FASE SPERIMENTALE 1 OBIETTIVO : LA COMPETENZA

Rendere le cellule di Escherichia coli competenti, cioè in grado di far entrare geni estranei attraverso DNA plasmidico

Classe 5^ BIO2 Primo Levi

Una cellula è chiamata competente se è in grado di assumere del DNA esogenota e integrarlo nel suo genoma.

COMPETENZA NATURALELa competenza èdeterminata geneticamente:

-proteina legante DNA-proteina di competenza-proteina RecACOMPETENZA ARTIFICIALEI batteri non hanno i geniper la competenza equesta viene indotta inlaboratorio con tecniche specifiche.

LA COMPETENZA In laboratorio

• Raffreddare le cellule dell’inoculo standardizzato per 10 minuti in ghiaccio tritato

• Trasferire 2 ml in provetta e centrifugare a 13000 rpm per 2 min

• Scartare il surnatante e risospendere in CaCl2 e MgCl2

freddo• Centrifugare a 13000 rpm per

2 minuti a 4° C• Risospendere in CaCl2 freddo

• Mantenere in ghiaccio

Si vuole aumentare la permeabilità della membrana cellulare

Inoculo standardizzato

Concentrazione nota

Confronto allo spettrofotometro:

Standard Turbidimetrico InoculoMc Farland

max 108 cell/ml

Inoculo standardizzato

Come si ottiene

• Inoculare una colonia singola in 20mL di LB broth • incubare in agitazione o/n a 37°C

• Trasferire un’aliquota della brodocoltura o/n in LB broth sterile in beuta, effettuando una diluizione 1:100 (es. 250 mL di inoculo in 25 mL di brodo fresco) e controllare l’assorbanza a λ=595nm. Il valore non dovrebbe essere superiore a 0.05 O.D.

• Far crescere in agitazione a 37°C da 3 a 4 ore circa.

• Controllare l’assorbanza a λ=595nm, avendo presente che le cellule vanno raccolte quando la brodocoltura ha raggiunto un’assorbanza a λ=595nm, pari a 0.4 O.D., che corrisponde a circa 108 cell/ml.

• Se l’assorbanza va bene raffreddare le cellule, incubandole per 10 min in ghiaccio tritato.

Il protagonista: Escherichia coliÈ un Enterobattere coliforme:

• “Enterico" perché è un componente della flora intestinale;

• “Coliforme” perché vive nel colon. E’ di forma bastoncellare e aerobio facoltativo;

• “Gram negativo” in base alla composizione della parete cellulare;

• E’ oggetto di molti studi e per questo si è a conoscenza dell’intera mappatura genomica (4500 geni)

Ed ora…

Passiamo il testimone