Etapa Analitica y post analitica de Anatomia Patologica de Apoyo/APA... · 5. Desarrollo: 5.1...

Código: DOC – ANA 4 APA 1.3. M Junio 2011 Edición: 2

Fecha: Agosto 2010

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Unidad de Anatomía

Patológica

SERVICIO DE SALUD OCCIDENTE

HOSPITAL SAN JUAN DE DIOS-CDT

Etapa analítica y post analítica de Unidad de Anatomía patológica

Vigencia: Junio 2014


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Vigencia: Junio 2014 4. Definiciones: 4.1 Biopsias pequeñas: Análisis macroscópico por tecnólogo médico, ejemplo: Biopsias Endoscópicas, endometrios, bronquiales, otorrino, etc. 4.2 Biopsias complejas: Piezas quirúrgicas que requieren análisis macroscópico por Patólogo. 4.3 Biopsia Rápida: Biopsia que se realiza en paralelo al acto quirúrgico. 4.4 Validación: Certificación de resultado con firma de médico patólogo. 5. Desarrollo: 5.1 Recepción de muestras:

5.2 Examen macroscópico:

• Recibir muestras identificadas, numeradas y formulario de Solicitud. • Cotejar número de muestra y nombre del paciente anotado en el

envase, con su respectivo formulario de Solicitud.

EXAMEN MACROSCÓPICO • Realizar examen macroscópico de la muestra, orientación, marcación

con tintas según protocolo si corresponde y seleccionar tejido a estudiar

• Revisión de condiciones de la muestra: cantidad adecuada de fijador, condiciones de bioseguridad.

• Verificar concordancia de datos de muestra y formulario de solicitud. • Si datos y muestra son correctos firmar recibido conforme libro de las

diferentes unidades de origen de la muestra. • Si no cumple requisitos rechazar muestra y dejar constancia. • Asignar número correlativo, colocar el número asignado en envase de

muestra y formulario de solicitud. • Poner letra de identificación de médico patólogo y secretaria. • Timbrar formulario de solicitud con fecha de recepción • Ingresar a programa informático File Maker, datos completos. Toda

muestra debe ser ingresada antes de pasar a procesamiento.

RECEPCIÓN DE MUESTRAS

• Trasladar muestras a laboratorio de Macroscopía o Laboratorio de histotecnología según corresponda.


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Vigencia: Junio 2014 5.3 Biopsia Intraoperatoria:

• Anotar en planilla diaria: hora de llegada de la muestra, tipo de órgano o tejido, Nº de biopsia, nombre de paciente y procedencia.

• Anotar descripción macroscópica en formulario. • Realización de cortes y evaluación macroscópica de la lesión. • Confección de frotis para citología si procede • Obtención de cortes para congelación • Fijación en alcohol absoluto y tinción HE de Citología • Congelación y cortes histológicos en crióstato • Tinción HE de cortes histológicos, montaje de láminas • Observación microscópica de citologías y cortes histológicos • Realización de Diagnóstico • Registro de resultados en formulario • Notificación a pabellón solicitante en 30 minutos. • Notificación de biopsia rápida se realiza por citófono o teléfono,

además el resultado también se informa por escrito en un formulario que acompaña la solicitud estándar. Este debe ser retirado por un funcionario de la Unidad de origen de la biopsia.

• Registro de hora de notificación en planilla diaria • Descongelación y encasetado de cortes congelados, para estudio

diferido

BIOPSIA INTRAOPERATORIA

(RÁPIDA)

• Colocar en formalina tejido restante debidamente identificado, para estudio posterior.

5.4 Biopsia Diferida:

• Anotar descripción macroscópica en formulario. • Numerar casettes necesarios con lápiz mina de buena calidad,

poner el mismo número en papel al interior del cassette. • Poner tejidos seleccionados en casettes numerados, verificar que

el número de cada cassette corresponda a muestra estudiada. • Anotar cantidad de casettes en formulario y cantidad de trozos de

tejido si corresponde. • Poner los casettes en un frasco con formalina neutra o tamponada

según indicación. • Verificar que la cantidad de formalina sea al menos 10 veces

superior al volumen de las muestras • Rotular cada frasco con casettes con fecha y nombre de patólogo

y becado. Indicar si las muestras están fijadas o sin fijar. • Trasladar frascos con casettes a laboratorio de histotecnologia Nº

2, dejar bajo campana de extracción. • Llevar formularios de solicitud de examen a Laboratorio de • Histotecnologia Nº 1, dejar en gaveta correspondiente a cada • Patólogo.

BIOPSIA DIFERIDA

• Guardar el tejido remanente en bolsa plástica sellada, debidamente


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identificada con número y nombre del paciente, en sala de reserva de muestras ordenadas por número correlativo.

• El tejido remanente se guarda alrededor de 2 meses. Antes de eliminar verificar que el Estudio de cada caso está completo.

• Eliminar tejidos remanentes según protocolo • Emplear elementos de protección personal adecuada para todas las

etapas del proceso. 5.5 Procesos de laboratorio: 5.5.1 Técnica de procesamientos de muestras:

• Las muestras fijadas, contenidas en casettes numerados se distribuyen en canastillos del procesador de tejidos.

• Se programa procesador y se pone a funcionar en modo automático.

• Durante su proceso las muestras se deshidratan en 5 baños de alcohol etílico, los dos primeros de 95% y los tres restantes de 100%. Cada paso de 1 hora

• Luego de la deshidratación las muestras se aclaran en 4 baños de xilol. 1 hora en cada uno.

• Después de aclarar las muestras estas se impregnan en tres baños de parafina fundida a temperatura máxima de 60 grados Celsius. 1 hora en cada baño.

Deshidratación, aclaramiento e

impregnación de tejidos

• Las muestras se retiran de procesador y se distribuyen en los centros de inclusión.

• Cada muestra se incluye en parafina a 60º Celsius utilizando un molde del tamaño mas cercano al trozo de tejido y se enfría en platina enfriante.

• Una vez fría la parafina, se desmolda la inclusión y se retira el excedente de parafina de los bordes.

• Se compaginan las inclusiones, se ordenan por caso y se anota en cuaderno Nº de identificación de la biopsia y número de inclusiones de cada una.

• Se revisa formulario de solicitud de biopsia de cada caso y se verifica si coincide la cantidad de casettes anotados en Laboratorio de Macroscopía con la cantidad de inclusiones obtenidas para cada biopsia.

• Si la cantidad de casettes no es coincidente, revisar nuevamente, si la diferencia persiste anotar este hecho en formulario y avisar a patólogo responsable.

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Inclusión de Parafina (Taco)

• Una vez revisadas y ordenadas las inclusiones se procede realizar el corte histológico.


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• Asegurarse que el micrótomo esté con seguro. • Poner cassette en porta muestra del micrótomo • Orientar y desgastar la inclusión hasta que la superficie de corte

sea la correcta. • Obtener cortes de 3, 4 o 5 micras según tipo de muestra. • Estirar corte en baño de flotación a 48 o 50º C.

Corte histológico, tinción y montaje

• Recoger corte en portaobjetos con medio adhesivo, rotulado con Nº de identificación de la inclusión y ordenar en canastillo de tinción.

• Secar cortes histológicos en estufa a 60-65 º C. por 45 a 60 minutos.

• Desparafinar cortes histológicos en tres pasos por xilol, 10 minutos cada uno.

• Hidratar los cortes, pasando por 3 alcoholes etílicos de 100% 1 alcohol de 95% y luego agua.

• Teñir cortes con tinción Hematoxilina-Eosina (HE) y otras tinciones solicitadas.

• Deshidratar y aclarar los cortes pasando por 1 alcohol etílico de 95%, 3 alcoholes etílicos de 100% y tres pasos de xilol.

• Cubrir las placas histológicas, utilizando medio de montaje, dejar secar.

• Revisar placas, remarcar si es necesario, chequear la calidad de corte y tinción.

• Asegurarse que el corte corresponda a la inclusión respectiva. • Ordenar las placas histológicas en bandejas para cada médico

patólogo, adjuntar formulario de solicitud de biopsia correspondiente.

• Registrar para cada caso: Nº de biopsia, cantidad de inclusiones, tipo de muestra, cantidad de placas histológicas, técnicas realizadas, fecha de ejecución , Tecnólogo Médico y médico patólogo responsables.

5.6 Examen histológico:

• Médico Patólogo realiza observación microscópica y solicita otros estudios si es necesario: técnicas especiales, inmunohistoquímica, o nuevos cortes según lo que cada caso requiere.

• Una vez completo el estudio del caso, el médico patólogo emite un informe escrito que se envía a secretaría.

EXAMEN HISTOLÓGICO

• Secretaria ingresa informe a sistema informático, según protocolo post analítico.


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Vigencia: Junio 2014 5.7 Técnicas de inmunohistoquímica (ihq) en tejidos incluidos en parafina:

Técnicas de inmunohistoquimica

Preparación de la

muestra

• Fijación del tejido a estudiar en formalina tamponada 12 a 24 horas. • Descalcificación en EDTA pH 7.4 si es necesario (Médulas Óseas y

otros tejidos calcificados) por 24 horas. • Procesar en forma habitual, temperatura máxima 60º C. • Médico Patólogo solicita IHQ en formulario establecido. • Adjuntar lámina histológica marcada con zona a estudiar. • Realizar cortes histológicos de 4 micras, recoger en portaobjetos

silanizados. • Cortar tejidos de control para cada anticuerpo a determinar. • Secar cortes en estufa, 1 hora a 60ºC, seguido de toda la noche a

37ºC. • Desparafinar e hidratar láminas según protocolo, lavar en Agua

destilada.

Recuperación antigénica

Recuperación por calor • Precalentar el buffer necesario a 95ºC en microondas, baño o

vaporera según indicaciones para cada anticuerpo. • Introducir las láminas y dejar el tiempo indicado según anticuerpo y

equipo utilizado. • Retirar contenedor de recuperación de la fuente de calor y dejar

reposar las láminas en el buffer por 20 minutos a temperatura ambiente.

Recuperación enzimática : proceder según protocolo recomendado para cada caso.

Bloqueo de peroxidasa endógena

• Lavar láminas en buffer PBS o agua destilada. • Tratar láminas con peróxido de Hidrógeno /metanol 7.5% por 5

minutos. • Si la muestra es hemorrágica este proceso se puede prolongar unos

minutos más. • Lavar en buffer PBS. (Ver anexo 1).

Bloqueo de proteínas

inespecíficas

• Marcar con lápiz hidrófobo la zona de tejido a estudiar. • Aplicar suero de caballo diluido según indicaciones del fabricante.

Aplicación anticuerpo primario

• SIN LAVAR , aplicar el anticuerpo diluido según indicaciones del fabricante y/o estandarizado en el laboratorio.

• Distribuir el anticuerpo de manera uniforme. • Incubar el tiempo indicado para cada anticuerpo a 25ºC. • Lavar en buffer PBS, 3 lavados de 3 minutos cada uno.


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Aplicación anticuerpo secundario

• Aplicar anticuerpo secundario estandarizado de manera uniforme. • Incubar el tiempo indicado por el fabricante a 25ºC. • Lavar en PBS. 3 lavados de 3 minutos cada uno.

Aplicación complejo avidina biotina

• Aplicar el complejo avidina biotina. • Incubar el tiempo indicado por el fabricante a 25ºC. • Lavar en PBS. 3 lavados de 3 minutos cada uno.

Visualización de la

reacción

• Utilizar guantes de nitrilo. • Diluir el DAB (Diaminobencidina) según indicaciones del fabricante. • Aplicar el DAB diluido a cada lámina, observando al microscopio. • Detener la reacción cuando la tinción con DAB sea la adecuada,

lavando con agua destilada. • Desechar el DAB en solución de Hipoclorito de sodio al 50% v/v • Lavar láminas en agua destilada. • Teñir láminas en hematoxilina con la intensidad necesaria para

visualizar núcleos, sin enmascarar la marcación. • Deshidratar, aclarar y montar láminas.

Revisión entrega

y registro

• Tecnólogo Médico responsable observa láminas con sus respectivos controles.

• Si se detectan problemas de reactividad, de muestras y/o controles, muestras desprendidas, etc. Repetir determinaciones.

• Entregar láminas a médicos Patólogos. • Registrar IHQ realizadas en libro respectivo e ingresar a sistema

informático (File Maker).

Diagnostico

• Médico Patólogo examina láminas de IHQ. • Si la IHQ es concluyente, emite diagnóstico o pide nuevas

determinaciones si las realizadas no son concluyentes. • Realización de diagnóstico final • Emisión de informe y validación con firma de médico patólogo.


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Vigencia: Junio 2014 5.8 Informe de biopsias:

Recepción de informe macroscópico y microscópico de biopsia escrito por médico patólogo, adjunto a formulario de solicitud de biopsia con datos completos del paciente. Verificar que los datos de ingreso del paciente sean coincidentes con los registrados en formulario. Escribir informe en programa computacional (File Maker). Revisión y corrección de informe por Médico Patólogo en programa computacional Imprimir 2 copias de informe corregido. Una vez validados los informes con firma de médico Patólogo entregar 2 copias a recepción de AP.

• Biopsias rápidas: Notificación a pabellón solicitante en 30 minutos. • Biopsias diferidas: Plazos de entrega de resultados:

Biopsias pequeñas: 10 días Biopsias complejas: 16 días

In

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es d

e bi

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as

Respaldar todos los informes de biopsias validados diariamente en PC y semanalmente en CD.

Registrar informes de biopsias en libros de entrega respectivos Distribuir los informes diariamente a las Unidades del HSJD. Firma de funcionario que recibe informe en libro de entrega, consignar fecha de recepción Otros hospitales y consultorios: retirar informes en Recepción APA, firma y fecha en libro correspondiente Archivar copias de informes validados ordenados por número de biopsia en forma correlativa. Las copias de informe serán entregadas excepcionalmente al paciente con autorización de médico Patólogo responsable. Observar en todo momento el principio de confidencialidad de los resultados

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Archivar formularios de solicitud de biopsias en forma correlativa mensual.


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Vigencia: Junio 2014 5.9 Procedimiento de respaldo de láminas histológicas y tacos:

Retirar casettes diariamente desde el Laboratorio de Histología y láminas desde Patología Archivar casettes y láminas en forma correlativa en cajas respectivas Identificar cajas con Nº correlativo Etiquetar cada caja indicando número de inicio y término de casettes y láminas guardadas Guardar estas cajas ordenadas de acuerdo al Nº correlativo en el estante correspondiente Anotar cada inclusión y lámina que salga de la Unidad en libro de recepción, registrar datos y firma de la persona que lo solicita y finalidad El uso de inclusiones y láminas para investigación deberán ser autorizados por el jefe de la unidad APA.

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En caso de traslado del archivo de inclusiones y placas o parte del mismo a otras dependencias debe ser autorizado por el jefe de la Unidad y profesional responsable

5.10 Protocolo de control de calidad interno:

Técnica Procedimiento

Laboratorio de macroscopía

Anotar en formulario de solicitud de biopsia y libro de registro cantidad de cassettes de cada biopsia, identificación y fecha de análisis.

Laboratorio de histotecnología

• Revisión de formulario de solicitud de biopsia para cada caso, verifica coincidencia de cantidad de cassettes registrados con el número de inclusiones obtenidas.

• Se verifica que tejido incluido en parafina corresponda a lo descrito en Macroscopía.

• En caso de discordancias se retienen placas hasta comunicar a Médico Patólogo responsable para su revisión y registro.

• Una vez obtenidas las placas histológicas se revisa que cada placa corresponda a su respectiva inclusión.

• Registro de cada caso, Nº de inclusiones, técnicas realizadas, casos con fijación deficiente médico patólogo responsable y fecha de entrega.

Técnicas de Histoquímica e

Inmunohistoquímica

• Utilización de cortes de tejido positivo para cada técnica. • Inmunohistoquímica: utilización de cortes de tejido con

marcación positiva para cada anticuerpo en cada lote de determinaciones.

• Registro de solicitudes de repetición de técnicas.


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Análisis Microscópico

Consulta de casos complejos con otros Médicos patólogos de la misma unidad o de otros centros.

6. Flujograma: N/A.

7. Indicador y método de evaluación:

Indicador % de descripciones macroscópicas coincidentes entregadas.

Formula

Nº de descripciones macroscópicas coincidente con material entregado por laboratorio / Nº total de inclusiones X 100.

Umbral de cumplimiento

Excelente: 95-100%. Aceptable: 89-94%. Crítico : 0-88%.

Evaluación • Trimestral. • Se evaluarán el total de las inclusiones del periodo.

Indicador % de inclusiones archivadas correctamente.

Formula

Nº de inclusiones archivadas correctamente x 100

Nº total de inclusiones del periodo.

Umbral de cumplimiento

Excelente: 95-100%. Aceptable: 89-94%. Crítico : 0-88%.

Evaluación • Trimestral. • Libro de laboratorio de Macroscopía, formulario de solicitud de biopsia, Libro

de histotecnología, revisión archivos de inclusiones.

8. Distribución del documento: 8.1 Unidad de Anatomía Patológica. 8.2 Dirección del establecimiento. 8.3 Subdirección de Apoyo Clínico. 8.4 Unidad de Calidad y Seguridad del paciente.


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Vigencia: Junio 2014 9. Referencias Bibliográficas: 9.1 Métodos en patología . Google books.com. 9.2 Histological and histochemical methods. J.A.Kiernan. 3ª ed. 1999. 9.3 Histotechnology. Freída L. Carson. ASCP. 10. Anexos: 10.1 Preparación de reactivos para Inmunohistoquímica.


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Vigencia: Junio 2014 Anexo 1: Preparación de Reactivos para Inmunohistoquímica.

Preparación de reactivos para Inmunohistoquímica

Compuesto Componente Buffer citrato pH 6.0 (0,01 M)

Acido cítrico 2.1 g. Disolver en 800 ml de agua destilada Ajustar a pH 6.0 con NAOH a 2M Aforar a 1000ml (un poco menos para volver a ajustar el Ph)

NaOH 2M NaOH 8g Agua destilada 100 ml.

Buffer fosfato Salino pH 7.3 (PBS 0,01 M)

Na2HPO4 1.096 g NaH2PO4·H2O 0.316 g NaCl 8.5 g Disolver los componentes en 800 ml de agua destilada. Ajustar a pH 7.3 con NaOH 1N si es necesario. Aforar con agua destilada a 1000 ml En caso de utilizar tabletas o buffer concentrado, preparar según instrucciones del Fabricante.

HCl 1 N

HCl concentrado 8.4 ml Agua destilada 80 ml Agregar el ácido al agua, luego aforar a 100 ml. Con agua destilada.

Buffer EDTA pH 8 (0,001 M)

EDTA 0.37 g H20 1000 ml Ajustar a pH 8.0 con NaOH 2N si es necesario (16 gotas aprox.)

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