Indagini ambientali e

campionamenti

d.ssa Maria Antonietta Bucci Sabattini d.ssa Francesca Giacobbi

© 2003 – ARPA - Agenzia Regionale Prevenzione e Ambiente – Regione Emilia Romagna – Sezione Provinciale di Bologna

Seminario Legionellosi: Situazioni attuali e prospettiveBologna, 27 novembre 2003

Sommario

Habitat naturale

Habitat antropico

Sistematica e caratteristiche colturali

Indagine ambientale

Campionamento

Elaborazione statistica di alcuni dati relativia controlli eseguiti negli anni 1999-2003.

Pneumopatia acuta febbrile (16% letalità) che si verificò nel luglio 1976 al Bellevue Hotel di Philadelphia in occasione del raduno annuale dell'American Legion. Il C.D.C. identificò l'agente responsabile malattia e nel I° Simposio Internazionale del 1978 la chiamò Legionella pneumophila.

Dall'esame di campioni di sieri e tessuti conservati dal CDC dal 1947 al 1957, in occasione di epidemie di origine sconosciuta, fu possibile risalire ai primi casi di legionellosi: - nel 1947, il caso più vecchio, un soldato deceduto a Fort Braff nel Nord della Carolina per polmonite non identificata,- nel 1957 tre casi in un impianto di confezionamento carne.

Indagini epidemiologiche retrospettive permisero di chiarire altri episodi rimasti senza risposta:- nel 1965 casi in Ospedale Psichiatrico di Washington,- nel 1968 casi in uffici Sanità Pubblica di Pontiac,- nel 1973 casi in turisti in Spagna,- nel 1974 casi nello stesso albergo di Philadelphia.

1° Riferimento storico

È stato dimostrato che Legionella pneumophila è un batterio che ha il suo “reservoir” nell'ambiente naturale acquatico ed è capace di sopravvivere in un ampio range di condizioni.(Flaiermans, 1981).

Habitat

Flaiermans (Appl. En. Microbiol.) nel 1981 provò l'origine (habitat) ambientale di Legionella e per arrivare a dimostrare questo furono prelevati quasi 800 campioni di acqua da 67 diversi laghi e fiumidegli USA. Ogni campione era costituito da 20 litri di acqua, che fu concentrato 500 volte (concentrato fino a 49 ml), la concentrazione fu eseguita sul campo con centrifugazione continua 15.000 giri in ragione di 200 ml al minuto). Tutti i campioni, senza eccezioni, risultarono positivial test in fluorescenza diretta al microscopio per Legionella pneumophila e confermati in cavia.

Habitat naturale

Gli isolamenti derivavano da acque con grande variabilità di parametri chimici, fisici, biologici (anche sorgenti termali) con un maggior reperimento quantitativo del batterio nei mesi estivi.

Le Legionelle trovate oscillavano in un ampio range da:9,0×103 UFC/l fino a 3,3×107 UFC/l.

I parametri fisici:- temperatura da 5,7 °C a 53 °C (con valori medi tra 20°- 30°C),- pH tra 5,5 e 8,1.

Habitat naturale

Habitat naturale

Gli autori ipotizzano anche una relazione tra Legionella pneumophila e organismi eucarioti (alghe e protozoi). Più o meno nello stesso periodo Rawbozan (J. ClinicalPathology) descrisse la capacità di Legionella pneumophila di moltiplicarsi dentro i protozoi, da allora èstato dimostrato che Legionella pneumophila si può moltiplicare in diverse specie di protozoi.

Almeno 30 specie diverse di amebe e 2 di protozoi ciliati (Entamoeba hystolitica, Hartmannella vermiformis, Echinamebae spp., Saccameba spp., Acanthamaeba, Naegleria, Vanella, ecc.) consentono la moltiplicazione di Legionella pneumophila e sono ospiti ambientali di Legionella. Si parla non solo di ambienti naturali, ma anche di "ambiente idrico condottato", come è stato dimostrato in numerosi lavori (1998, App. En. Microbiol., Ute Rohr) in cui le amebe sono state isolate da campioni di acqua calda in 6 diversi ospedali USA.

La classificazione nel 1996.

La famiglia Legionellaceae è formata dall’unico genere Legionella.

Sistematica

Attualmente si conoscono 48 specie di Legionella, comprendenti 70 distinti sierogruppi.

Della specie L. pneumophila sono stati isolati 15 sierogruppi diversi.

Circa la metà delle 48 specie isolate sono associate a casi di legionellosi nell’uomo.

Il 79% dei casi, confermati dall’ esame colturale o dall’antigene urinario, sono stati causati

da Legionella pneumophila, sierogruppo 1.

Sistematica

Caratteristiche colturali

Le legionelle hanno le seguenti carartteristiche:

batteri gram negativi, catalasi positivi, forma bastoncellare, di piccole dimensioni e mobili mediante un flagello che può assumere posizione polare o laterale.

Non crescono sui terreni colturali di routine, ma necessitano di un terreno specifico contenente carbone ed un fattore di crescita essenziale rappresentato dall’aminoacido cisteina(BCYE-α). Fonte: “A Laboratory manual for Legionella”

di T.G.Harrison, A.G. Taylor

Alcune Legionelle non sono in grado di crescere sui terreni colturali specifici, queste specie sono state chiamate:

Caratteristiche colturali

Recentemente tre ceppi LLAPs sono stati classificati come Legionella spp.

Legionella-Like Amoebal Pathogens(LLAPs)

Patogenesi Le conoscenze sul batterio legionella sono aumentate negli ultimi 10 anni, in particolare per quanto concerne approfondimenti sul suo ciclo e sulla sua virulenza.La principale particolaritàdella patogenicità di Legionella è la sua capacità di moltiplicarsi all’interno della cellula.

Il ciclo vitale di Legionella è caratteristico e si attua con gli stessi meccanismi sia nelle cellule dei protozoi che nei mammiferi.

Fonte: Fields et Al. - Clin. Microbiol. Rev. - July 2002

Legionella può essere presente anche negli acquedotti, in quanto è in grado di superare, senza eccessivi danni, i normali trattamenti di potabilizzazione.Tuttavia, la sola presenza di questi batteri non costituisce pericolo per le persone, diventano pericolosi solo quando sussistono contemporaneamente le seguenti condizioni:

Habitat antropico

Temperatura ottimale di sviluppo (da 25°C a 42°C), Ambiente aerobico (presenza di ossigeno), Presenza di elementi nutritivi (biofilm, scorie, ioni di ferro e di calcare, altri microrganismi), Polverizzazione dell’acqua con formazione di microgocce aventi diametri variabili da 1 a 5 micron.

Biofilm

Legionella sopravvive nel biofilm presente nei sistemi idrici degli edifici.Il batterio è stato ritrovato sia nei tamponi eseguiti su biofilm che nell’ acqua corrente a dimostrazione che Legionella spp èassociata al biofilm.

Aggregato costituito da batteri, alghe, polimeri e sali naturali.

Biofilm

Fonte: “Center of Biofilm Engineering” (CBE), Università del Montana – U.S.A.

Scambi che normalmente avvengono fra superfici metalliche e biofilm.

Evolversi dei biofilm quando avvengono fenomeni di corrosione

Habitat antropico

Torri di raffreddamentotorri ad umido a circuito aperto, torri a circuito chiuso, condensatori evaporativi.

Impianti idrosanitaritubazioni, serbatoi di accumulo/scambiatori di calore, valvole e rubinetti soffini delle docce doccette delle vasche.

Impianti di condizionamentolavatori d’aria a spruzzo, nebulizzatori, separatori di gocce, filtri.

Sistemi di emergenzadocce di decontaminazione,

stazioni di lavaggio occhi,

sistemi antincendio a sprinkler.

Habitat antropico

Fontane decorative

Apparecchi di erogazione ossigeno

Sistemi di raffreddamento macchine utensili

Impianti in studi odontoiatrici “riuniti”

Piscine e vaschepiscine vasche di idromassaggio, vasche calde

Habitat antropico

•edifici con torri di raffreddamento,•caserme,•campeggi e strutture recettive in genere, •impianti per attività sportive e scolastiche, •stabilimenti termali, •edifici con fontane decorative e cascate artificiali.

Le utenze e gli impianti più esposti a rischio sono:

•ospedali,•cliniche, •case di cura.

Ambienti nosocomiali

Ambienti comunitari

Esempi di casi di legionellosi associati a“torri evaporative”

PAESE

PERIODO

COLLOCAZIONE

CASI

MORTI

Olanda 1993 Ospedale 21 - USA - Delaware 1994 Ospedale 29 -

USA - Pennsylvania 1995 Ospedale 22 - Spagna - Murcia Luglio 2001 Ospedale 449 4

Inghilterra - Londra 1985 Edificio pubblico (stazione

polizia) 6 -

Giappone - Tokyo Agosto 1993 Edificio pubblico 45 - USA - Massachusetts Estate 1993 Edificio 11 - Australia - Melbourne Ottobre 1997 Edifici (zona industriale) 18 - Australia - Melbourne Marzo 2000 Edificio pubblico 5 - Inghilterra - Londra Primavera 2001 Edifici della stessa area 3 - Australia - Melbourne Marzo 2001 Edifici della stessa area 5 2 Australia - Melbourne Ottobre 2002 Edifici della stessa area 3 -

USA - Vermont Estate 2002 Edificio pubblico 16 -

Australia - Melbourne Aprile 2000 Acquario 101 -

Esempi di eventi di legionellosi associati ad

“impianti di condizionamento”

PAESE

PERIODO

COLLOCAZIONE

CASI

MORTI

Inghilterra - Cumbria Luglio 2002 Edificio pubblico (centro civico) 131 4

Spagna - Matara Agosto 2002 Edificio pubblico 124 2

Esempi di eventi di legionellosi associati ad “impianti idrici”

(doccia, vasca da bagno, lavandini)

PAESE

PERIODO

COLLOCAZIONE

CASI

MORTI

USA - Texas 1993 Ospedale militare 14 -

USA - Maryland Giugno 1999 Ospedale 5 3

Francia - Parigi Dicembre 2000 Ospedale 4 -

Spagna - Pamplona Agosto 2001 Ospedale 18 3

USA - Los Angeles Primavera 2002 Ospedale 9 2

Spagna - Valencia Giugno 2003 Ospedale 7 1

Germania Settembre 1999 Edificio pubblico (Prigione) 4 -

Danimarca Primavera 2000 Edificio privato (Abitazioni) 2 -

USA - Ohio Marzo 2001 Edificio privato (Fabbrica) 4 2

USA - Massachusetts Giugno 2002 Edificio pubblico (Asilo) 4 -

Romania 1989 Hotel 20 1

b

Esempi di casi di legionellosi associati ad “acqua termale”

PAESE

PERIODO

COLLOCAZIONE

CASI

MORTI

Spagna - Guipúzcoa Maggio 1999 Centro termale 2 - Australia Giugno 2000 Centro termale 3 - Giappone Luglio 2002 Centro termale 252 6 Israele - Eliat Gennaio 2003 Hotel 3 - Inghilterra - Chard Febbraio 2003 Hotel 19 2

Esempi di casi di legionellosi associati a “fonti inusuali”

VASCHE CON GIOCHI D'ACQUA

PAESE

PERIODO

COLLOCAZIONE

CASI

MORTI

Olanda - Amsterdam Marzo 1999 Mostra di fiori 192 21

Belgio - Kapellen Novembre 1999 Fiera 13 4

UMIDIFICATORE ALL’INTERNO DI UN UNITA’ REFRIGERANTE PER CIBO

PAESE

PERIODO

COLLOCAZIONE

CASI

MORTI

Australia - Sydney 1999 - 2000 Hotel 5 2

TERRICCIO PER PIANTE DA GIARDINO

PAESE

PERIODO

COLLOCAZIONE

CASI

MORTI USA - Oregon 2000 Giardini 3 1

Indagine ambientale

Prerequisito dell’indagine è una dettagliata conoscenza dell’impianto idrico facendosi coadiuvare o dall’idraulico in caso di un impianto semplice o da altro personale qualificato (ingegnere o geometri dei servizi tecnici) in caso di strutture più complesse.

E importante ottenere un diagramma schematico dell’impianto e annotare le seguenti particolarità:

1) la localizzazione della conduttura principale di rifornimento dell’acqua o della sorgente privata,

2) La localizzazione delle cisterne, dei vasi di amplificazione o delle pompe,

3) La localizzazione dei caloriferi e dei riscaldatori d’acqua,

4) il tipo di apparecchi usati nel sistema (rubinetti, docce, valvole) e con quale materiale sono state costruite le tubazioni,

5) la presenza di torri di raffreddamento,

6) presenza all’interno dell’edificio un sistema di aria condizionata ed uno di umidificazione.

•le condizioni delle tubature,•le connessioni incrociate con altri servizi,•la presenza di rivestimenti,•la sorgenti di calore,•la protezione standard fornita alle cisterne,•i punti morti della rete,•i disconnettitori degli apparecchi,•come sono fatte le congiunzioni delle tubature.

Dove eseguire i campioni e quali.

Indagine ambientale

Con tutte queste notizie si deve tracciare una carta / diagrammadei servizi dal punto di ingresso dell’acqua nell’edificio e se possibile sarebbe utile eventualmente annotate nel diagramma:

La ricerca di Legionella spp nell’ambiente idrico artificiale (Indoor), in funzione dell’indagine localistica eseguita, prevede la raccolta di campioni di acqua, di residuo di calcare, di biofilm, di filtri o di limo presente nei punti critici individuati:

all’inizio della rete,

dalle cisterne e dagli scambiatori di calore,

in uno sbocco prossimo, ma a valle di ciascuna cisterna o scambiatori di calore,

in un punto distale di ciascun servizio,

dall’impianto di condizionamento (acqua di condensa e/o acqua di sgocciolamento e/o filtri).

nelle torri di raffreddamento (acqua di sgocciolamento sul fondo della vasca)

Dove eseguire i campioni e quali.

Campionamento Nelle Linee Guida Europee per il controllo della legionellosi nei viaggiatori, se in una struttura recettiva si evidenzia la presenza di un potenziale rischio, è necessario effettuare un campionamento dell’acqua per la ricerca di Legionella spp. in un numero di siti che sia rappresentativo di tutto l’impianto idrico e comunque non inferiore a sei.

Rete dell’acqua fredda:•serbatoio dell’acqua (possibilmente dalla base),•il punto più distale dal serbatoio.

Rete dell’acqua calda:a) serbatoio di accumulo dell’acqua calda •alla base del serbatoio dell’acqua calda vicino alle valvole di scarico, b) ricircolo dell’acqua calda•al sito di erogazione più distale dal serbatoiodell’acqua calda.

CampionamentoVolume di acqua da prelevare:

almeno ”un litro” in bottiglie sterili, con presenza di tiosolfatodi sodio a (0,01%), ma in alcuni casi, in funzione della sensibilitàdella risposta quantitativa, fino a 5 litri.

Modalità di prelievo:

1) Per valutare, la presenza di Legionella, alle condizioni di utilizzo prelevare acqua calda senza farla scorre e non flambare il punto di sbocco.

2) Per valutare la presenza di Legionella, all’interno della rete di distribuzione dell’acqua, prelevare facendola scorre per 5-10 minuti e flambare il punto di sbocco.

Trasporto:a temperatura ambiente ed al riparo dalla luce con consegna al Laboratorio entro 24 ore dal prelievo,

a 4°C per un periodo non superiore a 7 giorni.

Prelievo di acqua per ricerca di Legionella

E’ utile implementare un’indagine ambientale ed eseguire campionamenti per ricerca di Legionella in assenza di casi?

EE’’ un falso problema.un falso problema.Qualsiasi indagine microbiologica è di tipo retrospettivo, non risolve il problema, ma informa solo che c’è un problema.

Il monitoraggio è utile quando si vuole verificare:

- l’origine di una infezione,

- le potenziali fonti di proliferazione / trasmissione,

- l’efficacia di un protocollo di bonifica.

Il monitoraggio è utile quando si vuole tutelare, in ambiente ospedaliero, i pazienti a rischio.

Monitoraggio

Indagini positive per ricerca di Legionella eseguite su notifica

in alberghi (n°18)

Legionelle isolate

Tipo In quanti alberghi

L. pneumophila sg.1 13 L. pneumophila sg.3 2 L. pneumophila sg.4 1 L. pneumophila sg.5 2 L. pneumophila sg.6 3 L. pneumophila sg.7-14 2 L. micdadei 1

Concentrazione Legionelle

Ordine di grandezza max.

In quanti alberghi

101 1 102 2 103 7 104 4 105 2 106 2

Anni 1999-2003

Indagini positive per ricerca di Legionella eseguite su notifica

in abitazioni civili ed aziende (n°8)

Legionelle isolate Tipo In quante

L. pneumophila sg.1 3 L. pneumophila sg.6 1 L. pneumophila sg.7-14 3 L. spp 1

Concentrazione Legionelle Ordine di

grandezza max. In quante

Abitazioni/aziende 101 1 102 2 103 2 104 2

Anni 1999-2003

Indagini positive per ricerca di Legionella eseguite

in studi odontoiatrici (n°7)

Legionelle isolate

Tipo In quanti

studi L. pneumophila sg.6 1 L. pneumophila sg.7-14 2 L. bozemani 3 L. spp 1

Concentrazione Legionelle Ordine di

grandezza max. In quanti

studi 101 2 102 3 103 1 104 1

Indagini positive per ricerca di Legionella eseguite

in terme (n°2)Anni 1999-2003

Legionelle isolate Tipo

L. pneumophila sg.1 L. pneumophila sg.3 L. pneumophila sg.5 L. pneumophila sg.7-14

Concentrazione Legionelle Ordine di

grandezza massimo In quanti

stabilimenti 102 1

103 1

Indagine positiva per ricerca di Legionella eseguita su notifica

in casa di cura (n°1)Anno 2003

Legionelle isolate Tipo

L. pneumophila sg.1 L. pneumophila sg.3

Concentrazione Legionelle Ordine di grandezza

In quali punti

Torre di raffreddamento 103

Rubinetto lavandino 102 Boiler

Contagiato il Tecnico che seguiva la ristrutturazione/manutenzione dell’impianto di condizionamento.