che spesso viene utilizzata nella preparazione di un campione. I fissativi chimici sono classificabili in due grandi gruppi: i fissativi primari e secondari.

Fissativi chimici primari.Quando una molecola chimica capace, da sola, di operare la fissazione si parla di fissativo primario. Alla categoria appartengono acidi relativamente forti come l'acido tricloroacetico, l'acido trifluoroacetico e meno forti come l'acido acetico oltre che a molecole polari come l'etanolo o il metanolo.

Fissativi chimici secondari.I fissativi chimici secondari da soli non sono capaci di fissare la struttura proteica della cellula ma servono per potenziare l'azione dei fissativi primari qualora questi non fossero efficienti nei confronti di alcune strutture endocellulari.

La colorazione.La colorazione un processo molto importante nel corso della preparazione di un campione per l'osservazione al microscopio ottico. Un buona colorazione, infatti, si traduce in una buona visualizzazione in fase di analisi mentre con una colorazione blanda, o poco accurata, possibile che i risultati ottenuti in analisi possano essere fuorvianti.

I coloranti sono perlopi molecole naturali o sintetiche solute in acqua. Il preparato incluso contiene la paraffina che non adatta per essere colorata e per questo motivo viene processato attraverso immersioni in serie decrescenti di xilolo per far avvenire la sostituzione della paraffina.

Struttura chimica di un colorante.Il colorante un composto chimico formato da tre gruppi. Il gruppo cromoforo rappresentato da un insieme di atomi che assorbono parti dello spettro della



radiazione visibile restituendo all'osservatore un colore privato della componente cromatica assorbita. In linea generare i sistemi insaturi, ovvero quelli con un doppio o triplo legame, o quelli aromatici, caratterizzati dalla dislocazione elettronica lungo una catena ciclica, sono dei cromofori. Un cromoforo legato con un gruppo aromatico, in genere, viene definito cromogeno.Il potere colorante, in realt, pi che altro dovuto alla presenza di un auxocromo che un gruppo chimico capace di legare la molecola ad un substrato. Gli auxocromi possono essere gruppi ossidrilici (-OH), alchinici (C=C), o amminici (NH2).

Classificazione dei coloranti in base alla loro produzione.In linea generale i coloranti possono essere classificati in naturali o sintetici. I coloranti naturali, come il nome stesso definisce, sono estratti a partire da elementi presenti in natura a differenza dei coloranti sintetici che vengono prodotti nell'industria.

L' ematossilina, in inglese Haematoxylum, ad esempio un colorante naturale estratto da una leguminacea (Haematoxylum campechianum) molto utilizzato nell' istochimica.

Classificazione dei coloranti in base all'auxocromo ed al gruppo cromoforo.

I coloranti possono essere, sommariamente, definiti acidi o basici in base ad alcune qualit chimiche del gruppo cromoforo e auxocromico. In linea generale le molecole aventi gruppi cromofori di tipo carbossilico (COOH) sono definiti acidi e reagiscono con le parti basiche della cellula. I cromofori aventi funzionalit

basica, di conseguenza, reagiscono con le parti acide della cellula.

Tecniche di colorazione.In generale il tessuto pu essere colorato mediante l'utilizzo di differenti coloranti, i quali vengono applicati grazie a protocolli ben conosciuti. Inoltre differenti parti del tessuto, come i nuclei cellulari od il citoplasma, risentono ulteriormente di altre tecniche di colorazione per cui usando contemporaneamente differenti colorazioni si possono distinguere differenti strutture.

Per colorare un tessuto si utilizzano metodi diretti oppure metodi indiretti. Com' facile intuire il metodo diretto pi semplice in quanto il colorante si aggancia direttamente al bersaglio da evidenziare mentre con il metodo

indiretto necessario operare uno o pi passaggi preparativi affinch il colorante possa svolgere il proprio compito.

Quando si ha necessit di osservare pi strutture endocellulari si possono usare due o pi coloranti ognuno dei quali ha una specificit per la struttura in questione. Questo possibile a patto che i coloranti stessi non reagiscano tra loro danneggiando il tessuto o comunque formando aberrazioni dell'osservazione. La colorazione combinata in assoluto pi usata quella dell'ematossilina-eosina, spesso abbreviata con E-E, nella quale il colorante basico eosina colora gli

acidi nucleici e, di conseguenza, il nucleo delle cellule eucariotiche mentre l'ematossilina, che un colorante acido, colora il citoplasma che leggermente basico.


Illustrazione 5: Formula di struttura della ematossilina

O

OH

HO

HO

OH

OH

Illustrazione 4: Formula di struttura della eosina Y

O

COOH

Br Br

Br Br

-O O

Le colorazioni semplici.Con i termini colorazione semplice si soliti indicare una tecnica di colorazione che fa uso di un solo colorante. Se il colorante reagisce con un solo tipo di struttura allora la colorazione sar ortocromatica mentre se, a differenza, un colorante reagisce con pi tipi di strutture virando il proprio colore allora si parla di colorazioni metacromatiche.Il blu di toluidina un colorante metacromatico in quanto capace di colorare nucleo o citoplasma di blu-violetto mentre alcuni polisaccaridi di rosso-rosso chiaro.


La reazione PAS.

La reazione PAS l'acronimo di Periodic Acid Schif reaction. Attraverso questa reazione si dimostra la presenza di carboidrati, come il glicogeno(si veda la colorazione dei carboidrati) e lipidi (si veda la colorazione dei lipidi.).

Per effettuare questa reazione si usa l'acido periodico (HIO4) che ha la caratteristica di ossidare gruppi chimici preesistenti ad aldeidi (R-CHO). La particolarit dell'acido periodico risiede nel fatto che un agente che non ossida ulteriolmente i gruppi ad acidi carbossilici.

Alla formazione dei gruppi aldeidici segue la colorazione mediante il reattivo di Schiff che altrimenti conosciuto come leucofucsina. La leucofucsina ottenuta dalla fucsina basica fatta reagire con acido solforico concentrato.

Coloranti di uso comune

Nome Tipo AffinitEosina Basico Colora il nucleo di rosa chiaro

Ematossilina Acido Colora il citoplasma di blu-viola

Blu di toluidina

Anfotero Colora il nucleo di blu-viola.Colora gli acidi nucleici di blu-viola.

Colora il citoplasma di blu-viola.Colora alcuni polisaccaridi di rosso.

Fucsina acida

Acido Colora gli eritrociti in arancione

Violetto metile

Acido Colora l'amiloide in viola.

Verde luce Basico Colora le fibre collagene in verde.

Blu alcian Basic Colara alcune mucosostanze (glicosaminoglicani) in blu.

Rosso congo Anfotero Colora i nuclei in blu.Colora l'amiloide in rosso.

Colora il connettivo in rosso.


Riepilogo del capitolo: La preparazione di un campione.L'indagine di un tessuto deve essere preceduta dalla fase di preparazione del campione in oggetto che ha lo scopo di bloccare l'autodecomposizione dello stesso e permettere l'utilizzo del preparato anche in tempi successivi. Dopo aver bloccato i processi digestivi, in base al tipo di indagine ed al microscopio utilizzato, si passa alla fase colorativa nella quale si utilizzano particolari sostanze, naturali od artificiali, con caratteristiche coloranti ed affinit a strutture biologiche, molecolari o cellulari particolari.

Parole chiave:Preparazione, fissazione, metodi di fissazione, colorazione.


4 Indagine delle molecole biologiche.In questo capitolo trattiamo, sebbene in modo molto generico, la colorazione di tre classi di composti bio-organici: i carboidrati, i lipidi e gli acidi nucleici.

Carboidrati.I carboidrati o idrati di carbonio o zuccheri sono molecole monomeriche o polimeriche formati da atomi di carbonio, idrogeno ed ossigeno. Il carboidrato pi semplice la gliceraldeide presente nelle due sue forme chirali D ed L. Gli zuccheri di valenza biologici sono simili, per la conformazione di un particolare atomo chirale, alla D-gliceraldeide per cui vengono definiti zuccheri della serie D.

Gli zuccheri possono essere presenti sotto forma di monomeri o formare polimeri. Un monomero una singola molecola ciclica di zucchero5 mentre un polimero il risultato della condensazione di due o pi monomeri uguali (omopolimeri) o differenti (eteropolimeri).

Tecniche di localizzazione dei carboidrati.La presenza dei carboidrati in una cellula pu essere investigata utilizzando

1 Metodi radiologici.

2 Metodi di colorazione.

2.1 Test di Tollens o Fehling (glucosio)

2.2 Reazione PAS (glicogeno)

Attraverso i metodi radiologici possibile tracciare il

5 La ciclizzazione degli zuccheri in ambienti acquosi e, di conseguenza, in ambienti endocellulari spontanea. Dentro la cellula, a partire da uno zucchero a catena aperta, si forma una grande quantit di zucchero a catena chiusa (99,7%) contro una esigua quantit di zucchero a catena aperta (0,3%)

percorso a livello endocellulare degli zuccheri e, in generale, di tutte le altre molecole marcabili in modo radioattivo.

La presenza di glucosio, in un tessuto o in una soluzione, pu essere facilmente dimostrata attraverso il test di Tollens od il test di Fehling. Nel primo caso si usa la reattivit di ioni argento che ossidano il gruppo aldeidico degli zuccheri aldeidici (glucosio, fruttosio, mannosio, allosio, etc) a gruppo carbossilico e precipitazione di argento metallico (Ag2).

Mediante il test di Fehling si utilizzano al posto dell'argento ioni rameici (Cu2+) o ferrici (Fe3+) i quali ossidano il gruppo aldeidico e si precipitano sotto forma di molecole metalliche.

La reazione PAS , invece, utilizzata per la rivelazione del glicogeno. Mediante l'utilizzo dell'acido periodico (HIO4) e la successiva colorazione mediante la fucsina basica il glicogeno viene colorato di viola.


Illustrazione 6: Reazione PAS per la ricerca del glicogeno(Immagine di pubblico dominio)

Illustrazione 7: Test di Fehling

O

H

OHH

OHOH

H OH

H

HO

H Fe3+

COOH

OH

H

OH

OH

CH2OH

H

HO

H

H

Glucosio Gluconato

Fe2+


Lipidi.I lipidi, dal punto di vista strettamente biochimico, sono degli esteri di acidi grassi con il glicerolo, o glicerina. Secondo la nomenclatura IUPAC il glicerolo un 1,2,3-propantriolo per cui possiede tre gruppi ossidrilici e tre atomi di carbonio.

Dal punto di vista biologico i lipidi, o generalmente triacilgliceroli (meno corretta la definizione di trigliceridi), sono molecole dall'enorme importanza in quanto costituiscono una fonte di riserva energetica, possiedono un ruolo strutturale per quanto riguarda la formazione delle membrane biologiche e rappresentano, con gli steroidi, dei messaggeri ormonali.

In base al tipi di struttura possibile classificare diversi tipi di lipidi. La struttura generalmente determinata dal sostituente di uno dei tre atomi di idrogeno ossidrilici.

Innanzitutto si pu operare una distinzione tra lipidi saturi e lipidi insaturi. I primi hanno, nelle catene laterali aciliche, carboni ibridizzati sp3 e pertanto presentano soltanto singoli legami. I lipidi insaturi, invece, possono presentare una o pi insaturazioni.

Le differenze tra lipidi saturi e lipidi insaturi sono, perlopi, di caratteri fisico. A parit di numero di atomi di carbonio il punto di fusione del lipide saturo sar minore rispetto al punto di fusione del lipide insaturo. L'acido stearico, un acido grasso a 18 atomi di carbonio, non presenta insaturazioni e fonde a circa 70C mentre l'acido oleico, che ha sempre 18 atomi di carbonio ma possiede una insaturazione, fonde a 16C.

Una ulteriore classificazione strutturale dei lipidi si basa sul tipo di catene e sul sostituente di uno dei tre gruppi ossidrilici del glicerolo o, in altri casi, della sfingomielina. Si distinguono quindi, oltre ai triaciligliceroli,i fosfolipidi, i lipidi che generalmente possiedono una catena acilica satura assieme ad una insatura e un gruppo fosfato, sfingolipidi che sono simili ai lipidi ma presentano al

posto del glicerolo la sfingosina, sfingofosfolipidi che sono sfingolipidi sostituiti da un gruppo fosfato. Altre molecole hanno caratteristica lipidica sebbene strutturalmente dissimili dagli esteri del glicerolo: queste sono gli steroli tra cui spicca il colesterolo.

Tecniche di analisi dei lipidi.Le tecniche di analisi dei lipidi iniziano dalla fissazione del tessuto da studiare. La fissazione pu essere ottenuta

mediante metodi fisici o metodi chimici.

La fissazione tramite freeze-drying la procedura fisica pi utilizzata, sebbene molto impegnativa e costosa. Garantisce ottimi risultati a patto che venga eseguita con particolare cura.

In alternativa i lipidi possono essere fissati usando la glutaraldeide, o

l'aldeide formica (formalina). I metodi appena descritti possono per portare alla distruzione della componente lipidica.

Per quanto riguarda la colorazione dei lipidi questa differisce in modo pi o meno sostanziale a seconda del tipo di molecola da osservare. E' per questo motivo che pur essendo nella stessa famiglia di composti biochimici

il colesterolo viene colorato con un colorante differente rispetto ad un fosfolipide.

In linea generale i lipidi possono essere localizzati mediante l'ausilio di lisocromi. I lisocromi sono molecole aventi gruppi cromofori con scarsa affinit per l'acqua ed alta affinit per i lipidi nei quali si sciolgono. Mediante i lisocromi sciolti possibile vedere al microscopio zone pi o meno colorate che sono indice che la sostanza si sciolta dentro un

ammasso lipidico.

I lipidi insaturi vengono colorati grazie alla reazione del tetraossido di osmio (OsO4) che reagisce ossidandosi a biossido di osmio (OsO2).

I fosfolipidi vengono individuati grazie alla tecnica


Illustrazione 8: Formula di struttura del glicerolo

HC

H2C

OH

H2C OH

OH

Illustrazione 9: Struttura generica di un lipide o triacilglicerolo

H2C

HC O

O

H2C O

C

O

CH2 CH3n

OC R

OC R


PAS (Periodic Acid Schif) che, come abbiamo visto per i carboidrati, consiste nel trattamento del tessuto con acido periodico e successiva reazione di contrasto con la fucsina basica.

I plasmalogeni rappresentano una sottoclasse dei fosfolipidi. Possono essere rilevati mediante l'utilizzo della tecnica di colorazione di Feulgen

Nome Colorazione mediante

Descrizione

Lipidi(generale)

Lisocromi Mediante i liscocromi si colorano i lipidi neutri in in differenti tonalit

Fosfolipidi Acido PAS,Luce polarizzata

Mielina Tetraossido di osmio (OsO4) e seguita da perclorato di potassio (KClO4) fissazione in formalina

Mediante la tecnica tetraossido di osmio-perclorato di potassio possibile distinguere la mielina normale, che non si colora, dalla mielina degenerata che tende a scurirsi.

Plasmalogeni Reazione di Feulgen

Attraverso la colorazione di Feulgen possibile risaltare i plasmalogeni.



Nucleotidi, DNA e RNA.Gli acidi nucleici sono molecole biologiche dall'enorme importanza. Sono delle lunghe catene eteropolimeriche formate da nucleosidi legati tra loro da ponti fosforici. Attraverso gli acidi nucleici possibile conservare l'informazione genetica e trasmetterla per la riproduzione cellulare.

Dal punto di vista strutturale i nucleosidi sono formati da uno zucchero (ribosio nel DNA, deossiribosio nell' RNA), una base azotata. Le catede nucleosidiche sono legate mediante ponti fosforici.

Gli acidi nucleici, per le propriet appena viste, possono essere localizzati mediante l'ausilio di alcune tecniche.

1. Reazione di Feulgen. 2. Reazione basofila di

dimostrazione del fosfato.3. Autoradiografia.

Tecniche di analisi dei nucleotidi, del DNA e dell' RNA.La colorazione di Feulgen un metodo semplice ed economico per mettere in evidenza il DNA. Attraverso una blanda idrolisi possibile separare il ribosio dalla base e dall'acido fosforico. Dopo la separazione si colora il tutto attraverso il reattivo di Schiff (fucsina basica) e il preparato assume nelle zone di presenza del DNA una tonalit rossa o rossa-scura. La colorazione di Feulgen valida soltanto per il DNA e non per l' RNA che presenta un ribosio pi resistente all'idrolisi.

L'autoradiografia un modo per tracciare un nucleotide all'interno della cellula per vedere il suo movimento e la sua localizzazione. Attraverso un nucleotide marcato radioattivamente, utilizzando ad esempio il trizio, possibile seguire lo spostamento del nucleotide radioattivo mediante l'utilizzo di rilevatori di radioattivit o tecniche radiofotografiche.

Il gruppo fosfato, in ultima analisi, che nella catena di

DNA/RNA funge ponte esterico pu essere dimostrato utilizzando la dimostrazione basofila del fosfato.

Estrazione del DNA.Nonostante il DNA sia la molecola chiave della vita la sua estrazione non affatto difficile a patto di operare con gli strumenti giusti. Dal punto di vista tecnico l'attrezzatura necessaria per ottenere del DNA con un

sufficiente grado di purezza consiste in pochi mezzi di laboratorio: delle provette, un contagocce, un becker e vari recipienti riscaldabili. I reagenti, o comunque i prodotti, chimici da usare si limitano ad un sapone, o detergente, per demolire la membrana cellulare ed un alcol per far precipitare il DNA. Opzionalmente possono essere usati degli enzimi proteolitici per allontanare la parte proteica invischiata nella molecola di acido deossiribonucleico.

I passi per ottenere del DNA sono i seguenti:

1. Riscaldare a 60-70, per 20 minuti, gradi in acqua e sapone poco concentrato il tessuto da analizzare per bloccare l'attivit proteolitica degli enzimi e per digerire la membrana.

2. Raffreddare il tutto in acqua quasi ghiacciata per un tempo di

7-10 minuti.

3. Filtrare, mediante delle maglie non troppo strette, il tessuto ridotto in poltiglia dopo l'esposizione al calore

3.1.Eventualmente usare un enzima proteolitico per la rimozione degli istoni. (Passo opzionale)

4. Far precipitare il DNA, attualmente invisibile, mescolando una quantit non eccessiva di alcol.

5. Colorare utilizzando un colorante acidofilo come l'ematossilina (in rosso) o toluidina (blu-violetto).


Illustrazione 10: Formula di struttura del nucleoside AdeninaL'adenina, come tutti gli altri nucleosidi, una molecola formata da una base azotata (adenina) legata tramite un legame azoto al ribosio.

OCH2OH

H

OH OH

H H

CH2OH

N

N

N

N

NH2

Riepilogo del capitolo: Indagine delle molecole biologiche.L'indagine delle molecole biologiche verte, essenzialmente, sulla loro localizzazione spaziale all'interno della cellula e, in alcuni, caso sulla loro qualit.

L'importanza di analizzare, qualitativamente e quantitativamente, la presenza di una molecola ad alta affinit biologica un aspetto fondamentale dei metodi citochimici ed istochimici. Ogni classe di molecole ha in genere un proprio protocollo di analisi e, per questo motivo, osservare un preparato per avere informazioni sulla sua componente lipidica differisce dall'osservazione di un campione per ottenere informazioni su eventuali acidi nucleici in esso presenti.

Parole chiave:Colorazione dei carboidrati, colorazione dei lipidi, colorazione del DNA e degli acidi nucleici.


5 Immunoistochimica.L' immunoistochimica pu essere considerata come una disciplina a s stante. Il suo campo di studio riassumibile nella ricerca immunologica all'interno dei tessuti. L' immunoistochimica si serve di metodologie, di strumenti, e di protocolli di indagine proprie ed uniche ma molto simili a quanto adoperato nelle analisi da laboratorio in microscopio ottica ed elettronica. I microscopi, in particolare, sono quasi sempre il passo finale dell'indagine immunoistochimica e per questo motivo le conoscenze citochimiche ed istochimiche vengono a fondersi, quasi per diretta conseguenza, con le pratiche di immunologia dei tessuti.

Per comprendere, in dettaglio, cosa studia l'immunoistochimica dobbiamo fare un passo indietro illustrando, seppur brevemente, il sistema immunitario animale ovvero quel complesso meccanismo cellulare, biochimico e fisiologico che entra in gioco quando nel corpo entrano molecole estranee potenzialmente capaci di creare delle patologie.

La difesa immunitaria garantita da un complesso meccanismo fatto da cellule che si scambiano messaggi biochimici. In questo sistema hanno ruolo i linfociti, i macrofagi, le cellule NK globalmente definite come difese cellulari che hanno il compito di combattere tutto ci non-self6 mediante la sintesi, e l'utilizzo, di molecole

6 Non-self: Diverso. In immunologia la definizione di self e non self di fondamentale importanza. Con il primo termine si intende l'insieme di strutture (cellule, molecole, strutture) appartenenti ad un determinato organismo. Con il secondo, invece, si indica tutto ci che non appartiene all'organismo e risulta ad esso estraneo. E' anche importante comprendere che anche la stessa classe di cellule, ad esempio gli eritrociti prelevati da un paziente A, pu apparire non-self se posta a contatto con un altro individuo (o animale), come nel caso che

conosciute come difese umorali. Il riconoscimento del non-self avviene quando un componente della difesa cellulare, per mezzo di un recettore posto solitamente lungo la sua membrana che

del tutto simile ad un anticorpo, capta un particolare segmento della molecola, o della cellula, estraneo definito antigene. Questo pu scatenare la risposta immunitaria mediante diverse zone dell'antigene: a livello di un epitopo oppure a livello di un aptene. L'epitopo una parte dell'antigene che ha specificit nei confronti dell'anticorpo e viene, per questo motivo, definito come sito di legame dell'anticorpo. Un antigene pu avere differenti zone epitopali e di conseguenza ha la capacit di legare a s differenti anticorpi.

L'aptene , invece, una molecola di basso peso molecolare, come un carboidrato od una piccola proteina, capace di legare un anticorpo7 ma non sufficientemente in grado di scatenare una risposta immunitaria8.

Le tecniche dell'immunoistochimica.

La caratterizzazione antigene-anticorpo, ovvero lo studio su come un antigene si lega all'anticorpo in modo pressoch specifico pu essere fatta anche in laboratorio. L'anticorpo, infatti, agisce sia in condizioni fisiologiche, ovvero nell'animale vivo, sia in condizioni

tali eritrociti vengano introdotti in un individuo B. Il corpo animale capace di riconoscere con estrema precisione ci che proprio da ci che estraneo.

7 L'anticorpo legato pu essere quello prodotto dai Linfociti B sia quello presente nella membrana degli stessi che ha il compito di rilevare la presenza del corpo non-self per iniziare la biosintesi anticorpale

8 La risposta immunitaria , nei confronti degli apteni, pu essere iniziata qualora questi si legano a particolari molecole definite carrier.


Illustrazione 11: Struttura di una immunoglobulinaSi notano tre regioni: FAB (Fragment Antigen Binding), la cerniera, e la regione FC (Fragment Cristallyzed) uniti da ponti disolfuro (in rosso). Le regioni possono essere variabili (V) o costanti (C) ed appartenere a catene leggere (L) o pesanti (H).


sperimentali.

Nell' immunoistochimica si sfruttano anticorpi trattati in modo particolare per stabilire se in un dato tessuto presente un antigene. Si pensi ad esempio nei casi clinici nei quali necessario sapere se un paziente affetto da Epatite di tipo B9 (virus HBV, famiglia hepadnaviridae, genere orthohepadnavirus). Per effettuare la diagnosi infettiva si ricorre all'utilizzo di anticorpi marcati, ovvero immunoglobuline trattate in modo particolare che possono essere rilevate dagli strumenti di laboratorio.

Se c' in circolo l'antigene che, nel nostro esempio, definito HBsAG gli anticorpi marcati si legheranno ad esso e, dopo un lavaggio, permarranno nel tessuto. L'analisi positiva della persistenza dell'immunoglobulina marcata indica che nel sangue del paziente presente l'antigene HBsAG e, con ogni probabilit, questo fa parte del virus HBV. Qualora l'osservazione del campione trattato con anticorpi marcati dia esito negativo, con un sufficiente margine di certezza10, si pu diagnosticare che l'individuo non caratterizzato da una infezione virale.

Anticorpi primari e anticorpi secondari.Un anticorpo, come abbiamo visto, si lega all'antigene e pu essere rilevato se marcato con una opportuna molecola. Modificare ogni singolo anticorpo, per, un procedimento molto costoso e per questo motivo la marcatura primaria, ovvero quella dove un anticorpo primario si lega direttamente ad un antigene, quasi sempre sostituita dalla marcatura secondaria. In questo

9 Per maggiori informazioni http://www.lacellula.net/atlanti/virus/hepadnaviridae/orthohepadnavirus/hbv.html

10 In qualsiasi analisi c' sempre una piccola probabilit di commettere un errore che pu dipendere da un fattore umano, da una errata calibrazione degli strumenti o dal fatto che il sistema in analisi non si comporta come da modello.

tipo di osservazione un anticorpo primario si lega all'antigene e, a sua volta, viene attaccato da un anticorpo secondario anti-anticorpo primario.

I grandi vantaggi della marcatura secondaria sono rappresentati dalla maggiore economicit, in quanto si risparmia il processo di marcatura per ogni possibile anticorpo anti-antigene, e di tipo operativo, poich l'anticorpo primario pu essere attaccato in differenti punti con anticorpi secondari anti-anticorpo marcati.

In particolare l'utilizzo di un anticorpo secondario contro un anticorpo primario rende possibile l'esistenza di un ristretto numero di tipi di anticorpo secondario marcato, ad esempio anticorpo anti anti-corpo di pecora, anticorpo anti-anticorpo di gallina e via dicendo.

I tipi di marcatori.Per garantire diverse metodologie di osservazione un anticorpo pu venir trattato con diversi tipi di marcatore. I marcatori pi comuni sono

1. Enzimi perossidasi

2. Marcatori radioattiviti

3. Marcatori fluorescenti

Attraverso la marcatura per perossidasi si assiste ad una colorazione del mezzo liquido introdotto successivamente all'immissione dell'anticorpo. Il marcatore radioattivo pu venire osservato mediante la tracciatura e l'autoradiografia. I marcatori fluorescenti, in ultima analisi, sono utilizzati per l'osservazione con il microscopio a fluorescenza.


Illustrazione 12: Marcatura di un anticorpo primario

Illustrazione 13: Marcatura secondaria di un anticorpo


L'amplificazione del segnale.In immunoistochimica uno svantaggio del marcatore, sia applicato ad un anticorpo primario, sia applicato ad un marcatore secondario, rappresentato dal fatto che la risposta visiva spesso blanda. In particolar modo il microscopio a fluorescenza pu avere difficolt ad illuminare correttamente il complesso antigene-anticorpo per via di una relativamente esigua risposta dello stesso.

Abbiamo gi parlato del fatto che gli anticorpi primari, avendo differenti siti di legame per altri anticorpi secondari marcati, possono effettivamente determinare un aumento della capacit di colorazione/fluorescenza. In laboratorio vengono utilizzati dei procedimenti particolari che sfruttano le capacit di alcune molecole di interagire tra loro.

Il complesso biotina-avidina.La biotina una molecola molto conosciuta in ambiente biochimico. La si riscontra come cofattore enzimatico in tutte quelle reazioni che prevedono carbossilazioni del substrato come, a titolo di esempio, nella carbossilazione del piruvato nella gluconeogenesi11.

Questa molecola viene introdotta normalmente con l'alimentazione e ha una elevata affinit con una proteina a basso peso molecolare: l'avidina.

L'avidina una glicoproteina presente nell'albume dell'uovo e si lega saldamente alla biotina formando il complesso avidina- biotina. Esistono ben quattro punti

11 Per maggiori informazioni consultare l'articolo La biosintesi dei carboidrati attraverso la gluconeogenesi disponibile all'indirizzo:http://www.lacellula.net/appunti/biochimica/biosintesi_dei_carboidrati_gluconeogenesi.html

nell'avidina nei quali possibile legare la biotina e, per questo motivo, sperimentalmente possibile legare alla avidina un anticorpo biotinilato e, nei restanti tre siti di legame, tre marcatori (perossidasi, fluorocromi, molecole radioattive) biotinilate.

Il vantaggio del complesso avidina-biotina consiste nel fatto che per un singolo antigene possibile triplicare l'azione del colorante amplificando, di fatto, il segnale visibile al microscopio.

In commercio esistono kit gi pronti per operare la tecnica biotina-avidina che prendono il nome di set ABC (avidine-biotine-complexes) utilizzanti quasi esclusivamente la funzionalit dell'enzima perossidasi.

I saggi ELISA.I saggi ELISA12 (Enzymed Linked Immunoabsorbent Assay) rappresentano la diretta evoluzione dell'indagine

immunologica anticorpo-antigene.

Attraverso questi saggi possibile indagare la presenza di anticorpi anti-antigene oppure la presenza di antigeni in un dato tessuto utilizzando come substrato, rispettivamente, antigeni conosciuti e anticorpi conosciuti anti-antigene.

Mediante i saggi ELISA vengono analizzati presenze virali antigeniche come quelle determinate dal virus HIV.

12 Per maggiori informazioni sui saggi ELISA possibile consultare la pagina I saggi ELISA disponibile all'indirizzo:

http://www.lacellula.net/appunti/immunologia/elisa_diretto_indiretto_sandwich.html


Illustrazione 14: Formula di struttura delle biotina

Illustrazione 16: Schema biotina-avidina-perossidasi

HC CH

NHHN

H2CS

CH

O

CH2

H2C C

H2

H2C COOH

Illustrazione 15: Rappresentazione computerizzata della proteina avidina

Riepilogo del capitolo: Immunoistochimica.L'immunoistochimica lo strumento scientifico mediante il quale possibile indagare la relazione antigene-anticorpo sfruttando la specificit che hanno le immunoglobuline a legarsi saldamente all'antigene. Anticorpi marcati con particolari molecole vengono visualizzati dall'operatore utilizzando gli opportuni strumenti.

Parole chiave:Immunoistochimica, saggio enzimatico, anticorpo primario e secondario, anticorpo marcato, biotina-avidina


6 I marcatori tumorali.Con il termine di marcatore tumorale si intende una sostanza chimica secreta in modo quantitativamente abnorme nel decorso di diverse neoplasie localizzabili in diversi punti dell'organismo. La molecola marcatrice, in base agli studi effettuati, viene sintetizzata dalle cellule tumorali e rilasciata generalmente nel torrente ematico e, in alcuni casi, pu essere rintracciata nelle urine.

L'analisi dei marcatori tumorali, nonostante diversi decenni di sperimentazione, pone ancora seri interrogativi scientifici. I valori rappresentanti la concentrazione delle molecole, infatti, possono variare da paziente a paziente in modo molto significativo. Questa caratteristica introduce, nella diagnosi, falsi positivi o falsi negativi che devono necessariamente essere approfonditi con tradizionali indagini citologiche.

Il primo marcatore tumorale scoperto fu il CEA (Antigene Carcino-Embrionico), che nel 1960 veniva isolato da due medici Statunitensi. L'aumento del titolo del CEA nel fluido sanguigno fu ricondotto ad una neoplasia del colon e, pi in generale, a neoplasie del sistema gastrointestinale. Dopo questa scoperta migliaia di potenziali molecole sono state sottoposte all'attenzione dei comitati scientifici e per alcune di esse si trovata una correlazione, nei limiti dell'affidabilit intrinseca ai marcatori, concentrazione-marcatore/neoplasia.

Sigla Nome DescrizioneCEA Antigene Carcino-

EmbrionaleRilasciato dalle formazioni neoplasiche del colon e di parti dell'intestino.Il CEA viene anche usato per diagnosticare metastasi al cervello.

AFP Alfa-feto-proteina Proteina normalmente presente nel feto e rilevabile in minor quantit nell'adulto. Il titolo aumenta nella donna incinta e in casi di tumore epatico (HCC) e del tumore dell'ovaio.

HCG Gonadotropina corionica

Proteina sintetizzata, normalmente, in gravidanza. Diventa marcatore tumorale nei casi di neoplasia teratomica e neoplasia coriocarcinomica.

CA125 Antigene carbonato 125

Antigene riconducibile al tumore dell'ovaia. Generalmente utilizzato, a fini diagnostici, assieme ad altri marcatori

CA15-3 Antigene carbonato 15-3

Antigene associabile al cancro della mammella.

CA19-9 Antigene carbonato 15-3

Antigene associato ad alcuni tumori del tratto intestinale come le neoplasie del colon e del retto.

PSA Antigene Prostaico specifico

Presente in forma libera ed in forma associata. Pu essere riconducibile a neoplasie benigne della prostata qualora il PSA libero aumenti in concentrazione, o a neoplasie maligne quando il rapporto PSA-libero/PSA-associato grossomodo eguale.

Tabella 1: Specchietto riassuntivo dei principali marcatori tumorali.


1 Introduzione.Strumenti e tecniche.

2 Gli strumenti dell'indagine citoistologica.I microscopi ottici.Le aberrazioni cromatiche nei microscopi.

I microscopi elettronici.I microscopi a fluorescenza.I microtomi.

3 La preparazione di un campione.Preparazione di un campione nella microscopia ottica.Prelievo.Fissazione.Fissazione con metodi fisici.Freeze drying dei tessuti biologici.

Fissazione con metodi chimici.Fissativi chimici primari.Fissativi chimici secondari.

La colorazione.Struttura chimica di un colorante.Classificazione dei coloranti in base alla loro produzione.Classificazione dei coloranti in base all'auxocromo ed al gruppo cromoforo.

Tecniche di colorazione.La reazione PAS.

4 Indagine delle molecole biologiche.Carboidrati.Tecniche di localizzazione dei carboidrati.

Lipidi.Tecniche di analisi dei lipidi.

Nucleotidi, DNA e RNA.Tecniche di analisi dei nucleotidi, del DNA e dell' RNA.Estrazione del DNA.

5 Immunoistochimica.Anticorpi primari e anticorpi secondari.I tipi di marcatori.L'amplificazione del segnale.Il complesso biotina-avidina.I saggi ELISA.

6 I marcatori tumorali.

2007-05-25T23:20:41+0200FabrizioVersione non modificata

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