Glicogenosi tipo 1a: Glicogenosi tipo 1a: trasferibilità dei dati trasferibilità dei dati

sperimentali al sperimentali al trattamento del trattamento del

pazientepaziente

Glicogenosi tipo 1a: Glicogenosi tipo 1a: trasferibilità dei dati trasferibilità dei dati

sperimentali al sperimentali al trattamento del trattamento del

pazientepaziente

AIG Rimini 2010Luigi Varesio

Dal laboratorio alla Dal laboratorio alla clincaclinca

Fase 1Fase 1 Sperimentazione Sperimentazione in vitroin vitro e su modelli animali e su modelli animali preparazione dei reagenti per l’utilizzo sull’uomopreparazione dei reagenti per l’utilizzo sull’uomo

Fase 2Fase 2 Approvazione del protocollo dai comitati etici Approvazione del protocollo dai comitati etici

(Ospedale, Ministero della Sanità)(Ospedale, Ministero della Sanità) Certificazione dei reagenti per sperimentazione Certificazione dei reagenti per sperimentazione

sull’uomosull’uomo

Fase 3Fase 3 Sperimentazione della terapia sul pazienteSperimentazione della terapia sul paziente

Terapia cellulare Terapia cellulare GSD1aGSD1a

Terapia cellulare Terapia cellulare GSD1aGSD1a

Trapianto di epatocitiTrapianto di epatocitiTrapianto di epatocitiTrapianto di epatociti

TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURITRAPIANTO DI EPATOCITI MATURIInsufficienza epatica acutaInsufficienza epatica acuta

CausaCausa (N° pazienti trattati)(N° pazienti trattati) outcomeoutcome

DrogheDroghe (19)(19) 14 deceduti 2 trapiantati 3 guariti14 deceduti 2 trapiantati 3 guariti

Infezione viraleInfezione virale (9)(9) 6 deceduti, due trapiantati, 1 guarito6 deceduti, due trapiantati, 1 guarito

Insufficienza Insufficienza epatica acuta epatica acuta

idiopaticaidiopatica

(6)(6) 2 deceduti, 3 trapiantati, 2 guariti2 deceduti, 3 trapiantati, 2 guariti

Avvelenamento da Avvelenamento da funghifunghi

(1)(1) GuaritoGuarito

Insufficienza Insufficienza epatica acuta epatica acuta

idiopatica post-idiopatica post-operatoriaoperatoria

(1)(1) DecedutoDeceduto

TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURITRAPIANTO DI EPATOCITI MATURIMalattie MetabolicheMalattie Metaboliche

malattiamalattia (N°pazienti)(N°pazienti) Risultati al follow upRisultati al follow up outcomeoutcome

Crigler-Najjar Crigler-Najjar (9)(9) Miglioramento dei parametri metaboliciMiglioramento dei parametri metabolici Tutti trapiantati (ecceto uno) da 4 mesi a 4 anni Tutti trapiantati (ecceto uno) da 4 mesi a 4 anni dal trattamentodal trattamento

Ipercolesterolemia Ipercolesterolemia familiarefamiliare

(5)(5) Miglioramento dei parametri metaboliciMiglioramento dei parametri metabolici NANA

Deficienza del Deficienza del fattore VIIfattore VII

(2)(2) Riduzione della richiesta del fattore VII Riduzione della richiesta del fattore VII dell’70% per 6 mesidell’70% per 6 mesi

Trapianto dopo 7-8 mesiTrapianto dopo 7-8 mesi

Glicogenosi tipo 1aGlicogenosi tipo 1a (2)(2) Miglioramento dei parametri metaboliciMiglioramento dei parametri metabolici NANA

Colestasi Colestasi intraepatica intraepatica familiarefamiliare

(2)(2) Nessun beneficioNessun beneficio Trapianto dopo 5-14 mesi Trapianto dopo 5-14 mesi

Deficienza di OTCDeficienza di OTC (6)(6) 4 pazienti con miglioramento dei 4 pazienti con miglioramento dei parametri metabolici. 2 pazienti parametri metabolici. 2 pazienti decedutideceduti

4 pazienti trapiantati da 4 a 7 mesi dal 4 pazienti trapiantati da 4 a 7 mesi dal trattamentotrattamento

Deficienza di ASLDeficienza di ASL (1)(1) Miglioramento dei parametri metaboliciMiglioramento dei parametri metabolici Trapianto dopo 18 mesiTrapianto dopo 18 mesi

Deficienza di CPS1Deficienza di CPS1 (1)(1) Miglioramento dei parametri metaboliciMiglioramento dei parametri metabolici In attesa di trapianto dopo 11 mesi dal In attesa di trapianto dopo 11 mesi dal trattamentotrattamento

CitrullinemiaCitrullinemia (1)(1) Miglioramento dei parametri metaboliciMiglioramento dei parametri metabolici NANA

TERAPIA CELLULARE NEL FEGATO:STAMINALI

TERAPIA CELLULARE NEL FEGATO:STAMINALI

Ben tollerate e poco invasive

Sperimentazione nel topoSperimentazione nel topo

Modello di topoModello di topoModello di topoModello di topo

sano glicogenotico

Terapia con staminali della glicogenosi 1aTerapia con staminali della glicogenosi 1a

fegato

˜˜˜˜ ˜

˜

˜ ˜ ˜ ˜ ˜ ˜

Cellule staminali ematopoietiche

Iniezione nel fegato di cellule staminali

derivate dal midollo osseo

a b c

20 m 20 m

d

h

f ge

2500 m100 m

Ripopolazione del fegato con cellule staminali ematopoietiche ottenute da vari ceppi di topi

Ripopolazione del fegato con cellule staminali ematopoietiche ottenute da vari ceppi di topi

-gal anti--gal controllo anti--gal

Istochimica per attività G6Pasi FISH Fluorescenza GFP epatocita

Alb

GFP

topi Rosa-26topi Rosa-26 topi Rosa-26

Topi GFPTopi GFP Topi GFP

Non trattati

Trattati v.t.

Trattati i.f.

Trattati i.e.

0

20

40

60

80

100

120

5 10 15 20 25 30

giorni dal trattamento

% v

ivi

No trattamento (74)

intra vena (45)

intra epatica (22).

in utero. (8)

% v

ivi

Giorni dal trattamento

Il trattamento con cellule staminali aumenta la sopravvivenza dei topi glicogenotici

Il trattamento con cellule staminali aumenta la sopravvivenza dei topi glicogenotici

CONCLUSIONI

Cellule ematopoietiche staminali possono essere importanti per correggere i difetti enzimatici del fegato di pazienti con Glicogenosi di tipo 1a

CONCLUSIONI

Cellule ematopoietiche staminali possono essere importanti per correggere i difetti enzimatici del fegato di pazienti con Glicogenosi di tipo 1a

Trapianto di cellule ematopoietiche staminaliTrapianto di cellule ematopoietiche staminali

CELLULE STAMINALI MIDOLLARI PER RIPOPOLAMENTO DEL FEGATOCELLULE STAMINALI MIDOLLARI PER RIPOPOLAMENTO DEL FEGATOCirrosi epaticaCirrosi epatica

PaesePaese N° N° pazientipazienti

Tipo di cellule infuseTipo di cellule infuse Risultati ottenutiRisultati ottenutial follow-upal follow-up

follow-up follow-up (mesi)(mesi)

ItaliaItalia 88 mobilitazione con G-mobilitazione con G-CSFCSF11

Miglioramento parametri cliniciMiglioramento parametri clinici 8 8

GiapponeGiappone 99 Staminali derivate dal Staminali derivate dal midollomidollo

Miglioramento parametri cliniciMiglioramento parametri clinici 66

Iran Iran 44 Staminali Staminali ematopoietiche derivate ematopoietiche derivate dal midollodal midollo

Nessun miglioramento parametri cliniciNessun miglioramento parametri clinici 66

IranIran 44 Staminali mesenchimali Staminali mesenchimali derivate dal midolloderivate dal midollo

Miglioramento parametri cliniciMiglioramento parametri clinici 1212

BrasileBrasile 1010 Mononucleate totaliMononucleate totali Nessun miglioramento parametri cliniciNessun miglioramento parametri clinici 44

BrasileBrasile 3030 Mononucleate totaliMononucleate totali Miglioramento parametri cliniciMiglioramento parametri clinici 33

GreciaGrecia 22 Mononucleate totaliMononucleate totali Miglioramento parametri cliniciMiglioramento parametri clinici 1212

InghilterraInghilterra 55 CD34+ dopo adesione CD34+ dopo adesione su plasticasu plastica22

Miglioramento parametri cliniciMiglioramento parametri clinici 1212

GermaniaGermania 66 CD133+CD133+ Miglioramento parametri cliniciMiglioramento parametri clinici NANA

GermaniaGermania33 1313 CD133+CD133+ Miglioramento parametri cliniciMiglioramento parametri clinici NANA

I DIECI PRINCIPI DELLE GOOD MANUFACTURING PRACTICELE NORMATIVE EUROPEE

Cell factory

LA GESTIONE DEL SISTEMA DI QUALITÀ

•Il personale -Le figure indispensabili:- Qualified Person- Responsabile Produzione-Responsabile Controllo Qualità

•La documentazione* La gestione della documentazione* Le standard operating procedures* I protocolli

• Il change control•Le deviazioni•Out of  specification e out of trend nei laboratori di controllo qualità •La gestione delle azioni correttive e preventive•I reclami ed i richiami•Le auto ispezioni•La certificazione dei lotti

LA PRODUZIONE

•Descrivere i flussi dei materiali in conformità alle normative GMP•Descrivere i flussi di processo in conformità alle normative GMP•Gli ambienti e le apparecchiature•I sistemi di condizionamento•Le utilities* Acqua* Vapore* Gas* ecc…•La qualifica e le sue fasi•La convalida di processo•Il mantenimento dello stato di qualifica e convalida* Calibrazione* Manutenzione* Riqualifica

IL CONTROLLO QUALITÀ•Ruoli e competenze•Le attività di laboratorio* Metodi di analisi* La qualifica della strumentazione* La convalida dei metodi di analisi•lL campionamento

LE GESTIONE DELLE ATTIVITÀ A CONTRATTO• Il “Technical/Quality Agreement”•La qualifica del fornitore

Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the

liver of glycogen storage disease type Ia.

Kim DY et al, J Hepatol. 2008Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the

liver of glycogen storage disease type Ia.

Kim DY et al, J Hepatol. 2008

La glicogenosi 1a può essere

associata ad uno stato infiammatorio

La glicogenosi 1a può essere

associata ad uno stato infiammatorio

Glicogenosi tipo 1aManifestazioni cliniche

epatomegalia

ipoglicemia

iperuricemia

iperlipidemia

ritardi di crescita

Complicazionimancata crescitaritardo puberta’gotta giovanilepancreatitearteriosclerosiepatomaipertensioneadenomamalattie renali

zuccheri

grassi

proteine

G6PaseG6Pase

InfiammazioneInfiammazione

CitochineIL-6, IL-8

Che cosa causa l’infiammazione?Che cosa causa l’infiammazione?

No VHL

normale

normale

No VHL

Il gene della sindrome Von Hippel Lindau (VHL)Il gene della sindrome Von Hippel Lindau (VHL)

normaleNo G6Pasi

Hypoxia causes inflammationHypoxia causes inflammationHypoxia causes inflammationHypoxia causes inflammation

Years ago:3.8 billion first procariotic fossil2.0 billion photosynthetic organisms

Oxygen captured by ferrous iron Earth “rusted”

1.8 billion first eucariotic organismHypoxic Atmosphere (1% oxygen)

0.6 billion animal evolutionNormoxic Atmosphere ( 20% oxygen)

Years ago:3.8 billion first procariotic fossil2.0 billion photosynthetic organisms

Oxygen captured by ferrous iron Earth “rusted”

1.8 billion first eucariotic organismHypoxic Atmosphere (1% oxygen)

0.6 billion animal evolutionNormoxic Atmosphere ( 20% oxygen)

physiologic pathologic

HIF-1 PathwayHIF-1 Pathway

HIF-1P

P

HIF-1P

P

OH

OH

pVHL

HIF-1P

P

OH

OH

HIF-1P

P

OH

OHUb

UbUb

HIF-1

ProteosomProteosomal al degradatidegradationon

UbiquitinaUbiquitinationtion

NORMOXIANORMOXIAProlylProlyl--

HydroxylationHydroxylation

UbUb

HYPOXIAHYPOXIA

StabilizatiStabilizationon

HIF-1P

P

HIF-1P

PHIF-1P

PHIF-1P

PHIF-1P

P

HIF-1P

PHIF-1P

PHIF-1P

P

HydroxylationHydroxylation

StabilizatiStabilizationon

HRE

HIF-1

HIF-1P

P

CBP/p300

Transcription

cofactors

HRE

HIF-1

HIF-1P

P

CBP/p300

Transcription

cofactors

xx No VHL

Hypoxia in patho-physiological processesHypoxia in patho-physiological processesHypoxia in patho-physiological processesHypoxia in patho-physiological processes

HYPOXIA(pO2 0-20mm Hg)

Growing tumors

Cerebral ischemia Myocardial ischemia

Pulmonary hypertension

Rheumatoid arthritis

Diabetic retinopathy

Wound healing

PreeclampsiaIntrauterine growth

retardation

Energy metabolism

Cell proliferation/survival

Angiogenesis Cell survival

Cell migrationErytropoiesis

Microbial infections

Aherosclerosis

Ipossia

Glicogenosi 1a

C’è ipossia nel fegato glicogenotico?C’è ipossia nel fegato glicogenotico?

Il mondo dell’ “omica”

54000 probsets54000 probsets

The chipThe chip

PROFILO DI ESPRESSIONE PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA IN GSD1aGENICA IN GSD1a

Analisi tramite tecnologia microarray del: Profilo di espressione genica nel fegato di TRE

pazienti GSD1a trapiantati rispetto a TRE soggetti normali

Bibliosphere (Genomatics) nuovo programma per analizzare le vie metaboliche modificate nei tessuti

Analisi tramite tecnologia microarray del: Profilo di espressione genica nel fegato di TRE

pazienti GSD1a trapiantati rispetto a TRE soggetti normali

Bibliosphere (Genomatics) nuovo programma per analizzare le vie metaboliche modificate nei tessuti

Ipossia nel fegato di pazienti con glicogenosi 1a Ipossia nel fegato di pazienti con glicogenosi 1a Ipossia nel fegato di pazienti con glicogenosi 1a Ipossia nel fegato di pazienti con glicogenosi 1a

NAMENAME

23 GENI OXP23 GENI OXP

HYPOXIA_REG_UPHYPOXIA_REG_UP

LINES_MYC_LEALINES_MYC_LEA

NB-HYPO_32 GENESNB-HYPO_32 GENES

L1L2_11PBSTL1L2_11PBST

HYPOXIA_RCC_NOVHL_UPHYPOXIA_RCC_NOVHL_UP

L1L2_M-L1L2_M-

V$HIF1_Q3V$HIF1_Q3

HYPOXIA_NORMAL_UPHYPOXIA_NORMAL_UP

HIF1_TARGETSHIF1_TARGETS

L1L2_M+L1L2_M+

TRP_U133TRP_U133

HYPOXIA_REVIEWHYPOXIA_REVIEW

V$HIF1_Q5V$HIF1_Q5

HYPOXIA_RCC_UPHYPOXIA_RCC_UP

LEA_C1_SET_TOPLEA_C1_SET_TOP

NAME

HSA00190_OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION

HSA00330_ARGININE_AND_PROLINE_METABOLISM

HSA01040_POLYUNSATURATED_FATTY_ACID_BIOSYNTHESIS

HSA00272_CYSTEINE_METABOLISM

HSA00360_PHENYLALANINE_METABOLISM

HSA00010_GLYCOLYSIS_AND_GLUCONEOGENESIS

HSA00020_CITRATE_CYCLE

HSA00910_NITROGEN_METABOLISM

HSA00252_ALANINE_AND_ASPARTATE_METABOLISM

HSA00030_PENTOSE_PHOSPHATE_PATHWAY

HSA04610_COMPLEMENT_AND_COAGULATION_CASCADES

HSA00220_UREA_CYCLE_AND_METABOLISM_OF_AMINO_GROUPS

OO22

CC-chemokine receptors ↓

Gro-chemokines ↑

Monocyte trapping

Circulation

Monocyte

Hypoxic tissue

Mn migration inhibiting factor (MIF) ↑G-protein deactivator (RGS1) ↑

Motility-promoting factor (ENPP2) ↓

CXC-Chemokines ↑

Neutrophils recruitment

Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the

liver of glycogen storage disease type Ia.

Kim DY et al, J Hepatol. 2008Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the

liver of glycogen storage disease type Ia.

Kim DY et al, J Hepatol. 2008

Che cosa provoca queste risposte?

Che cosa provoca queste risposte?

L’IPOSSIA DEL FEGATO

L’IPOSSIA DEL FEGATO

Glicogenosi tipo 1aManifestazioni cliniche

epatomegalia

ipoglicemia

iperuricemia

iperlipidemia

ritardi di crescita

Complicazionimancata crescitaritardo puberta’gotta giovanilepancreatitearteriosclerosiepatomaipertensioneadenomamalattie renali

zuccheri

grassi

proteine

G6PaseG6Pase

InfiammazioneInfiammazione

CitochineIL-6, IL-8

Che cosa causa l’infiammazione?Che cosa causa l’infiammazione?

L’IPOSSIA DEL FEGATO

L’IPOSSIA DEL FEGATO

Quali sono le criticità?

TrattamentoTrattamento

BBiobanca iobanca IIntegrata ntegrata TTessuto-genomica (essuto-genomica (BITBIT) Gaslini) GasliniBBiobanca iobanca IIntegrata ntegrata TTessuto-genomica (essuto-genomica (BITBIT) Gaslini) Gaslini

PazientiPazienti

Strutture DNA Espressione Genica

RNA regolatori

Strutture DNA Espressione Genica

RNA regolatori

ClassificazionePatologiaDiagnosi

ClassificazionePatologiaDiagnosi

Clinica•Fattori Prognostici• Indicatori risposta

Clinica•Fattori Prognostici• Indicatori risposta

BiobancaBiobanca

Raccolta tessuto

“omics”“omics”

Arrays

Derivati delTessuto

Derivati delTessuto

Frazionament tessuto

IntegrazioneIntegrazione

Bioinformatica

Dati cliniciDati clinici

Datti: centinaia di migliaia

Datti: centinaia di migliaia

DNA, RNA,Proteine,

distribuzione conservazione

DNA, RNA,Proteine,

distribuzione conservazione

Raccolta , conservazione,Distribuzione

tessuto

Raccolta , conservazione,Distribuzione

tessuto

BANCA DATIBANCA DATIBANCA DATIBANCA DATI

BITRicerca:•Data mining•Biomarcatori•Vie Metaboliche

Ricerca:•Data mining•Biomarcatori•Vie Metaboliche

BIT

BIT

BIT

BIT

BIT

BIT

DiBi

Biobanca Digitale Europea (DiBi) aggrega varie “BIT” Biobanca Digitale Europea (DiBi) aggrega varie “BIT”

Centralizzazione dell’informazione

e nondei tessuti/sieri

Centralizzazione dell’informazione

e nondei tessuti/sieri

CollaboratoriCollaboratoriCollaboratoriCollaboratori

Biologia Molecolare Gaslini Biologia Molecolare Gaslini

• R. LavieriR. Lavieri

• A. EvaA. Eva

• P. FardinP. Fardin

• R.ResazR.Resaz

• L. VaresioL. Varesio

Biologia Molecolare Gaslini Biologia Molecolare Gaslini

• R. LavieriR. Lavieri

• A. EvaA. Eva

• P. FardinP. Fardin

• R.ResazR.Resaz

• L. VaresioL. Varesio

NationalNational Institutes of Health Institutes of Health (USA)(USA)• J.ChouJ.Chou• D. MunroeD. Munroe• S.K. AryaS.K. Arya

NationalNational Institutes of Health Institutes of Health (USA)(USA)• J.ChouJ.Chou• D. MunroeD. Munroe• S.K. AryaS.K. Arya

IST Genova IST Genova • O. BarbieriO. Barbieri

IST Genova IST Genova • O. BarbieriO. Barbieri

Associazione Italiana Associazione Italiana GlicogenosiGlicogenosi

Associazione Italiana Associazione Italiana GlicogenosiGlicogenosi

Reparti CliniciReparti Clinici

Dr. M. Di RoccoDr. M. Di Rocco• G.Gaslini Institute (Genova)G.Gaslini Institute (Genova)

Dr. D. MelisDr. D. Melis

• Federico II University (Napoli) Federico II University (Napoli)

Dr. R.PariniDr. R.Parini

•S.Gerardo Hospital (Monza)S.Gerardo Hospital (Monza)

Dr. S. PaciDr. S. Paci

•S.Paolo Hospital (Milano)S.Paolo Hospital (Milano)

Dr. E. ProcopioDr. E. Procopio

•Meyer Hospital (Firenze)Meyer Hospital (Firenze)

Dr. C. DionisiDr. C. Dionisi

•Bambin Gesù Hospital (Roma)Bambin Gesù Hospital (Roma)

Reparti CliniciReparti Clinici

Dr. M. Di RoccoDr. M. Di Rocco• G.Gaslini Institute (Genova)G.Gaslini Institute (Genova)

Dr. D. MelisDr. D. Melis

• Federico II University (Napoli) Federico II University (Napoli)

Dr. R.PariniDr. R.Parini

•S.Gerardo Hospital (Monza)S.Gerardo Hospital (Monza)

Dr. S. PaciDr. S. Paci

•S.Paolo Hospital (Milano)S.Paolo Hospital (Milano)

Dr. E. ProcopioDr. E. Procopio

•Meyer Hospital (Firenze)Meyer Hospital (Firenze)

Dr. C. DionisiDr. C. Dionisi

•Bambin Gesù Hospital (Roma)Bambin Gesù Hospital (Roma)

Haematopoietic stem cells

Hematopoiesis in the red bone marrow

MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1AIn preparazione

Modello animale Caratteristiche Costruttore

Topi condizionali Knock-out (SV40-CRE) Chou, J. (pubblicato)

Topi condizionali Delezione della G6Pasi solo nel rene

Chou, J. (nessuna informazione)

Topi condizionali Knock-out (CMV.CRE) Varesio. I knock-out muoiono tutti alla nascita

Topi condizionali Delezione della G6Pasi solo nel fegato

Varesio. Stanno nascendo i primi topi

Topi condizionali ??? Fabienne RAJAS Gilles Mithieux. Nessuna informazione Nulla di pubblicato.

MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1AUtilizzati finora

Modello animale

Tipo di terapia utilizzata

Risultati Costruttore

Topo knock-out

Adenovirus Controllo parziale della patologia per breve tempo Chou, J.

Adenovirus + adenoassociato

Controllo parziale della patologia per medio tempo con miglioramento anche sul rene

Chou, J.

Adenoassociato di nuova costruzione

Controllo completo della malattia Chou, J.2

Cane knock-out1

Modello animale spontaneo per la GSD-Ia.

Adenoassociato Controllo parziale della patologia Koeberl DD (NC)3

Cane knock-out

Modello animale spontaneo per la GSD-Ia.

Adenoassociato Controllo parziale della patologia Mah CS (FL) 4 e Chou, J