Il microambiente tumorale come bersaglio...

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Il microambiente tumorale come bersaglio terapeutico

Area Tematica 2 Bioterapie dei tumori

Sottoprogetto 2.3 Sviluppo di protocolli di terapia combinata, inclusi trattamenti integrati di chemio-immunoterapia

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Razionale e Premesse

• In vivo la crescita tumorale è influenzata in modo determinante dalle cellule del microambiente (fibroblasti, cellule del sistema immunitario innato e adattativo, cellule della rete vascolare e linfatica) e da componenti della matrice extracellulare (citochine, componenti dello stroma)

• La prova di principio che è possibile controllare la crescita di tumori umani agendo sul microambiente anziché direttamente sulla cellula neoplastica, èrappresentata da un numero crescente di esempi. In particolare:– Talidomide nel mieloma– Bevacizumab nei tumori del colon– Rituximab nel linfoma di Hodgkin classico (CD20-neg)– Terapia anti H. pylori nel linfoma MALT dello stomaco– Prevenzione dei tumori del colon-retto con farmaci anti-infiammatori

(NSAIDs)

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Obbiettivi del Sottoprogetto

• Identificare nel microamiente tumorale nuovi bersagli per il controllo della crescita neoplastica

• Convalidare in vivo in modelli animali l’attività antitumorale di inibitori/modulatori dei bersagli in studio

• Verificare in tumori umani l’azione antitumorale di composti con attività sul microambiente

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Schema riassuntivo dei bersagli in studio

Malorni [Autofagia/xenofagia] Pelicci G. [Gene Rai]

Corti [NGR-TNF, VS-1]Gianni [endotelio]

Anichini [IL-19R]

Allavena [macrofagi]

Pelicci PG, Amati [nicchia emopoietica]

Colombo [SPARC]Tagliabue

[serpina, fibulina]

Anichini [IL-19]Allavena [PTX-3]

Gianni [CD4+]

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INT, MilanoAndrea Anichini

Bersaglio Mediatori solubili (IL-19, IL-9, IL-23) prodotti da cellule di melanoma e attivi su fibroblasti tumore-associati (TAF) e cellule immunitarie

Obbiettivo preclinico

• Valutare l’attività immunomodulatoria e proinfiammatoria di citochine prodotte da cellule di melanoma (IL-19,IL-9,IL-23, e altre);

• Blocco dell’attività immunomodulatoria e proinfiammatoria di IL-19 con anticorpi neutralizzanti IL-19, e con inibitori della via di segnale di IL-19R nei TAF. Gli esperimenti verranno ripetuti con altre citochine espresse dal melanoma.

Avanzamento lavori

Profilo di espressione genica in fibroblasti normali vs. TAF esposti a IL-19, tramite piattaforma ILLUMINA Bead Station 500.

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Esperimenti in corso

Espressione di IL-19 in-vivo in melanomi primitiviMelan-A/MART-1 IL-19

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INT, MilanoMario Colombo

Bersaglio SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine); proteina matricellulare con ruolo chiave nella modulazione del microambiente, nella progressione tumorale e nella formazione di metastasi.


Verificare nel carcinoma mammario se anticorpi anti-SPARC potenziano l’attività antitumorale

Obbiettivo traslazionale

Isolamento di anticorpi umani anti-SPARC

Avanzamento lavori

E’ stato isolato un anticorpo monoclonale murino anti-SPARC con attività inibitoria

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wtKO

Tumors from SPARC KO mice lack of the fibrous stroma

Our aim was to create a species specific Ab that given in vivocould reduce the tumor stroma and perhaps facilitate drug influx

MP Colombo

9

Our Ab

Ig mouse

t0 t48 t72 t96

We immunized SPARC KO mice with a SPARC over-expressing tumor cell line and selected Ab able to block SPARC inhibition of

wound closure as readout of biological function

MP Colombo

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INT, MilanoElda Tagliabue

Bersaglio Proteine della matrice extracellulare (serpina B5, fibulina-1)Obbiettivo preclinico

Analisi, in modelli animali geneticamente manipolati, della risposta alla chemioterapia in funzione del livello di espressione di componenti del microambiente (serpina B5, fibulina-1)


• Valore prognostico del profilo di espressione di geni del microambiente in pazienti con tumore della mammella operato;

• Isolamento di anticorpi monoclonali anti-serpina e anti-fibulina, e valutazione di una loro attività di potenziamento della chemioterapia nel carcinoma mammario

Avanzamento lavori

• Produzione di vettori virali per l’espressione di serpinaB5 in cellule di carcinoma mammario

• Produzione e purificazione di serpinaB5 ricombinante da utilizzare per la produzione di anticorpi monoclonali

• Messa a punto di un saggio di Real Time-PCR per la determinazione dei livelli di espressione di serpinaB5 nei campioni tumorali fissati

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• Produzione di vettori virali perl’espressione di serpinaB5 in cellule di carcinoma mammario

• Produzione e purificazione diserpinaB5 ricombinante per

produzione di anticorpi monoclonali

• Messa a punto di un saggio di Real Time-PCR per la valutazione dei livelli di espressione di serpinaB5 in campioni PFFE

Serpin B5

50

35

Serpin

lisatoWT

surnatanteWTSerpin

Vettore virale

Infezione di cellule di carcinoma mammario

Analisi delle cellule infettate

pCEP-Pu9900 bp

bm40 Serpin B55’utr

Vettore di espresione(peptide segnale per la secrezione;tag di 6 Histidine)

Purificazione con resina Ni-NTA di serpinaB5 dai surnatanti di coltura

Core biopsies

Estrazione dell’RNA

RT-PCR relativa

Trasfezione di celluleeucariote

Immunizzazione degli animali

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IEO, MilanoPier Giuseppe Pelicci, Bruno Amati

Bersaglio Nicchia emopoietica (osteoblasti SNO, N-caderina, ß-catenina)


Studio dei fattori del microambiente midollare che regolano l’equilibrio tra self-renewal e differenziamento delle cellule staminali leucemiche (LSC)


Eliminazione del clone leucemico attraverso modifica delle interazioni anti-apoptotiche tra LSC e microambiente (in particolare cellule SNO)

Avanzamento lavori

Evidenziamento del ruolo della ciclina E1 nella regolazione del self-renewal in cellule staminali ematopoietiche

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Competitive Bone Marrow transfer

coBMT-1

X Rays

cycE1-WT Tg-GFPor

cycE1-KO Tg-GFP

1:1 mix

Test Blood for Chimerism (% GFP+ cells)

coBMT-2

X Rays

BMMNCtransplant

coBMT-3

X Rays

BMMNCtransplant

129/C57-GFP+

P=0,000004E1-WT E1-KO

La perdita di ciclina E1 aumenta il potenziale di Self-renewal delle cellule staminali ematopoietiche

Bone Marrow cells

WT (competitor)

vs

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IEO, MilanoGiuliana Pelicci

Bersaglio Gene Rai espresso da cellule di glioblastoma


Studiare in vitro e in vivo le proprietà biologiche delle cellule staminali di glioblastoma, e in particolare il ruolo di Rai su self-renewal, proliferazione d differenziazione


Conferma del ruolo di Rai come possibile bersaglio di composti ad attività anti-glioblastoma

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IEO, MilanoGiuliana Pelicci [continuazione]

Avanzamento lavori

1) Rai è espressa nel 60% dei GBM esaminati. L’espressione di Rai all’interno del tumore e’ disomogenea. Rai è sempre espresso, ad elevati livelli, nelle hTNSCs isolate.

2) È stato caratterizzato in vitro ed in vivo il comportamento di hTNSCs isolate da GBM umani, in cui l’espressione di Rai èstata spenta stabilmente mediante la tecnica dell’RNA interference.

3) hTNSCs interferite stabilmente per Rai mostrano una ridotta capacita’ proliferativa ed un importante deficit di migrazione rispetto alle cellule di controllo esprimenti Rai.

4) L’inoculo intracranico di cellule staminali tumorali neuronali umane in topi immunosoppressi determina l’insorgenza di tumori con le caratteristiche di un glioblastoma. Il silenziamento genico di Rai e’ in grado di indurre una maggiore sopravvivenza in tutti gli animali sottoposti ad inoculo.

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Contralateral cortex

Homolateral hemisphere

A

B

C

GFP/Ki67Colocalization

5X

5X

5X40X

40X

empty vectorsiRAI

WT

IHC anti RAI on human GBMs tissues

RAI EXPRESSION LEVEL IS VARIABLE IN RAI EXPRESSION LEVEL IS VARIABLE IN SAMPLES FROM DIFFERENT PATIENTSSAMPLES FROM DIFFERENT PATIENTS

1

64

52

IB α RAI

RAI IS RAI IS ALWAYSALWAYS EXPRESSED IN hTNSCs EXPRESSED IN hTNSCs ISOLATED FROM HUMAN GBMsISOLATED FROM HUMAN GBMs

2

3 4

Vinculin

RAI 64

52

empty vector

siRAIWT

hTNSCs hTNSCshTNSCs

Lentiviral infection

Interfered hTNSCs Interfered hTNSCs

RAI-silenced hTNSCs are smaller and grow slower compared with RAI-expressing counterparts

RAI-silenced hTNSCs show impair migration in both (a) wound-healing and (b) Boyden Chamber assays in response to different attractors

RAI SILENCING AFFECTS hTNSCsRAI SILENCING AFFECTS hTNSCs’’ GROWTH AND MIGRATION GROWTH AND MIGRATION

Cel

l num

ber (

log

scal

e)

DIV (Days in Vitro)

100.000

1.000.000

10.000.000

100.000.000

1.000.000.000

10.000.000.000

100.000.000.000

0 6 13 19 26 33 39 46

empty vectorsiRAI

0/EGF

0/FGF

0/FGF+EGF

empty vector siRAIb.a.

4X

empt

y ve

ctor

4X

siR

AI

10X IB α RAI

CA B

t 0t 0

t 7dt 7d

empty vector siRAI

4X

4X 4X

4X

RAI SILENCING IMPAIRES GLIOBLASTOMA FORMATION RAI SILENCING IMPAIRES GLIOBLASTOMA FORMATION

The tumor is widely diffused, infiltrates the ventricles and the ippocampus after the injection of both (A) WT and (B) control hTNSCs. (C) RAI-interfered hTNSCs induce a well delineated non-infiltrating tumor.

WT, mock transduced and RAI-interfered hTNSCs were injected in the caudate nucleus of nude mice. RAI silencing results in delayed mortality due to impaired glioblastoma formation, as shown by (a) MRI analysis and (b) Kaplan Meier survival curve.

b.a.

20X

20X

20X

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IEO, MilanoWalter Malorni [ISS, Roma]

Bersaglio Autofagia (self-cannibalism) e xenofagia (xeno-cannibalism) cellulare, che rappresentano un importante meccanismo di resistenza delle cellule tumorali alla chemioterapia


1) studio in vitro della suscettibilita’ apoptotica e delle capacitàauto/xenofagiche di cellule isolate da tumori primari e metastatici (carcinomi e melanomi) in condizioni di microambiente sfavorevole;

2) modulazione farmacologica dell’ autofagia/xenofagia con inibitori della diidrofolato reduttasi (es. pirimetamina) in cellule intrinsecamente resistenti ai chemioterapici;

3) valutazione in topi SCID dell’attività dei farmaci testati in vitro: es. pirimetamina in terapia combinata.


Messa a punto di protocolli di chemioterapia associata a inibitori della sopravvivenza autofagica

Avanzamento lavori

Induzione in vitro di autofagia in cellule di melanoma metastatico intrinsecamente resistenti alla chemioterapia e inibizione farmacologica attraverso la pirimetamina.

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Humanitas, MilanoPaola Allavena

Bersaglio Microambiente tumorale di soft tissue sarcomi (liposarcomi) Proteina di fase acuta PTX-3; Monociti/macrofagi intra-tumorali

Obbiettivo • Definizione del ruolo di PTX-3 e dei monociti/macrofagi nella crescita dei sarcomi mediante trattamento in vitro e in vivo con il farmaco Trabectedin(potente inibitore della sintesi di PTX-3 e e CCL2, e dotato di attivitàcitotossica nei confronti di monociti/macrofagi, oltre che delle cellule tumorali)


Valutare in pazienti con sarcoma in trattamento con Trabectedin:• L’attività del farmaco in liposarcomi. • Il suo effetto inibitorio sulla secrezione di mediatori infiammatori espressi

nel micro-ambiente. • Se i livelli di PTX-3 circolante nei pazienti in terapia con Trabectedin

rappresentano un marcatore predittivo di risposta tumorale.Avanzamento lavori

•I liposarcomi sono molto suscettibili all’effetto citotossico di Trabectedin a concentrazioni nel range nanomolare.•I liposarcomi producono elevate quantita’ di diversi mediatori infiammatori il cui ruolo nel micro-ambiente e’ sotto studio. Tra questi, PTX3 e CCL2 (chemochina attiva sui monociti) sono significativamente ridotti daTrabectedin

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Effetto anti-tumorale del farmaco Trabectedin su cellule di liposarcoma umano

1765

% d

i cel

lule

viv

e%

di c

ellu

le v

ive

Linee di liposarcoma risultano molto suscettibili a basse dosi farmaco, ma a tempi relativamente lunghi di 48 ore

402.91

0

20

40

60

80

100

Trabectedin

0

20

40

60

80

100

120

Ctrl 1.2nm 2.5nM 5nM

24h 48h72h

Ctrl 1.2nm 2.5nM 5nM Trabectedin

Fold

incr

ease

-35

-25

-15

-5

5

15

25

35

FASTNFRSF10

ABCL2A

1

BIKCASP10

LRDDNALP1

BBC3PMAIP1

TNF

RELBAPAF1

BAK1BCL2L

11CRADD

BCL2

Geni apoptotici upregulati dopo trattamento con Trabectedin

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Trabectedin inibisce la produzione di PTX3 e CCL2 in cellule di liposarcoma, ma non di IL-6

CCL2

PTX3

ng/m

l

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

CTR 0,6 1,2 2,5

ng/m

l

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

CTR 0,6 1,2 2,5

*

*

*

*

IL-6

ng/m

l

0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

CTR 0,6 1,2 2,5

Trabectedin (nM) Trabectedin (nM)

Espressione di PTX3 in due distinti liposarcomi umani. Il pattern di positivita’ puo’ risultare etereogeneo (Prof. S.Pilotti)

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Humanitas, MilanoAngelo Corti [HSR, Milano]

Bersaglio Endotelio vascolare tumorale


Valutazione in vivo nel topo del meccanismo d’azione e dell’attivitàantitumorale di composti antiangiogenetici di sintesi originale:vasostatina-1 (frammento N-terminale della cromogranina A) e NGR-TNF (TNF fuso con il peptide CNGRC, espresso dai vasi angiogenici)


Studi clinici di fase I/II con NGR-TNF, da solo e in combinazione con chemioterapici o con vasostatina-1

Avanzamento lavori

1. E’ stato messo a punto un metodo per la preparazione di NGR-TNF libero da contaminanti deamidati (P3). L’attività dell’NGR-TNF/P3 è stata valutata in modelli animali (20 pg sono risultati sufficienti per indurre effetti terapeutici).

2. E’ stata prodotta la vasostatina-1 ricombinante necessaria per lo studio nei modelli animali (prodotti >50 mg di vasostatina purificata)

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SDS-PAGERP-HPLC SE-HPLC

Effetto anti-tumorale di NGR-TNF/P3 da solo e in combinazioone con melphalan

Linfoma di topo RMAFibrosarcoma di topo WEHI-164

Produzione e caratterizzazione di NGR-TNF/P3 (privo di contaminanti deamidati)

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INT, MilanoA. Massimo Gianni

Bersaglio Cellule del microambiente nel linfoma di Hodgkin (T linfociti, Blinfociti)


Valutare l’attività anti-linfoma indiretta di composti attivi su cellule presenti nel microambiente di HL (linfociti B, linfociti T, endotelio vascolare). In particolare:

– Anticorpo anti-CD4 (zanolimumab)– Anticorpo anti-CD20 (rituximab)– Anticorpo anti-CD52 (alemtuzumab)– Anti-VEGF (sorafenib)

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INT, MilanoA. Massimo Gianni [continuazione]

Avanzamento lavori

• Stesura di un protocollo clinico multicentrico randomizzato che confronta chemioterapia seguira da radioterapia (ABVD-RT) con chemio-immunoterapia con rituximab e senza RT (R-ABVD), nel linfoma di Hodgkin in stadio iniziale;

• Arruolamento in corso di pazienti con HL candidati a trattamentidi terza linea (fallimento per ricaduta o progressione di una seconda linea) in uno studio monoistitutzionale con impiego di sorafenib;

• Arruolamento in corso di pazienti con HL, con cellule del microambiente CD52+, in un saggio terapeutico “off-label” che impiega alemtuzumab;

• Trattative in corso con Genmab per uno studio clinico di chemio-immunoterapia (chemioterapia di salvataggio associata a zanolimumab) [lo studio approvato da Serono è stato cancellato per restituzione dei diritti di sviluppo dell’anticorpo alla Genmab]

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INT, MilanoA. Massimo Gianni [continuazione]

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Schema riassuntivo dei bersagli in studio

Malorni[Autofagia/xenofagia] Pelicci G. [Gene Rai]

Corti [NGR-TNF, VS-1]Gianni [endotelio]

Anichini [IL-19R]

Allavena [macrofagi]

Pelicci PG, Amati [nicchia emopoietica]

Colombo [SPARC]Tagliabue

[serpina, fibulina]

Anichini [IL-19]Allavena [PTX-3]

Gianni [CD4+]

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