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1 Laboratorio de Fisiología Animal, 2 Laboratorio de Reproducción Animal, Facultad de MedicinaVeterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú

3 Instituto de Patología, 4 Cátedra de Histología y Embriología, Facultad de Ciencias Veterinarias,Universidad Nacional de La Plata, Argentina

5 E-mail: evasquezc@gmail.com

Recibido: 1 de febrero de 2012Aceptado para publicación: 12 de octubre de 2013

ESTUDIO LECTINHISTOQUÍMICO DEL ÚTERO DE ALPACAS (Vicugnapacos) BAJO TRATAMIENTO SUPEROVULATORIO

LECTINHISTOCHEMISTRY STUDY OF THE UTERUS OF ALPACAS (Vicugna pacos)UNDER SUPEROVULATION TREATMENT

Verónica López C.1, María Vásquez C.1,5, Wilfredo Huanca L.2, Alexei Santiani A.2,Claudio Barbeito3,4, Carolina Canuzzi A.3, Boris Lira M.1, José Rodríguez G.1

RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue determinar el patrón de glicosilación delendometrio uterino en alpacas con y sin tratamiento de superovulación. Se utilizaroncinco alpacas no superovuladas con folículos ováricos menores de 4 mm y cinco alpacasque fueron sometidas a un tratamiento de superovulación en base a FSH, GnRH y hCG.Se tomaron muestras del cuerpo del útero y de ambos cuernos uterinos y se trabajaroncon las técnicas histoquímicas PAS y Azul Alcián y con la técnica de lectinhistoquímica.Para esta última se utilizaron 14 lectinas, de las cuales PNA, RCA-I, ConA, DBA, WGA,sWGA, GS, LCA, SJA y PHA-L presentaron un patrón de glicosilación diferente entreambos grupos, sugiriendo que el tratamiento hormonal influenció en la expresión de losglicoconjugados que se unen a estas lectinas. Asimismo, las lectinas PNA, SJA, SBA,ConA, LCA y PSA presentaron diferencias entre el cuerno derecho y el cuerno izquier-do, lo que sugiere que los glicoconjugados de unión a estas lectinas podrían participaren generar un ambiente propicio para la implantación, que por lo general se da en elcuerno izquierdo en la alpaca. Se concluye que la alpaca tiene un patrón de glicosilaciónque puede variar con tratamientos hormonales de superovulación.

Palabras clave: alpaca, lectinas, patrón de glicosilación, endometrio uterino,superovulación

ABSTRACT

The aim of this study was to determine the glycosylation pattern in the uterineendometrium of alpacas with and without superovulation treatment. Uterine tissueswere obtained from five non-treated alpacas with ovarian follicles less than 4 mm and

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five superovulated alpacas where FSH, GnRH and hCG was used. Samples from theuterus and uterine horns were analyzed by histochemistry (PAS and alcian blue) andlectinhistochemistry techniques. Fourteen lectins were used and PNA, RCA-1, ConA,DBA, WGA, Swga, GS, LCA, SJA and PHA-L showed different glycosilation patterns inthe endometrium between both groups, indicating that the hormonal treatment couldaffect the expression of glycoconjugates that have affinity for these lectins. LectinsPNA, SJA, SBA, ConA, LCA and PSA showed different glycosilation patterns betweenthe two uterine horns, indicating that the glycoconjugates that have affinity for theselectins can be implicated in the uterine environment during the implantation, which inmost cases in the alpaca take place on the left horn. In conclusion, the glycosylationpattern in the alpaca can change due to superovulation hormone therapy.

Key words: alpaca, lectins, glycosylation pattern, endometrium, superovulation

INTRODUCCIÓN

La producción de alpacas en el Perú esde gran importancia socioeconómica (Mon-tes et al., 2008; Quispe et al., 2009). Una desus principales limitantes es la baja tasa depreñez, la cual está directamente relaciona-da con una alta tasa de mortalidad embrionaria(Novoa, 1991), que puede llegar al 50% den-tro de los primeros 35 días de gestación(Fernández-Baca et al., 1970).

Una de las causas de mortalidadembrionaria puede ser la inadecuada implan-tación del blastocisto en el útero, ya que sesabe que durante el proceso de implantaciónse requiere un estrecho contacto entre eltrofoblasto del blastocisto y el glicocáliz delepitelio uterino (Tachi et al., 1970). Whyte yAllen (1985) comprobaron la abundancia deglicanos o polisacáridos, tanto en las superfi-cies uterinas como en las del trofoblasto; ade-más, se sabe que los glicoconjugados partici-pan en varias funciones reproductivas, inclu-yendo el momento de aposición y adhesióndel embrión al útero (Psychoyos, 1986).

En el ratón, cerdo, asno, caballo y ca-mello se conoce que la presencia deglicoconjugados en la interfase materno-fe-tal es de gran importancia, ya que permitiríanlas interacciones entre los componentesplacentarios fetales y maternos, jugando un

rol importante en la implantación y en el man-tenimiento de la gestación (Richa et al., 1985;Cross et al., 1994; Geisert et al., 1995; Joneset al., 2000; Koncurat et al., 2004). Asimis-mo, alteraciones en el patrón de glicosilaciónpodrían afectar el proceso de implantación(García et al., 2007). Intentos fallidos paraobtener híbridos entre dos especies se atri-buyen a una inadecuada formación de lasinterdigitaciones maternales; es decir, el epi-telio uterino no modifica su arquitectura por-que no hay una adecuada estimulación pormedio del embrión ante una falla en la comu-nicación entre ambos tejidos (Jones et al.,2002).

Dentro de los cambios que ocurren enel endometrio uterino, es importante conocerel patrón de glicosilación que se da en el úte-ro de la alpaca, ya que en otras especies sesabe que ciertos cambios son causantes deinfertilidad y podrían estar relacionados aenfermedades reproductivas (Cipolla et al.,1998; Cobo et al., 2004; Sant´Ana et al.,2009). Por otro lado, no se disponen de estu-dios lectinhistoquímicos que permitan com-parar el patrón de glicosilación de una hem-bra sometida a un tratamiento hormonal desuperovulación con una hembra que no lo hayasido, así como el posible efecto en los cam-bios uterinos por las hormonas empleadas enel proceso de superovulación.

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Estudio lectinhistoquímico del útero de alpacas

El presente estudio tuvo por objetivodeterminar, mediante el uso de la técnica delectinhistoquímica, las variaciones en el pa-trón de glicosilación del epitelio uterino enalpacas sometidas a un tratamiento desuperovulación con FSH, GnRH y hCG frentea alpacas no tratadas.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se realizó en los laboratoriosde Fisiología Animal y de Reproducción Ani-mal de la Facultad de Medicina Veterinaria,Universidad Nacional Mayor de San Mar-cos, Lima, Perú. La colección de muestrasse realizó entre los meses de julio a setiem-bre de 2011.

Animales

Se utilizaron 10 alpacas adultas, varie-dad Huacaya, con 6 a 8 años de edad, lascuales habían tenido un promedio de cincopartos previos y se encontraban destinadaspara el consumo. Los animales fueron eva-luados clínicamente, ninguno se encontraba enlactación y por ecografía rectal (EcógrafoAloka SS500, transductor Modo B de 7.5 MHz)se determinó que estaban vacías. Asimismo,su historia clínica indicaba que no habían sidosometidos a tratamientos hormonales.

Tratamientos

Los animales fueron divididos en dosgrupos de cinco animales cada uno.

Sin tratamiento superovulatorio (NSO):Las alpacas fueron sacrificadas en el camalde Ñuñoa, Puno. Se confirmó que los anima-les no estaban gestantes y no presentabancuerpo lúteo o folículos ováricos mayores de4 mm, considerándose que se encontrabanen fase de anestro. Se tomaron muestras enforma inmediata al sacrificio.

Con tratamiento superovulatorio (SO): Losanimales fueron sometidos a un tratamientode superovulación para la obtención deovocitos (Huanca et al., 2009). Se determinóla presencia de folículos 7 mm medianteecografía, momento en el cual se administró1 ml de GnRH (Conceptal, Intervet, Holan-da), equivalente a 0.042 mg de acetato debuserelina, con el fin de inducir la ovulación(día 0 en el tratamiento). El día 2 se realizóecografía para confirmar la ovulación en baseal criterio de la desaparición del folículo pre-viamente observado, administrándose FSH(Folltropin V, Bioniche, Canadá) en dosis dia-ria dividida cada 12 horas por 4 días, con unadosis total de 200 mg por animal. En el día 5se aplicó 1000 UI de gonadotropina coriónicahumana (hCG) (Lutropin V, Bioniche, Cana-dá). El día 6 se realizó una laparatomíaexploratoria para la extracción del tractoreproductivo.

Toma de Muestras y Procesamiento

Se tomaron muestras del tracto repro-ductivo entre aproximadamente 2 cm de laregión media del cuerpo del útero y de la sec-ción media de cada cuerno uterino, y se colo-caron en formol buferado al 10%. Las mues-tras obtenidas fueron reducidas a 0.5 cm deancho por 0.5 cm de largo y fueron procesa-das como muestras histológicas e incluidasen parafina.

Se prepararon cortes de 5 µm de espe-sor que fueron colocados en láminasportaobjetos embebidas en Poly-L-lysina (P8920, Sigma-Aldrich), y sometidas a técni-cas histoquímicas y de lectinhistoquímica(Gretchen et al., 1979; Montuenga et al.,2009).

Estudio Histoquímico

Reacción de Schiff-Acido Peryódico (PAS):Se utilizó para demostrar la presencia depolisacáridos simples y polisacáridos comple-jos neutros. Este método da resultado positi-vo ante la presencia de glucógeno, mucinas ysialomucinas.

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Coloración Azul Alcían con pH 2.5: El gra-do de reactividad de esta técnica varía enfunción del pH del medio, lo cual permite dis-tinguir mucopolisacáridos o polisacáridos áci-dos específicos. Esta coloración se utilizó paradeterminar la presencia de mucinas sulfatadasácidas débiles.

Estudio Lectinhistoquímico

Se utilizaron 14 lectinas biotiniladas delKit I y del Kit II de lectinas de VectorLaboratories (Burlingame, CA, EEUU) y seempleó el método de avidina-biotina. En ladetección y amplificación de las uniones pro-ducidas se utilizó el sistema estreptavidinaperoxidasa, Horseradish peroxidaseStreptavidine-RTU de Vector laboratorios(Burlingame, CA, EEUU) y para el reveladose utilizó el cromógeno 3´3 diaminobenzidinade Vector Laboratories (Burlingame, CA,EEUU). Como control positivo de cada lectinase utilizaron muestras de intestino de ratón yde alpaca, muestras en las cuales seestandarizó la técnica.

Lectura de Láminas

Las láminas trabajadas mediantehistoquímica y lectinhistoquímica se leyeronen un microscopio trinocular de luz incorpo-rada (modelo Primo Star) para exámenes encampo claro en luz transmitida con un ocularWF 10x/20, objetivos de 4x, 10x y 40x, y conuna cámara digital Canon Powershot G9 de12 megapixels montada sobre el microscopioy conectada a una computadora.

Las láminas de PAS (ácido periódico-Schiff) y de azul alcián fueron descritas me-diante su reacción positiva o negativa. En lasmuestras procesadas mediante lectinhis-toquímica se determinó la positividad ante unalectina por la coloración marrón dorado cau-sada por el cromógeno DAB. Asimismo, encada porción estudiada y en cada área se de-terminó la intensidad de marcación como: Au-sencia de marcación (-), Marcación leve (+),Marcación moderada (++), Marcación fuer-te (+++). En casos donde la intensidad demarcación varió dentro de una misma estruc-tura se asignaron los grados extremos (porejemplo, –/+++, indicando que la intensidadde marcación varió entre negativo a fuerte).Los resultados fueron colocados en tablas deresumen explicando lo encontrado para cadalectina en cada porción y estructura.

RESULTADOS

El epitelio que recubre el lumenendometrial era de tipo cilíndrico simple connúcleo circular basal con zonas de inva-ginación que forman las nuevas glándulasendometriales, las cuales fueron más nume-rosas en el grupo SO. Las glándulas que seubican en las zonas más superficiales se en-cuentran más separadas entre sí y presentanlumen glandular de mayor diámetro. El epite-lio glandular es de tipo cilíndrico simple altocon núcleo circular que por lo general se pre-senta en posición basal. A lo largo del estromase encuentran vasos sanguíneos más abun-dantes en el grupo SO.

Cuadro 1. Distribución de áreas de estudio en el cuerpo y cuernos derecho e izquierdo del útero de alpacas

Epitelio luminal

Epitelio glandular Tejido conjuntivo Superficial Intermedio Profundo

C1 GC2 C GC C GC C GC 1 Citoplasma 2 Glicocáliz

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Estudio lectinhistoquímico del útero de alpacas

Figura 1. Estudio histoquímico (Reacción de Schiff-Ácido Peryódico - PAS, Azul Alcián pH2.5 - AA) del útero de la alpaca. a) Coloración PAS, cuerno derecho, alpacasuperovulada; b) Útero, alpaca no superovulada; c) Coloración AA, cuerno derecho,alpaca superovulada; d) Cuerpo uterino, alpaca superovulada

Estudio Histoquímico

PASEn ambos grupos se observó que todas

las estructuras del endometrio fueron PAS+,existiendo mayor intensidad en el glicocálizdel epitelio luminal endometrial y en las zo-nas más profundas y cercanas al tejidoconjuntivo del grupo SO. También se obser-varon en este grupo células aisladas de algu-nas glándulas intermedias fuertemente posi-tivas, principalmente en el cuerno izquierdo(Fig. 1).

Azul Alcián (AB)La marcación con esta coloración fue

similar a la observada con la técnica PAS,marcando todas las estructuras del endometrio

en ambos grupos con una intensidad entredébil a moderada, resaltando la marcación enel glicocáliz del epitelio luminal y de algunaszonas del estroma, siendo mayor en intensi-dad en los tejidos del grupo SO (Fig. 1).

Estudio Lectinhistoquímico

Los resultados obtenidos para cadalectina se presentan en los Cuadros 2 a 4 yen la Fig. 2. Las observaciones más notablesfueron:

PNAEn el cuerpo uterino del grupo SO, el

glicocáliz del epitelio luminal endometrial pre-sentó una marcación más intensa que el gru-po NSO, mientras que en los cuernos uterinos

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Figura 2. Marcación con lectinas en el cuerpo y cuernos uterinos de la alpaca sin tratamiento desuperovulación (NSO) y en alpacas superovuladas (SO). a) Marcación con PNA encuerno uterino izquierdo SO, b) marcación con SBA en cuerno uterino izquierdo SO, c)marcación con RCA-I en cuerpo uterino NSO, d) marcación con ConA en cuernoizquierdo SO, e) marcación con UEA-I en cuerpo uterino SO, f) marcación con DBAen cuerpo uterino SO, g) marcación con WGA en cuerno derecho, h) marcación consWGA en cuerpo uterino NSO, i) marcación con GS en cuerno derecho SO, j) marca-ción con LCA en cuerno derecho SO, k) marcación con PSA en cuerno izquierdoNSO, l) marcación con SJA en cuerpo uterino NSO, m) marcación con PHA-E encuerno izquierdo NSO, n) marcación con PHA-L en cuerno derecho SO, o) marcacióncon PHA-L en cuerpo uterino SO. GS: glándulas superficiales, GI: glándulas interme-dias, GAEL: glicocáliz apical de epitelio luminal

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Estudio lectinhistoquímico del útero de alpacas

Cuadro 2. Estudio lectinhistoquímico del epitelio del cuerpo uterino de alpacas no superovuladas (NSO) y bajo tratamiento superovulatorio (SO)

Lecitina G1 Epitelio luminal Epitelio glandular

Tejido conjuntivo

Superficial Intermedio Profundo GA2 C3 GA C GA C GA C

PNA NSO -/+ - ++/+++ -/+ ++ +/++ + -/+ - SO ++/+++ +/++ ++/+++ +/++ ++ +/++ + -/++ -/+ SBA NSO ++/+++ +/++ +++ +/++ ++/+++ +/++ ++ +/++ - SO ++/+++ ++ ++/+++ +/++ ++/+++ +/++ - - - RCA-1 NSO +/++ + +/++ -/+ +/++ -/+ +/++ + + SO ++ + ++ + +/++ + +/++ + + Con A NSO ++/+++ ++ ++ + + + + -/+ + SO ++ +/++ + -/+ -/+ -/+ - -/+ + UEA-I NSO - - - - - - - - - SO - - - - - - - - - DBA NSO -/+++ -/++ -/+++ -/++ - - - - - SO -/++ -/++ -/++ -/++ - - - - - WGA NSO +/++ + ++ + -/+ -/+ -/+ + + SO ++ + -/+ - -/+ -/+ -/+ - + sWGA NSO -/++ - -/++ -/+ -/+++ -/++ -/+ - -/+ SO ++/+++ - -/++ -/+ -/+++ - -/+ - -/+ GS NSO +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ -/+ SO +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + LCA NSO ++ ++ ++ + ++ + ++ + ++ SO +++ ++ +++ ++ + + + + ++ PSA NSO ++ ++ ++ + ++ + ++ + ++/+++ SO ++/+++ +/++ ++ + ++ + + -/+ ++/+++ SJA NSO - - + -/+ + - - - -/+ SO -/+++ - -/+++ - -/+++ - - - -/+ PHA-E NSO ++/+++ + ++ + ++ + + -/+ +++ SO ++/+++ +/++ ++ + ++ + ++ + +++ PHA-L NSO ++/+++ ++ +++ + +++ ++ +++ ++ -/+ SO +++ ++ +++ +/++ +++ ++ +++ ++ -/+ 1 Grupo 2 Glicocáliz apical 3 Citoplasma

la marcación fue similar a la observada en elgrupo NSO.

SBALa marcación a nivel de citoplasma es

muy similar a la lectina PNA, siendo mayor-mente de tipo moderada. En las glándulassuperficiales los gránulos predominan en lazona apical del citoplasma, mientras que lasintermedias y profundas comienzan a dismi-

nuir, al igual que en la zona glandular, dismi-nuyendo la marcación hacia las glándulas pro-fundas.

RCA-IEl glicocáliz del epitelio luminal del cuer-

po uterino tuvo una marcación débil a mode-rada en NSO y moderada en SO; mientrasque el glicocáliz a nivel de glándulas es dedébil a moderado en ambos grupos. El cito-

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Cuadro 3. Estudio lectinhistoquímico del epitelio del cuerno uterino derecho de alpacas no superovuladas (NSO) y bajo tratamiento superovulatorio (SO)

Lecitina G1 Epitelio luminal Epitelio glandular Tejido conjuntivo Superficial Intermedio Profundo

GA2 C3 GA C GA C GA C PNA NSO -/+ -/++ ++/+++ -/+ ++/+++ +/++ + -/++ -/+ SO -/++ +/++ ++/+++ +/++ ++/+++ +/++ + -/+ -/+ SBA NSO -/++ +/++ ++/+++ +/++ ++/+++ +/++ ++ -/++ - SO +++ -/+ ++/+++ ++ ++ ++ ++ -/+ -/+ RCA-1 NSO ++/+++ +/++ ++ -/+ + -/+ +/++ -/+ +/++ SO ++/+++ -/+ +/++ -/+ + -/+ + - + Con A NSO ++ +/++ -/+ -/+ -/+ + -/+ -/+ + SO ++/+++ ++ + + + -/+ -/+ -/+ + UEA-I NSO - - - - - - - - - SO - - - - - - - - - DBA NSO -/++ -/++ -/++ -/++ - - - - - SO -/++ -/++ -/++ -/++ - - - - - WGA NSO ++/+++ ++ ++ + +/++ -/+ +/++ -/+ ++ SO ++ +/++ +/++ -/+ + - + -/+ +/++ sWGA NSO - - ++/+++ -/+ ++/+++ -/+ - - - SO +/++ - -/++ - -/++ - - - - GS NSO +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + SO +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ + LCA NSO ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ SO +++ ++ ++ ++ ++ + ++ + ++ PSA NSO ++/+++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ SO ++/+++ ++ ++ ++ ++ + ++ + ++ SJA NSO - - -/+ - -/+ - - - - SO ++/+++ - ++/+++ - -/+ - - - - PHA-E NSO +++ + ++ -/+ ++ + ++ + +++ SO +++ +/++ ++ + ++ + + + +++ PHA-L NSO +++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ -/+ SO ++/+++ ++ +++ +/++ ++ ++ ++ ++ -/+ 1 Grupo 2 Glicocáliz apical 3 Citoplasma

plasma presenta una marcación débil en to-dos los epitelios y con un patrón difuso; reac-cionando mayormente en la zona apical delcitoplasma. En NSO hay células de las glán-dulas superficiales e intermedias sin marca-ción. La marcación es mayor en NSO queen SO en el glicocáliz del epitelio luminal y enel citoplasma del cuerno izquierdo; sin em-bargo, la marcación a nivel de glándulas novaría entre ambos grupos. En el cuerno de-recho la marcación en citoplasma es más

evidente e intensa en el grupo NSO pero anivel glándular es similar a la observada en elcuerno izquierdo.

Con ALa marcación es más intensa en el cuer-

po uterino en NSO. El glicocáliz presentamarcación fuerte en epitelio luminal y demoderado a débil en las glándulas, mientrasque en SO la marcación del glicocáliz delepitelio luminal es moderada y en glándulas

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Estudio lectinhistoquímico del útero de alpacas

es débil, desapareciendo conforme las glán-dulas se van haciendo más profundas. En elcitoplasma de las glándulas la marcación esescasa y débil en NSO, mientras solo ocurreen algunas células en SO. El patrón de unióna esta lectina es similar para ambos gruposen el cuerno izquierdo, mientras que a niveldel epitelio luminal del cuerno derecho es másintensa en SO.

UEA-INo se detectaron sitios de unión a esta

lectina.

DBAEl patrón de marcación de esta lectina

se repite en cuerpo y cuernos uterinos deambos grupos, aunque en mayor número enNSO. No se observaron sitios de unión englándulas profundas e intermedias, mientras

Cuadro 4. Estudio lectinhistoquímico del epitelio del cuerno izquierdo de alpacas no superovuladas (NSO) y bajo tratamiento superovulatorio (SO)

Lecitina G1 Epitelio luminal Epitelio glandular Tejido

conjuntivo Superficial Intermedio Profundo GA2 C3 GA C GA C GA C

PNA NSO -/++ -/+ +++ -/+ ++/+++ +/++ +/++ -/++ -/+ SO ++ +/++ ++ +/++ +/++ +/++ +/++ + -/++ SBA NSO ++/+++ +/++ +++ ++ ++/+++ +/++ +/++ + - SO ++/+++ ++ ++/+++ ++ ++/+++ ++ + + - RCA-1 NSO +++ +/++ +/++ -/+ + -/+ + - +/++ SO ++ -/++ +/++ + + -/+ +/++ -/+ +/++ Con A NSO +++ ++ + + + + + -/+ + SO ++ ++ + + + + + + + UEA-I NSO - - - - - - - - - SO - - - - - - - - - DBA NSO -/++ -/+ -/+++ -/++ - - - - - SO -/++ -/++ -/++ -/+ - - - - - WGA NSO ++/+++ +/++ +/++ + + -/+ + -/+ + SO ++ + +/++ - + + +/++ -/+ +/++ sWGA NSO - - -/++ - -/+++ - - - -/+ SO -/+++ - -/++ - -/+++ - -/+ - -/+ GS NSO +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + SO +++ ++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ + LCA NSO ++ ++ ++ ++ ++ + ++ + ++ SO ++ + ++ + + + + + + PSA NSO ++ + ++ +/++ + + + -/+ - SO ++/+++ + +/++ ++ + + + - ++ SJA NSO - - -/+ - -/+ - - - - SO - - -/+ - -/+ - - - - PHA-E NSO +++ + ++ + +/++ + + -/+ ++/+++ SO ++ + +/++ + ++ + + + +++ PHA-L NSO ++ +/++ ++/+++ +/++ ++/+++ +/++ ++/+++ -/+ -/+ SO +++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ +/++ 1 Grupo 2 Glicocáliz apical 3 Citoplasma

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que en el epitelio luminal y en glándulas su-perficiales pocas células reaccionan con estalectina.

WGAEl estroma del cuerpo uterino reaccio-

na débilmente con esta lectina, mientras queen los cuernos uterinos marca débilmente enNSO y entre débil a moderado en SO. Elglicocáliz se une de manera débil a modera-da en epitelio luminal y glándulas superficia-les, tornándose negativa conforme las glán-dulas se profundizan. La marcación en epite-lio luminal es similar en ambos grupos. En elcuerno derecho, la marcación es moderadaen ambos grupos a nivel de epitelio luminal,mientras que es mayor en NSO a nivel deglándulas. En el cuerno izquierdo la marca-ción es más intensa a nivel del epitelio luminalen NSO, mientras que en NSO la unión delglicocáliz del epitelio glandular a esta lectinaes débil y el citoplasma presenta algunas zo-nas que marcan débilmente; asimismo, elglicocáliz de las células glandulares en SOpresenta una marcación entre débil y mode-rada, mientras que el citoplasma se presentanegativo en las glándulas superficiales y enalgunas células de las glándulas profundas.

sWGAEsta lectina presenta un patrón de unión

singular, pues hay alternancia de células mar-cadas y no marcadas en glándulas; asimis-mo, el glicocáliz se presenta como una capamuy fina. En NSO, el glicocáliz varía de ne-gativo a moderada o fuerte en glándulas,mientras que el citoplasma varía de negativoa moderado, siendo esta marcación similar alo observado en SO. Los cuernos uterinos deNSO no presentan marcación en epitelioluminal pero es de moderada a fuerte en glán-dulas.

GS-1El patrón de marcación en ambos gru-

pos fue muy similar. En los tres tejidos deambos grupos se observó una marcaciónmoderada con gránulos en todo el citoplas-ma, tanto a nivel de células glandulares comodel epitelio luminal del endometrio; mientrasque a nivel del estroma, esta lectina reaccio-

na débilmente, observándose zonas negati-vas. En el caso de las glándulas, el citoplas-ma se une de manera moderada a esta lectina;y en el caso del glicocáliz, la intensidad esmayor en el cuerpo uterino del NSO y menoren los cuernos uterinos en comparación conSO.

LCAEn el caso de NSO, la unión de esta

lectina al glicocáliz del epitelio luminal esmoderada, así como en el citoplasma a nivelde la zona apical donde se logran distinguirmayor cantidad de gránulos. En el caso deSO, el epitelio luminal del endometrio del cuer-po uterino y cuerno derecho presenta unglicocáliz y citoplasma con marcación fuertey moderada, respectivamente.

PSALa marcación es moderada en los tres

tejidos de ambos grupos a nivel de epitelioluminal, aunque la marcación es más intensaen SO. A nivel del citoplasma, la marcaciónes moderada en cuerno derecho y cuerpouterino, perdiéndose la intensidad en el cuer-no izquierdo de ambos grupos. La marcaciónes de moderada en glicocáliz y débil en cito-plasma en las glándulas del cuerpo uterino deambos grupos. La marcación tiende a ser másintensa en las estructuras que componen lasglándulas del cuerno derecho y del cuerpouterino en NSO, mientras que el epitelio glan-dular presenta marcación de menor intensi-dad en el cuerno izquierdo.

SJAEl citoplasma de las células del epitelio

luminal y glandular del tejido endometrial nose unió a esta lectina, a excepción de algunasglándulas superficiales e intermedias dondehubo marcación débil. En los tres tejidos deNSO, el glicocáliz presenta marcación débilpero no uniforme a nivel de las glándulas su-perficiales e intermedias, y negativo a nivelde glicocáliz de epitelio luminal endometrial yde glándulas profunda; en cambio, en el cuer-no derecho y cuerpo uterino de SO, se ob-serva marcación más intensa en el glicocálizde glándulas superficiales e intermedias, aun-

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Estudio lectinhistoquímico del útero de alpacas

que sigue siendo negativo en glándulas pro-fundas.

PHA-EEl estroma se marca fuertemente en

todos los casos y es similar entre ambos gru-pos. La unión a esta lectina en el cuerpo ute-rino es entre moderada y fuerte, mientras queen las glándulas, la marcación en glicocálizes moderada y en citoplasma es débil. Estepatrón se repite en el cuerno derecho, siendomás intensa la marcación en algunas estruc-turas de SO. En el cuerno izquierdo, el pa-trón es similar entre ambos grupos, aunque anivel del epitelio luminal y glandular la inten-sidad se pierde ligeramente en SO.

PHA-LEl patrón de marcación de esta lectina

es similar en el cuerno derecho y cuerpo ute-rino, presentando marcación moderada afuerte en glicocáliz de epitelio luminalendometrial y de epitelio glandular. En el cuer-no derecho de SO hay una disminución en lamarcación a nivel del glicocáliz de las glán-dulas intermedias y profundas y del epitelioluminal; mientras que a nivel del citoplasmala marcación es moderada y de maneragranular en todos los casos. Asimismo, en estegrupo hay una disminución en la intensidadde la marcación a nivel del glicocáliz del epi-telio de glándulas intermedias y profundas delcuerno izquierdo; siendo lo contrario a niveldel glicocáliz del epitelio luminal endometrialy de las glándulas superficiales y del citoplas-ma. La marcación en estroma es débil y enalgunas zonas del endometrio en los tres teji-dos de ambos grupos.

DISCUSIÓN

La reacción PAS positiva encontrada entodos los tejidos de ambos grupos indica lapresencia de glicopolisacáridos neutros, y elazul alcián positivo de pH ácido 2.5 indica lapresencia de mucinas sulfatadas ácidas dé-biles (mayor parte de mucinas), coincidiendocon resultados de otros estudios (Walter y

Bavdek,1997; Schencke et al., 2004; Sanchiset al., 2009). La mayor intensidad de marca-ción mostrada en ambas técnicas en tejidosdel grupo SO podría evidenciar una mayoractividad secretora del tejido endometrial,producto de las hormonas utilizadas en lasuperovulación.

La marcación con la lectina PNA encuerpo uterino y cuerno derecho a nivel deepitelio luminal endometrial en NSO es simi-lar a la encontrada por Munson et al. (1989)en tejido uterino de vacas no preñadas en faseluteal; mientras que la unión al epitelio luminalendometrial de los tres tejidos en SO y encuerno izquierdo en NSO es similar a resul-tados en útero de mujeres sometidas a un tra-tamiento de superovulación con FHS y hCGy en mujeres que no tuvieron ninguna terapiahormonal y que no estaban gestantes (Gheriet al., 1998).

La marcación de la lectina SBA a nivelde glicocáliz del epitelio luminal y epitelio glan-dular de cuerno izquierdo y útero de ambosgrupos de alpacas, así como en el cuerno deSO es similar a la encontrada en útero decerdas en estro y metaestro, de perras enanestro y de mujeres sometidas a un trata-miento de superovulación (Zhou et al., 1994;Gheri et al., 1998; Leitner et al., 2003;Sant´Ana et al., 2009). Asimismo, la diferen-cia detectada en la marcación a nivel delglicocáliz del epitelio luminal endometrial delcuerno derecho de NSO es igual a la detec-tada en útero de perras con piometra y enaquellas en fase tardía de metaestro (Leitneret al., 2003).

No hay mucha diferencia en la marca-ción con la lectina RCA-1 entre ambos gru-pos de alpacas. Estos resultados se aseme-jan a aquellos en cerdas en fase luteal y fasefolicular, e inclusive en útero de cerdas conhiperplasia endometrial quística y conendometritis (Sant´Ana et al., 2009). En mu-jeres se puede observar un efecto del trata-miento de superovulación en la unión de lalectina ConA, ya que presentan gránuloscitoplasmáticos en el epitelio glandular y en

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epitelio luminal endometrial, mientras que enmujeres no tratadas no se observan en esteúltimo tipo de células (Gheri et al., 1998).

Los hallazgos en la marcación de lalectina UEA-1 son iguales a los encontradospor Munson et al. (1989) en vacas con másde 80 días de gestación, por Gheri et al. (1998)en mujeres sin tratamiento hormonal previo,por Lee et al. (1983) en ratas no preñadas ypor Leitner et al. (2003) en perras enmetaestro temprano. Gheri et al. (1998) en-contraron en 3 de 12 mujeres sometidas a untratamiento de superovulación una unión dé-bil a esta lectina a nivel de glicocáliz del epi-telio luminal endometrial y unión moderada anivel del citoplasma células de algunas glán-dulas. Marcación similar se presenta en co-nejas en estro y pseudopreñez, aunque conun patrón no uniforme (Anderson et al.,1986).

En ninguna especie se encontró un pa-trón de marcación similar con la lectina DBAal de los tres tejidos de ambos grupos(Munson et al., 1989; Gheri et al., 1998;Sant´Ana et al., 2009), aunque se presentó anivel de células linfoides en estroma uterinode vaca (Munson et al., 1989). Se sabe queel glicoconjugado de unión a la lectina DBA(-D-GalNac) posee propiedades deantiadhesividad, de allí que se le encuentreen muy escasa cantidad en el cuerpo y cuer-nos uterinos de la alpaca (Hoffman et al.,1998), y que, asimismo, las hormonas utiliza-das en la superovulación disminuyen la ex-presión de este azúcar en estas estructuras,dado que los sitios de unión a esta lectina fue-ron más escasos en SO comparados conNSO.

La lectina WGA tiene afinidad por N-acetil-glucosamina y ácido siálico, mientrasque su derivado succinilado sWGA se uneespecíficamente a N-acetilglucosamina y asus oligómeros (Monsigny et al., 1979). Eneste estudio, la falta de unión de sWGA enlas zonas donde se presentó marcación a lalectina WGA sostiene la presencia de ácidosiálico a ese nivel (Anderson et al., 1986), el

cual se cree está presente como parte es-tructural. La N-acetil-glucosamina está rela-cionada con el ácido hialurónico, el cual par-ticipa en la migración celular, y que podríaactuar en las células epiteliales que pasarána formar las nuevas glándulas uterinas(Alberts et al., 1989).

Munson et al. (1989) encontraron quela marcación con la lectina LCA en vacas enfase luteal es débil a nivel del glicocáliz delepitelio luminal endometrial y del glandular,pero moderada a nivel del citoplasma del epi-telio luminal endometrial. Asimismo, en úterode ratas vírgenes de 6-8 semanas de edad nohubo unión con esta lectina a nivel de ningúnepitelio y solo a nivel del estroma (Lee et al.,1983) como en el presente estudio. Jones etal. (2002) presentan resultados similares enmuestras de placenta de alpacas en gesta-ción temprana y avanzada.

El patrón de unión de PHA-E encon-trado en alpacas difiere del que se presentaen vacas en fase luteal donde la marcaciónes débil a nivel epitelio luminal endometrial yglandular (Munson et al., 1989), así como enratas de 6-8 semanas de edad no gestantesque presentan unión débil en algunas zonasdel glicocáliz, tanto del epitelio luminalendometrial como del glandular (Lee et al.,1983).

La lectina PHA-L se une débilmente anivel de todo el endometrio en ratas nogestantes y en ratas con 12 días de gestación(Lee et al., 1983). La marcación es muy dé-bil en la gestación temprana de la alpaca y sehace negativa en la gestación tardía (Joneset al., 2002).

Si bien no se conoce el rol que ejercenlos glicoconjugados que se unen a las lectinas,la determinación de patrones de glicosilaciónpara las lectinas PNA, RCA-I, Con A, DBA,WGA, sWGA, GS, LCA, SJA y PHA-L, don-de se observaron diferencias entre grupos,sugiere que el tratamiento hormonal influencióen la expresión de los glicoconjugados que seunen a estas lectinas; a través del efecto de

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Estudio lectinhistoquímico del útero de alpacas

la FSH, GnRH y hCG así como el del estró-geno proveniente de los folículos generadospor el tratamiento de superovulación sobre laproliferación del tejido endometrial; como seha comprobado en estudios previos en ma-míferos (Anderson et al., 1986; Pentecost yTeng, 1987; Gheri et al., 1998; Leitner et al.,2003).

Las lectinas SBA, RCA-I, UEA, DBA,WGA, sWGA, GS, PHA-E y PHA-L pre-sentan patrones de marcación similares paraambos cuernos y entre ambos grupos. Lasdiferencias en el patrón de marcación de lalectina PNA y SJA entre el cuerno derecho yel izquierdo serían como resultado del cam-bio hormonal generado por el tratamiento desuperovulación; mientras que las diferenciaspor la lectina Con A entre ambos cuernosocurren solamente en NSO. Las lectinasLCA, PSA presentan un patrón de marca-ción diferente entre el cuerno derecho y elcuerno izquierdo en ambos grupos, lo quepodría sugerir algún rol en el porcentaje mayo-ritario de gestaciones en el cuerno izquierdo.

La marcación de células linfoides conlas lectinas SJA, GS, y DBA en cuerpo uteri-no y cuernos uterinos de la alpaca es un ha-llazgo normalmente presente en el tejido ute-rino de otras especies y ocurre porque lamucosa del tracto reproductor femenino estánormalmente expuesta a microorganismospatógenos (Munson et al., 1989; Del Rey,1992). En el presente trabajo se observómayor cantidad de células inmunológicas enel endometrio de cuerpo y cuernos uterinosde alpacas SO, lo cual concuerda con otrasobservaciones en útero de ratones, donde secomprobó la influencia de las hormonassexuales en el aumento de la población decélulas inmunológicas a nivel del endometriouterino (Wira y Stern, 1992).

CONCLUSIONES

El patrón de glicosilación en elendometrio del cuerpo y cuernos uterinoses diferente, especialmente a nivel de

cuerno izquierdo, lo que podría determi-nar que la implantación en la alpaca ocu-rra mayormente a este nivel.

El tratamiento hormonal utilizado en elproceso de superovulación al que fue-ron sometidas las alpacas alteró el pa-trón de glicosilación tanto en el cuerpocomo en los cuernos uterinos.

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