Cagliari 23/24 giugno 2005 Innovazioni Terapeutiche in Oncologia Medica

I FARMACI CON INCAPSULAZIONE LIPOSOMIALE

IN ONCOLOGIA

dall’innovazione tecnologica all’impiego clinico

I FARMACI CON INCAPSULAZIONE LIPOSOMIALE I FARMACI CON INCAPSULAZIONE LIPOSOMIALE

IN ONCOLOGIA IN ONCOLOGIA

dall’innovazione tecnologica all’impiego clinicodall’innovazione tecnologica all’impiego clinico

Prof. Luigi CattelDip. di Scienza e Tecnologia del Farmaco

Università di Torino

OHC C

H2

OH3C

H3CO

OCH2

O P R

O

O-

Catene acilicheParte idrofobica

Testa polareParte idrofila

Catena idrofobica

Zona idrofilaTesta Polare

Fosfolipide

SCOPERTACASUALE

1961 – A.D. BANGHAM, Cambridge

LIPOSOMI

Mimano la membrana cellulare

SCOPERTACASUALE

Intrappolano i soluti

I Liposomi come

Drug Delivery SistemDurante la loro formazione i liposomi hanno la capacità di

incapsulare sostanze biologicamente attive:

• sostanze idrosolubili nei compartimenti acquosi;

• sostanze liposolubili tra le lamelle lipidiche;

• sostanze anfipatiche la cui parte lipofila viene incorporata tra le

lamelle lipidiche e la parte idrofila nei compartimenti acquosi.

Molecole Idrosolubili

Molecole Liposolubili

Molecole anfipatiche

I LIPOSOMI COMEDRUG DELIVERY SYSTEM

LE CARATTERISTICHECHIMICHE INFLUENZANO

LA STRUTTURAFISICA INFLUENZA

VET (vesicle extruded tecnique)

DRV (dried reconstituted vesicle)

REV (reverse phase evaporation vesicle)

100 nmIUV (intermediate sized unilamellar vesicle)

1000 nmLUV (large unilamellar vesicle)

25 nm (lecitina uovo)50 nm (DPPC)

SUV (small unilamellar vesicle)

100 – 1000 nm≥ 5 lamelle concentriche

< 5 (oligo lamellar vesicle)MLV (multilaier vesicle)

• Fluidità di membrana• Carica elettrica• Permeabilità

• Dimensioni• Forma

Schematizzazione morfologico-strutturaledei vari tipi di liposomi

OLVsMLVsSUVs

MUVsLUVsMUVs

MLV-REVs; SPLVMVVs

Stabilità del Sistema Stabilità del Sistema LiposomialeLiposomiale

STABILITÀ E STABILIZZAZIONE

Le sospensioni liposomiali pongono problemi di stabilità, intendendo con questo termine sia la stabilità fisica delle sospensioni, sia la stabilità chimica del principio attivo e dell’involucro lipidico liposomiale. L’instabilità in vitro dei liposomi può essere dovuta a diversi fattori:

1. AUTOOSSIDAZIONE DEI FOSOFOLIPIDI – Tale processo avviene per perossidazione lipidica ed è favorita dalla presenza di ossigeno, di ioni metallici, della luce e pa pH elevati. L’ossidazione può essere rallentata con l’uso di agenti chelanti, di antiossidanti e tocoferoli. Anche il colesterolo ha un ruolo predominante nella stabilizzazione delle membrane liposomiali.

2. AGGREGAZIONE TRA LE VESCICOLELIPOSOMIALI – Tale processo è evitabile facendo ricorso a vescicole cariche ed a stabilizzanti (viscosizzanti) di varia natura.

3. PERDITA DEL PRINCIPIO ATTIVO – Tale processo è funzione della percentuale di colesterolo, della natura dei fosfolipidi, della carica delle vescicole, della dimensione e delle caratteristiche chimico-fisiche del principio attivo. Per ridurre la perdita del principio attivo, esistono due soluzioni:• fisica: la liofilizzazione dei liposomi• chimica: l’utilizzo di fosfolipidi diacetilenici che, formando tra le varie molecole dei legami

chimici, irrigidiscono il sistema e riescono a trattenere per più tempo il principio attivo.

N.B.: questo tipo di liposomi non può essere somministrato per via parenterale a causa degli effetti collaterali.

LiposomesLiposomes extravasationextravasation: : anatomycanatomyc barriers barriers

Schematic representation of the liver sinusoid. The sinusoid connects the portal vein (and the hepatic artery) with the central vein and facilitates the exchange of nutrients and metabolitesbetween the blood and the liver parenchyma. The sinusoidal endothelial cells forms a fenestrates sheath around the sinusoid that regulates the exchange between the lumen and the space of Disse (the space between the endothelial layer and the hepatocytes). The Ito cells are located in this space; they embrace the endothelial layer with their extended structures.

LiposomesLiposomes extravasationextravasation: in tumour tissues : in tumour tissues

Liposome classification based on composition and mode of drug delivery

• Caelyx (Europe)• Doxil (USA)

• PEG surface- modifiedliposomes

• high transition temperature lipids

• not subjected to RES uptake• Stealth® liposomes• very long circulating half- time• small size (< 100 nm)• high stability on storage

Pegylated LiposomalDoxorubicin (PLD)

Commercially notavailable

• surface modifiers liposomes• (monosialoganglioside) GM1

liposome• (palmitylglucuronyl) PG1CUA

liposome

• not subjected to RES uptake• long circulating half- time• variable size• not stable

Sterically StabilizedLiposomes (SSL)

• Daunoxome (Nextar)• DSPC cholesterol• high transition

temperature/saturatedphospholipid

• small size (< 100 nm)

• “pure lipid approach”• less subjected to RES uptake

than CL• long circulating half- time• high stability on storage

Long Circulating Liposomes(LCL)

• Ambisome (Nextar)• Myocet (Liposome

Inc.)

• neutral and/or negativelycharged phospholipid plus cholesterol

• variable size

• subjected to RES uptake• short circulation half- time• dose dependent

pharmacokinetic• variable stability: storage as

lyophilised or pro- liposomepowder

Conventional Liposomes (CL)

Product / CompanyFormulationCharacteristicsType

1°

2°

3°

4°

• AmBisome®Ambisome

L’AmBisome ® è una formulazione di liposomi SUV a lunga circolazione contenenti amfotericina B che ha dimostrato una maggiore efficacia comparata al farmaco convenzionale in studi di candidiasi sistemica su animali

Fig. 3

ANTIMICROBICI

I liposomi contenenti il farmaco arrivano ai macrofagi (o alle altre cellule target dotate di attività fagocitaria) per endocitosi (1); dopo fusione degli endosomi con i lisosomi (L) si ha la distruzione del bilayer liposomiale (3) e il rilascio delle molecole di farmaco nell’apparato lisosomiale. Nei lisosomi e negli altri compartimenti cellulari sono presenti i microorganismi patogeni da colpire (effetto cavallo di Troia)

MIOCET Doxorubicina Liposomiale

DOXDOX–H+

pH 4

citratebuffer

pH 7,8

DOX DOX–H+

carbonatebuffer

Doxorubicin (DOX) loading by pH transmembrane gradient

Myocet® Preparation• Supplied as 3-vial system

– Doxorubicin– Buffer– Liposomes

• Equilibrate vials to 55° to 60° C• Reconstitute doxorubicin with sodium chloride for injection• Adjust pH of liposomes with buffer• Add pH-adjusted liposomes to reconstituted doxorubicin• Mix thoroughly• Allow mixture to cool to room temperature

Myocet® (Elan Corporation)

Gel exclusion chromatography. Ion exchange chromatography and protamine precipitationRelevant body fluid-induced leakageMonitor survivalAnimal toxicityRabbit and/or Limulus amebocyte lysate (LAL) testsPyrogenicityAerobic and anaerobic bottle cultureSterility

Biological assaysDetermination of drug and phospholipid contentDrug phospholipid ratioDilution effect (0 – 10,000-fold) on liposomal drug/PL ratioDilution dependent drug release assayGel exclusion chromatography. Ion exchange chromatography and protamine precipitationPercentage of free drugZeta potential measurements. Use of electrical field or pH sensitive probesElectrical surface potential and surface pHCoulter counter. Laser diffraction and light microscopymicrometer rangePhoton correlation spectroscopy. Gel inclusion chromatography and specific turbidityVesicle size distribution: submicrometer

range

Physical stability assaysTLC. HPLC. SpectroscopyDrug degradationTLC. HPLCAntioxidant degradationTLC. HPLCCholesterol autooxidationTLC. HPLCPhospholipid hydrolysisConjugated diens, lipid peroxides, thiobarbituric acid (TBA) test and acid compisition (GC)Phospholipid peroxidationpH meterpH

Biochemical stability assaysSpectrophotometry. HPLC or other chromatografic proceduresDrug concentrationCholesterol oxidase assay. HPLCCholesterol concentrationLipid phosphorus content (Fiske and Subbarow or Bartlett method)Phospholipid concentrationOsmometerOsmolaritypH meterpH

Characterization assaysMethodology

Quality control assays of pharmaceutical liposomal formulations

ANTITUMORALI

• DaunoXome ®Il DaunoXome ® contiene una

soluzione di Daunorubicinaincapsulata in liposomi

unilamellari composti da DSPC e CHOL (60-80 nm di diametro) che

incorporano nei tessuti tumorali una quantità di principio attivo 10 volte maggiore rispetto al farmaco

libero

Fig. 9

Structure of CaelyxTM

Evades immune system

Prolonged circulation

Drug stays in liposomeuntil it reaches target

Drug concentrates in tumour

PEG

Doxorubicin

LiposomaStealth

LiposomaConvenzionale

Comparison of Liposomal Anthracycline Preparations

MononuclearMononuclearMembraneMembrane PhagocytePhagocyte

Agent Agent Anthracycline Anthracycline ConstituentsConstituents Size Size System (MPSSystem (MPS))

CAELYX™/ Doxil® Doxorubicin Cholesterol, saturated 85 nm Avoids(PLD) phosphatidylcholine, MPS

polyethylene glycol

Myocet® Doxorubicin Cholesterol, egg 150 to Taken upphosphatidylcholine 250 nm by MPS

DaunoXome® Daunorubicin Cholesterol, 50 nm Avoidsdistearoylphatidylcholine MPS

Sparano JA. Semin Oncol. 2001;28:32-40.

Human pharmacokinetics of free doxorubicin and doxorubicin entrapped in conventional liposome (CL) or in long-circulating liposomes such aspegylated liposomes doxorubicin (PDL)

The number of free doxorubicin and PLD (hydrogenated soyphosphatidylcholine:cholesterol:PEG2000-distearoylphosphatidylethanolamine, 2:1:0.1) are given for a single dose of 50 mg/m2, and the number of CL (eggphosphatidylcholine:cholesterol, 55:45) are given for a dose of 90 mgm2

50-55510965-70.1PLD

13.50.4513.620021.8CL

200.081-51400-300045Freedoxorubicin

Half-life (h)

α β

Area under the curve

Volume ofdistribution

(l)

ClearanceFormulation

1hl −∗ -1mlhµg ∗∗

Comparison of Liposome Clearance from Blood14

12

10

8

6

4

2

0

Dru

g C

once

ntra

tion

(mcg

/mL)

Hours After Infusion

0 4 8 12 16 20 24

CAELYX™/Doxil® (PLD)

DaunoXome®

Myocet®

DaunoXome® (NeXstar Pharmaceuticals)Myocet® (Elan Corporation)

Dose-Dependent Clearance of CAELYX™

PK Simulations: 10-60 mg/m2

Martin F and Amantea M.

100.000

0.001

0.000

0.100

0.010

1.000

10.000

Plas

ma

Con

cent

ratio

n D

oxor

ubic

in

(µg/

mL)

Time Following Infusion (hours)

10 20 30 40 50 60

0 48 96 288 336 384 480144 192 240 432

CAELYX™/ Doxil® (PLD) Remains Encapsulated in the Liposome

PLD 50 mg/m2

mcg

DO

X—

Equ

ival

ents

per

Encapsulated PLDTotal PLD

mL 100.00

10.00

1.00

0.10

0.010 24 48 72 96 120 144 168

Hours After Injection

Gabizon AN. Cancer Res. 1994;54:987-992.

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drenaggiolinfaticoridotto

endotelio discontinuob) TESSUTO TUMORALE

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drenaggiolinfatico

a) TESSUTO NORMALEendotelio continuo

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Rappresentazione schematica dell’EPR: nel tessuto tumorale le macromolecole si accumulano a causa della presenza dell’endotelio discontinuo e dell’ostruzione dei capillari linfatici.

Stealth® Liposome Localization in Human Tumors

Gamma Scintigraphy 24 and 48 Hours After Injection of Radiolabeled Stealth® Liposomes

Lung tumor

(Posterior view)

Spleen Liver

Bone marrow

Harrington, et al.Clin Cancer Res. 2001.

Symon et al., Cancer 1999

Figure 2. Hematoxylin and eosin stainingof the bone metastasis in Patient 1 demonstrating the presence of a tumorcell focus in the central part of the figure surrounded by connective stromaltissue in the periphery (×600).

Figure 3. (A) Fluorescence microscopic(fluorescein filter) image of bonemetastasis in Patient 1 demonstratingcellular and nuclear accumulation of doxorubicin with predominant distributionwithin a tumor cell focus (3750).

Symon et al., Cancer 1999

Comparative Adverse Event Profile

Vesicant effect

Infusion reaction

Nausea/vomiting

Myelosuppression

Stomatitis/mucositis

Palmar-plantar skin toxicity

Cardiotoxicity

Alopecia

CAELYX™Doxorubicin

+++

–

++

+++

++

Only with infusion

+++

+++

+/–

+ if premedicated

+/–

+ (not gr 4)

++

+++

+

+

Hand-Foot Syndrome(Palmar-Plantar Erythema)

Summary

• Chemotherapy-induced dermopathy

• Characterized by tingling (dysesthesia), erythema, and swelling followed in severe cases by skin breakdown

• Affecting hands, feet and other skin areas under prolonged friction or pressure

• Common side-effect of CAELYX™, dose-intensity and schedule-dependent

• Always reversible with complete healing

• Unrelated to chemotherapy vesicant effect

PPE in CAELYX™-Treated Patients

Increased Incidence With Repeated Cycles and Short Intervals100

75

50

25

0

Perc

enta

ge In

cide

nce

First cycle

Second cycle

Third+ cycle

50 q3wk 60 q3wk 60 q4wk 70 q4wkDose (mg/m2) / Schedule

Vesicant Effect of Intra-Cutaneous Injection of Doxorubicin Prevented

in CAELYX™ Formulation

Doxorubicini.d. 50 µgRt. flank

CAELYX™i.d. 50 µgLt. flank

CAELYX™: Correlation of Toxicity With Pharmacokinetic Parameters

• Leukopenia grade is positively correlated with Cmax and AUC

• Stomatitis grade is positively correlated with Cmaxand AUC

• Hand-foot syndrome (PPE) grade is positively correlated with T½ (half-life)

• Plasma levels and T½ during 1st cycle can predict the risk of PPE in subsequent cycles

Cancer. 2000;89:1037-47.

LIPOSOMI STEALTHCONCLUSIONI

• I liposomi stealth (Caelix) rappresentano la tecnologia liposomiale più avanzata

• La loro composizione lipidica (fosfolipidi saturi +colesterolo) e la loro dimensione (80nm) li rende particolarmente adatti per la terapia antitumorale (effetto EPR)

• L’introduzione del PEG inibisce l’uptake macrofagico ed aumenta l’emivita plasmatica e l’AUC

• La stabilità del liposoma nel plasma impedisce il rilascio della doxorubicina nel miocardio (no tossicità cardiaca)

I LIPOSOMI NEL FUTURO CLINICO

I LIPOSOMI A TARGETING ATTIVOI LIPOSOMI NELLA TERAPIA GENICAI LIPOSOMI NELLA DIAGNOSTICA

Targeting of liposomes

Folic acid targeted liposomes

CH

COOH

CH2

COOH

CH2

N

N N

N

H2N

OH

NHCH2 CO NH

Folic acid

Receptor-mediated endocytosis

a un involucro stabile

b ligando per conferire una particolare affinità al vettore

c molecole che facilitano la fusione tra il vettore e le cellule target

d proteine che permettono una diretta integrazione del vettore DNA

e sequenze per permettere la ricombinazione omologa

f regioni promoter tessuto.-specifiche

g cDNA terapeuticoFig. 2

I VIRUS SINTETICI NELLA TERAPIA GENICA

• targeting di liposomi cationici: immunogenosoma

Fig. 9

ÉCHOGRAPHIE

AVANTAGES:

Technique simple, portabilité

Peu coûteuse (equipement, examen)

Sans risque ni pour le patient ni pour le professionnel pratiquant l’examen

MAUVAISE ÉFINITION DE L’IMAGE OBTENUE

PROBLÈME

PARTICULES ÉCHOGÈNES

Nanoparticules à boulesLe alcane reste à

l'intérieur des particules même si:

ON UTILISE UN ALCANE LINÉAIRE ET ACYCLIQUE POUR RÉDUIRE L’ENCOMBREMENT STÉRIQUE;

ON UTILISE UN PLGA CARACTÉRISÉPAR UNE MAJEURE CONCENTRATION D’ACIDE LACTIQUE ET DONC PLUS HYDROPHOBE;

ON AJOUTE À LA SUSPENSION AQUEUSE DES PARTICULES DES SUBSTANCES CAPABLES D’AUGMENTER LA SOLUBILITÉ DU SOLVANT DANS L’EAU (DMSO, ÉTHANOL);

ON UTILISE LA DIALYSE;

ON UTILISE LA LYOPHILISATION.

CONCLUSIONI FINALI

I LIPOSOMI SONO STRUMENTI VERSATILI

UTILI NEL DIREZIONAMENTO DEI FARMACI

NELLA TERAPIA GENICA E NELLA DIAGNOSTICA