FLUSSO DI LAVORO DELLA CROMATOGRAFIA A SCAMBIO … · bio-inert da 10 mm. Velocità di flusso...

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Sistema LC Bio-Inert Agilent 1260 Infinity Linee guida • Proteine basiche: SCX (scambio cationico forte) o WCX (scambio cationico debole) • Tenere in considerazione il punto isoelettrico (pI) della proteina per la scelta del pH della fase mobile. Se pH<pI, la carica netta della proteina è positiva. • Il pH del tampone iniziale deve differire di 0,5-1 unità di pH rispetto al valore pI (inferiore a pI per lo scambio cationico) • Se il pI non è noto, iniziare a pH 6 per lo scambio cationico • Iniziare con colonne SCX, che possiedono l'intervallo operativo più ampio; le colonne WCX possono essere utilizzate per variare la selettività. • I tamponi utilizzabili per lo scambio cationico (pH compreso tra 4 e 7) includono formiato, acetato, MES, fosfato, HEPS Fasi mobili La fase mobile deve contenere il tampone necessario a mantenere il valore desiderato di pH; la concentrazione tipica è pari a 20 mM. La concentrazione del sale di eluizione in genere è compresa tra 400 e 500 mM. Il software Agilent Buffer Advisor è utilizzato per sviluppare il profilo di gradiente desiderato mediante la miscelazione di varie proporzioni di quattro soluzioni madre. Iniezione di campione (G5667A) Iniezione di 1-10 µL per la massima risoluzione. Il campione deve essere solubile nella fase mobile. Temperatura della colonna (G1316C) Limite massimo pari a 80 °C. La durata delle colonne è ottimale in caso di utilizzo tra 10 e 50 °C. Rivelazione (G1315C) Rivelatore UV G1315D con cella di flusso standard bio-inert da 10 mm. Velocità di flusso (G5611A) La velocità di flusso tipica per colonne di diametro interno pari a 4,6 mm è compresa tra 0,5 e 1,0 mL/min. FLUSSO DI LAVORO DELLA CROMATOGRAFIA A SCAMBIO CATIONICO COLONNE PER HPLC AGILENT BIO IEX COLONNE PER HPLC AGILENT BIO MAB In questo documento gli esperti di chimica applicata Agilent offrono alcuni consigli su un sistema LC ottimale e su come configurarlo per la caratterizzazione di biomolecole. Inoltre, forniscono utili indicazioni su un metodo generico iniziale e su come ottimizzarlo ulteriormente per ottenere specifici obiettivi di separazione. Ulteriori informazioni sull'applicazione sono disponibili sul sito www.agilent.com/chem/advancebio Selezione colonna Colonne per HPLC Bio IEX, PEEK Bio SCX Bio WCX Colonne per HPLC Bio MAb, PEEK Descrizione Codice Codice Codice 4,6 x 250 mm, 10 µm 5190-2435 5190-2455 5190-2415 4,6 x 50 mm, 10 µm 5190-2436 5190-2456 5190-2416 4,6 x 250 mm, 5 µm 5190-2427 5190-2447 5190-2407 4,6 x 50 mm, 5 µm 5190-2428 5190-2448 5190-2408 2,1 x 250 mm, 10 µm 5190-2439 5190-2459 5190-2419 2,1 x 50 mm, 10 µm 5190-2440 5190-2460 5190-2420 2,1 x 250 mm, 5 µm 5190-2431 5190-2451 5190-2411 2,1 x 50 mm, 5 µm 5190-2432 5190-2452 5190-2412 Fase legata SCX (scambio cationico forte) – SO3H WCX (scambio cationico debole) – COOH Campioni Colonna Anticorpi monoclonali Bio MAb Peptidi e proteine Bio SCX e WCX Peptidi e proteine globulari PL-SCX 1000 Å Macro-biomolecole/alta velocità PL-SCX 4000 Å Proteine, anticorpi Bio-Monolith SO3 Nota: per ottenere i codici delle colonne per HPLC Bio IEX e Bio MAb in acciaio inox, consultare il documento Agilent BioHPLC Column Selection Guide, 5990-9384EN.

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Sistema LC Bio-Inert Agilent 1260 Infinity

Linee guida• Proteine basiche: SCX (scambio cationico

forte) o WCX (scambio cationico debole)• Tenere in considerazione il punto isoelettrico

(pI) della proteina per la scelta del pH della fase mobile. Se pH<pI, la carica netta della proteina è positiva.

• Il pH del tampone iniziale deve differire di 0,5-1 unità di pH rispetto al valore pI (inferiore a pI per lo scambio cationico)

• Se il pI non è noto, iniziare a pH 6 per lo scambio cationico

• Iniziare con colonne SCX, che possiedono l'intervallo operativo più ampio; le colonne WCX possono essere utilizzate per variare la selettività.

• I tamponi utilizzabili per lo scambio cationico (pH compreso tra 4 e 7) includono formiato, acetato, MES, fosfato, HEPS

Fasi mobiliLa fase mobile deve contenere il tampone necessario a mantenere il valore desiderato di pH; la concentrazione tipica è pari a 20 mM. La concentrazione del sale di eluizione in genere è compresa tra 400 e 500 mM.Il software Agilent Buffer Advisor è utilizzato per sviluppare il profilo di gradiente desiderato mediante la miscelazione di varie proporzioni di quattro soluzioni madre.

Iniezione di campione (G5667A)Iniezione di 1-10 µL per la massima risoluzione. Il campione deve essere solubile nella fase mobile.

Temperatura della colonna (G1316C)Limite massimo pari a 80 °C. La durata delle colonne è ottimale in caso di utilizzo tra 10 e 50 °C.

Rivelazione (G1315C)Rivelatore UV G1315D con cella di flusso standard bio-inert da 10 mm.

Velocità di flusso (G5611A)La velocità di flusso tipica per colonne di diametro interno pari a 4,6 mm è compresa tra 0,5 e 1,0 mL/min.

FLUSSO DI LAVORO DELLA CROMATOGRAFIA A SCAMBIO CATIONICO COLONNE PER HPLC AGILENT BIO IEX COLONNE PER HPLC AGILENT BIO MAB

In questo documento gli esperti di chimica applicata Agilent offrono alcuni consigli su un sistema LC ottimale e su come configurarlo per la caratterizzazione di biomolecole. Inoltre, forniscono utili indicazioni su un metodo generico iniziale e su come ottimizzarlo ulteriormente per ottenere specifici obiettivi di separazione.Ulteriori informazioni sull'applicazione sono disponibili sul sito www.agilent.com/chem/advancebio

Selezione colonnaColonne per HPLC Bio IEX, PEEKBio SCX Bio WCX

Colonne per HPLC Bio MAb, PEEK

Descrizione Codice Codice Codice4,6 x 250 mm, 10 µm 5190-2435 5190-2455 5190-24154,6 x 50 mm, 10 µm 5190-2436 5190-2456 5190-24164,6 x 250 mm, 5 µm 5190-2427 5190-2447 5190-24074,6 x 50 mm, 5 µm 5190-2428 5190-2448 5190-24082,1 x 250 mm, 10 µm 5190-2439 5190-2459 5190-24192,1 x 50 mm, 10 µm 5190-2440 5190-2460 5190-24202,1 x 250 mm, 5 µm 5190-2431 5190-2451 5190-24112,1 x 50 mm, 5 µm 5190-2432 5190-2452 5190-2412

Fase legataSCX (scambio cationico forte) – SO3H

WCX (scambio cationico debole) – COOHCampioni ColonnaAnticorpi monoclonali Bio MAbPeptidi e proteine Bio SCX e WCXPeptidi e proteine globulari PL-SCX 1000 ÅMacro-biomolecole/alta velocità PL-SCX 4000 ÅProteine, anticorpi Bio-Monolith SO3

Nota: per ottenere i codici delle colonne per HPLC Bio IEX e Bio MAb in acciaio inox, consultare il documento Agilent BioHPLC Column Selection Guide, 5990-9384EN.

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Condizioni iniziali consigliate

Anticorpi monoclonali Anticorpi monoclonali,proteine e peptidi

Gradiente salino Gradiente di pH Gradiente salino

Colonne Bio WCX, 4,6 x 250 mm, 10 μmBio WCX, 4,6 x 250 mm, 5 μm

Bio MAb, 4,6 x 250 mm, 5 μm Bio SCX, 4,6 x 50 mm, 3 µmWCX, 4,6 x 50 mm, 3 µmBio MAb, 4,6 x 50 mm, 3 µm

Fase mobile A: acquaB: NaCl 1,6 MC: NaH2PO4 40,0 mMD: Na2HPO4 40,0 mMMiscelando proporzioni predeterminate di fase mobile C e D, si ottengono soluzioni tampone 20 mM nell'intervallo di pH desiderato.

A: acquaB: NaCl 1,6 MC: NaH2PO4 40,0 mMD: Na2HPO4 40,0 mMMiscelando proporzioni predeterminate di fase mobile C e D, si ottengono soluzioni tampone nell'intervallo di pH desiderato e alla forza selezionata.

A: fosfato di sodio 20 mM, pH 5,0 per WCX o pH 6,0 per SCX

B: tampone A + NaCl 1 mM

Gradiente Da 0 a 50% B, da 0 a 20 min (pH costante, per esempio pH 6,0) 50% B, da 20 a 25 min, 0% B, da 25 a 35 min

pH da 6,0 a 8,0, da 0 a 20 minNaCl da 0 a 800 mM, da 20 a 25 min, NaCl 800 mM, da 25 a 30 min

Da 1 a 100% B in 30 min per colonne da 50 mm,60 min per colonne da 250 mm

Velocità di flusso

1 mL/min 1 mL/min 0,5 mL/min

Temperatura Ambiente Ambiente AmbienteIniezione 10 μL 10 μL 10 μLCampione 2 mg/mL

(in tampone fosfato di sodio 20 mM, pH 6,0)2 mg/mL (in tampone fosfato di sodio 20 mM, pH 6,0)

Rivelazione UV, 220 nm UV, 220 nm UV, 220 nm

5 10 15 20 25min

6 8 10 12 14 16min

6 8 10 12 14min

SCXWCXMAb 1

1

1

2

2

2

3

3

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Agilent non può essere ritenuta responsabile per errori contenuti nella presente pubblicazione o per danni accidentali o consequenziali derivanti

dalla fornitura, dalle prestazioni o dall'utilizzo del presente materiale.

Le informazioni, descrizioni e specifiche fornite possono variare senza preavviso.

© Agilent Technologies, Inc. 2015 Stampato negli Stati Uniti, 1° agosto 2015

5991-6104ITE

Separazione di standard di proteine a pH 7,0 utilizzando una colonna Agilent Bio WCX, 4,6 × 250 mm, 10 μm.Ovalbumina (pI 4,5)Ribonucleasi (pI 9,4)Citocromo C (pI 9,8)Lisozima (pI 11)

Analisi di un anticorpo monoclonale IgG utilizzando un gradiente di pH tra 6,5 e 7,5 (0-20 min), 50 mM su colonna Agilent Bio MAb, 4,6 x 50 mm, 5 μm

Separazione di standard di proteine su colonne Agilent a scambio ionico da 3 μm tramite cromatografia a scambio cationicoRibonucleasi (pI 9,4)Citocromo C (pI 9,8)Lisozima (pI 11)